Identificação de Bactérias

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Procedimento:
Preparar uma suspensão bacteriana densa a partir da cultura recente;
Separar dois tubos de ensaio , marcar um com “C” (tubo controle) e outro com “T” (tubo teste);
Adicionar solução de desoxicolato de sódio a 2% ao tubo “T” e solução salina a 0,85% ao tubo “C”. 
Adicionar a cada tubo o mesmo volume, por exemplo, 0,5 mL da suspensão bacteriana;
Homogeneizar e fazer a leitura imediatamente, após 1 h e até 2 h de incubação a 35±2ºC.
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Diferenciação dos Streptococcus agalactiae e S.pyogenes
A identificação de espécies de Streptococcus β- hemolítico pode ser realizados pela prova de aglutinação com soro específico contra os antígenos de Lancefield (A,B,C,D,F e G). Esta é uma prova rápida, porém de alto custo.
Teste de CAMP: O teste visa a identificação de cepas de S. agalactiae (grupo B). Estas cepas produzem o fator CAMP (Christie, Atkins e Munch-Petersen) que atua sinergicamente com a β-hemolisina produzida pelo Staphylococcus aureus em ágar sangue.
Positivo: A formação de uma seta ou meia-lua convergindo para o S.aureus na intersecção do crescimento das duas bactérias indica que o teste é positivo 
Negativo: Se não houver formação de seta ou meia-lua, o teste é negativo e a cepa não pertence ao grupo B de Lancefield.
Procedimento: 
Semear  Staphylococcus aureus ATCC 25923 de um ponto a outro da placa de ágar sangue;
Semear perpendicularmente (90°) a colônia de Streptococcus β-hemolítico a ser testada, sem que haja o contato com a estria de Staphylococcus aureus;
Incubar a 35±2ºC em atmosfera de 5% de CO2 por 48 h
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Teste de PYR: determina a atividade da enzima pyrrolidonil aminopeptidase produzida pelo S. pyogenes. Colônias β-hemolíticas de Enterococcus podem ser confundidas com S. pyogenes, pois ambas apresentam positividade neste teste.
Positivo: Apresenta o desenvolvimento de cor vermelha;
Negativo: Coloração amarela ou alaranjada 
Procedimento:
Com auxílio de uma pinça, colocar um disco de PYR sobre uma lâmina ou placa de Petri vazia;
Pingar uma gota de água destilada estéril ;
Realizar um esfregaço com a bactéria a ser testada, recém-isolada, sobre o disco de PYR umedecido;
Aguardar alguns minutos e colocar uma gota do reagente PYR. 
PYR
Neg.
Pos.
Obs.: O Teste de Hidrólise de hipurato, que forma glicina e ácido benzoico, pode ser usado para identificação de S. agalactiae, tem o mesmo valor que o teste de CAMP. 
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Teste de Bacitracina: O teste tem a finalidade de diferenciar S. pyogenes de outras cepas do grupo A ou de outras espécies com colônias β-hemolíticas PYR positivas.
Positivo: A presença de qualquer halo de inibição ao redor do disco é interpretado como sensibilidade a bacitracina e indicativo de S. pyogenes.
Procedimento:
Colocar um disco de 0,04 U de bacitracina em uma placa de ágar sangue de carneiro que tenha um inóculo com 4 ou 5 colônias puras de Streptococcus spp. a ser testado.
Incubar 12 horas (overnight) a 35± 2ºC
Teste de Bile esculina: A prova de Bile-Esculina é baseada na capacidade de algumas bactérias hidrolisarem esculina em presença de bílis.
Positivo: formação um complexo negro, Enterococcus e dos S. do grupo D. Os S. pyogenes são negativos
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Diferenciação dos Enterococcus, Streptococcus do grupo D e Outros Streptococcus
Todos os Enterococcus sp. e os Streptococcus do grupo D (S. bovis) são positivos no teste de bile esculina os outros são negativos.
Teste de crescimento em NaCl 6,5%: Capacidade do microrganismo crescer em altas concentrações de sal. Tem por finalidade diferenciar Enterococcus spp. de Streptococcus spp.
Positivo: A turvação ou mudança de cor do meio indica o crescimento de bactérias Enterococcus
Procedimento:
Inocular 2 a 3 colônias a serem testadas em um caldo BHI suplementado com 6,5% de NaCl ;
Incubam-se a 35±2ºC por até 72 h.
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Teste de motilidade: indica indiretamente a produção de flagelos. A prova é efetuada inoculando-se em linha reta, através da técnica da punctura (com agulha), 2/3 de um meio semi-sólido. 
Positivo: quando os microrganismos crescem deslocando-se da linha de inoculação, turvando o meio.
Negativa: quando os microrganismos ficam restritos ao local da inoculação sem, contudo, turvar o meio.
Teste de carboidrato: Existem diversos testes convencionais que levam à identificação das espécies de Enterococcus e gêneros relacionados, dentre eles a detecção da produção de ácido a partir de diferentes carboidratos: arabinose , sorbitol. 
Positivo: O meio mudar de cor indicando a presença de ácidos 
Negativo: O meio permanece na cor natural
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 RESULTADOS DOS TESTE PARA ENTEROBACTERIAS
MEIO DE EPM (ágar inclinado verde): Permite a leitura das provas do LTD, Glicose, Gás e H2S. 
O LTD (desaminação doL-Triptofano) é evidenciado pelo desenvolvimento de cor verde-garrafa no ápice do tubo.
A leitura da Glicose é feita pela observação de coloração amarela na base do tubo, com ou sem produção de gás, evidenciado pela ruptura do meio ou a formação de bolhas. 
3. A produção de gás sulfídrico é verificada pelo aparecimento de cor negra.
CALDO LISINA (caldo púrpura) : Permite a leitura da reação de descarboxilação da L-Lisina. 
A cor amarela brilhante revela uma reação negativa e qualquer cor diferente de amarelo é considerado positivo.
CALDO RHANMOSE: Usa este açúcar no metabolismo 
Amarelo: positivo
Verde: negativo
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MEIO DE MIO (meio semi-sólido púrpura): Permite a leitura das provas de Motilidade, descarboxilação da Ornitina e produção de Indol. 
 1. A motilidade é observada pela turvação do meio, enquanto se houver crescimento somente na picada a prova é considerada negativa. 
 2. A interpretação da Ornitina é semelhante à da Lisina, ou seja, cor amarela indica prova negativa e qualquer outra cor é considerada positiva. 
 3. O Indol é revelado pelo acréscimo de algumas gotas do reativo de Kovacs após incubação de 24 horas: a formação de anel de cor vermelha significa que houve a produção de Indol, portanto a prova é positiva.
ÁGAR CITRATO DE SIMMONS (ágar inclinado verde): Responsável pela leitura da prova de utilização do citrato como única fonte de Carbono. 
 Meio de cor original verde, tornando – se azul em caso de prova positiva e permanecendo verde para provas negativas.
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Coloração de Gram
Teste: Verificar a morfologia e a coloração no teste de gram.
Positivo: BacilosGram negativos. Células na forma de bastões e de cor vermelha. 
Prova de OF: Utilizado para a diferenciação de bacilos Gram-negativos quanto à capacidade de utilizar os carboidratos pela via oxidativa ou fermentativa.
Procedimento: São necessários dois tubos para a prova. 
Com o fio bacteriológico inocula-se uma colônia a ser pesquisada.
Colocar esterilmente em um dos tubos 0,5 mL de óleo mineral estéril.
Incubar em estufa bacteriológica a 35° C por 18 a 24 horas.
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Prova de oxidase: O teste de oxidase é baseado na produção de uma enzima oxidase intracelular pela bactéria. As bactérias que possuem atividade de citocromo-oxidase (oxidase positiva) provocam uma oxidação rápida do reativo. 
Positivo: desenvolve coloração púrpura intenso. 
Negativo: Não há mudanças de cor.
Esta prova é muito útil para diferenciar as Enterobactérias (oxidase-negativas) das Pseudomonas spp. (oxidase-positivas). 
Bacilos Gram negativos fermentadores de glicose com oxidase negativa, prediz Enterobactéria. 
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Meio MacConkey: A morfologia das colônias constitui uma informação importante, orientando muitas vezes o diagnóstico. 
Este meio contém vermelho-neutro como indicador de pH e, como resultado, as colônias que metabolizam lactose aparecem em vermelho a partir da produção de ácidos mistos. As bactérias produtoras de ácidos fortes, como Escherichia coli, formam colônias vermelho-escuro. As bactérias produtoras de ácidos fracos formam colônias rosa-pálido ou colônias que são claras na periferia e têm o centro rosado.
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Provas IMViC (Indol, Vermelho de Metila, Voges-Proskauer, Citrato)
Esta série de quatro provas permite diferenciar os principais grupos de Enterobacteriaceae:
Indol: Determina a habilidade do microrganismo de metabolizar o triptofano em indol. Triptofano é um aminoácido que pode ser oxidado por certas bactérias resultando na produção de indol, após a adição de reagentes de Erlich ou Kovacs.
Procedimento: Após a incubação adicionar 5 gotas ou até formar um anel, do reativo de Kovacs pela parede do tubo com crescimento bacteriológico, fazer a leitura.
Positivo: formação de um anel cor-de-rosa na superfície do meio.
Negativo: há acúmulo de reativo amarelo na superfície do meio.
Vermelho de Metila (VM): Meio utilizado para avaliar a via fermentativa de utilização da glicose pelas enterobactérias
Procedimento: Após a incubação da cultura, adicionar 0,2mL ou 5 gotas do indicador pela parede do tubo (sem agitar), que formará um anel acima da cultura.
Positivo : coloração vermelha
Negativo: coloração amarela ou acastanhada
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Prova do VP: Meio utilizado para avaliar a via fermentativa de utilização da glicose 
Procedimento: Após a incubação da cultura, adicionar 0,6 mL de BARRITT I ao caldo. A seguir adicionar 0,2 mL de BARRITT II e agitar vigorosamente por aproximadamente 3 minutos. Depois de decorrido pelo menos 5 minutos, verificar a coloração do caldo.
Positivo : coloração rósea, tijolo ou vermelha
Negativo : coloração amarela ou acastanhada
Prova de Citrato: Verifica a capacidade da bactéria de utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono, juntamente com sais de amônia, alcalinizando o meio, o indicador é o azul de bromotimol.
 
Procedimento: Inocular a bactéria fazendo estrias apenas na superfície inclinada do meio. Incubar em estufa bacteriológica a 37ºC por 18 a 24 horas.
Positivo : cor azul ou crescimento no local do inóculo.
Negativo: não há crescimento e a cor permanece inalterada.
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Teste de Ornitina: Usado para verificar a descarboxilação dos aminoácidos arginina, ornitina e lisina. Usado para diferenciar Enterobacter de Klebsiella. 
Após preparo o meio apresenta coloração lilás.
Positiva: desenvolve a cor roxa intenso
Negativo: desenvolve a cor amarela
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Meio de Rugai & Araújo modificado por Pessoa & Silva ou meio IAL: Atualmente conhecido como IAL (Meio Instituto Adolfo Lutz) foi inicialmente proposto por Rugai & Araújo, com a intenção de eliminar as falhas existentes nos meios similares, até então usados.
Interpretação
Fase Superior
Ápice:
azul: sacarose negativa LTD negativo
Amarelo: sacarose positiva LTD negativo
verde garrafa: sacarose negativa LTD positivo
castanho: sacarose positiva LTD positivo
Base:
amarelo: glicose positiva
Base: amarelo: glicose positiva
Azul: uréia positiva
Preto: H2S positivo
amarelo com bolhas : glicose e gás positivos
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Teste de indol na rolha:
Após a incubação pingar assepticamente, 2 à 3 gotas do reativo de Ehrlich para indol na rolha do algodão hidrófilo.
Indol positivo: algodão fica rosa ou vermelho
Indol negativo: algodão permanece sem cor ou com coloração amarelo.
Fase Inferior:
violeta : lisina descarboxilase positiva
Amarelo : lisina descarboxilase negativa
com turvação : motilidade positiva (móvel)
sem turvação : motilidade negativa se observa nitidamente o crescimento
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Testes comerciais
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Bacilos Gram-negativos não fermentadores (BGN-NF) 
Espécies de interesse Clinico: Pseudomonas e Acinetobacter.
Pseudomonas 
Acinetobacter 
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