fungos e leveduras TRAB PRONTO!!!

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INSTITUTO SENAI DE TECNOLOGIA COURO E MEIO AMBIENTE
ESCOLA DE EDUCAÇÃO PROFISSIONAL SENAI CURTIMENTO
CURSO TÉNICO EM QUÍMICA
CLADES DINIZ
DJENNIFER GRADE
GABRIELA DA SILVA
JÉSSICA DAPPER
Preparação de meios de cultura
Estância Velha, RS
2017
CLADES DINIZ
DJENNIFER GRADE
GABRIELA DA SILVA
JÉSSICA DAPPER
Preparação de meios de cultura
	
	Relatório de aula prática apresentado à Unidade Curricular de Análises Microbiológicas ao curso Técnico em Química da Escola de Educação Profissional SENAI Curtimento, sob orientação do(a) Instrutor(a) Horst Mitteregger Júnior para fins de avaliação da turma 603.
SUMÁRIO
1. Introdução	4
2. Objetivo	4
2.1 OBJETIVO Geral	4
2.2 Objetivos Específicos	4
3. MATERIAIS E EQUIPAMENTOS	4
3.1 MATERIAIS	4
3.2 Equipamentos	5
4. Procedimentos	5
4.1 PROCEDIMENTOS DE PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA	5
4.1.1 FLUXOGRAMA DO PROCEDIMENTO DE PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA	6
4.2 PROCEDIMENTOS DE CONTAMINAÇÃO NO MEIO DE CULTURA	6
4.2.1 FLUXOGRAMA DOS PROCEDIMENTOS DE CONTAMINAÇÃO DO MEIO DE CULTURA	7
4.3 PROCEDIMENTO DE contagem de bolores e leveduras	8
4.3.1 FLUXOGRAMA DO PROCEDIMENTO DE contagem de bolores e leveduras	8
5. AVALIAÇÃO DE BOLORES E LEVEDURAS EM PROCESSOS INDUSTRIAIS	8
5.1 AVALIAÇÃO DE BOLORES E LEVEDURAS EM IOGURTE	8
5.2 DIFERENTES TESTES QUE PODEM SER REALIZADOS COM O MEIO DE CULTURA BDA	9
6. RESULTADOS	9
6.1 RESULTADOS PLACA 1 ( 10-2)	9
6.2 RESULTADOS PLACA 2 (10-2)	10
6.3 RESULTADOS PLACA 3 (10-1)	11
6.4 RESULTADOS PLACA 4 (10-1)	11
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAs	12
1. Introdução
	
No dia 13 de novembro fomos ao laboratório de microbiologia preparar o meio de cultura ágar batata glicose (BDA) para análise de fungos e leveduras em copos plásticos.
No dia 20 de novembro fomos ao laboratório de química contaminar as placas que havíamos preparado, para realizarmos a contagem de fungos e leveduras em copos plásticos coletados no Senai.
No dia 28 de novembro realizamos as análises quantitativas e qualitativas das placas.
2. Objetivo
2.1 OBJETIVO Geral
	Analisar fungos e leveduras.
2.2 Objetivos Específicos 
	Aprender a preparar meio de cultura BDA e analisar qualitativa e quantitativamente as placas de petri.
3. MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
3.1 MATERIAIS 
Água desmineralizada
Alça de Drigalski 
Béquer 
3 copos plásticos
Cristal violeta
Erlenmeyer 
Fucsina 
2 Lâminas
Lugol 
Lupa 
Molde
Óleo de imersão 
4 placas de petri
Pipeta graduada
Potato dextrose agar
Proveta graduada
Saco plástico
Swab 
2 tubos de água peptonada
3.2 Equipamentos
Autoclave
Balança semi-analítica
Bico de Bunsen
Câmara de fluxo laminar
Contador de colônias 
Incubadora 
Geladeira 
Micro-ondas 
Microscópio óptico 
4. Procedimentos
4.1 PROCEDIMENTOS DE PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA
	
Para prepararmos 80ml de solução de BDA, verificamos no rótulo as instruções que dizem que para cada 1L de água desmineralizada, devemos utilizar 39 gramas de meio de cultura. Então, realizamos o seguinte cálculo:
	39g ------ 1000mL			1000x = 39.80
	 Xg ------ 80 mL			x = 3,120/1000 = 3,12g
	
De acordo com o cálculo, em um becker, pesamos 3,12 gramas de BDA em balança semi-analítica e em seguida transferimos o meio de cultura para um erlenmeyer. Medimos 80mL de água desmineralizada em uma proveta graduada e em seguida, adicionamos esses 80mL no erlenmeyer e diluímos o BDA na água. Levamos o meio ao micro-ondas por 30 segundos para que seja diluído completamente e então, autoclavamos por 15 minutos a 121 °C. Por fim, na câmara de fluxo laminar, transferimos o meio para quatro placas de petri com 15 à 20mL cada, deixamos solidificar, identificamos e guardamos na geladeira.
4.1.1 FLUXOGRAMA DO PROCEDIMENTO DE PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA
4.2 PROCEDIMENTOS DE CONTAMINAÇÃO NO MEIO DE CULTURA
	
Fomos até o dispenser onde deveríam ser coletados os copos e contamos quantos haviam lá. Haviam 136 copos, então realizamos o seguinte cálculo para sabermos quantos copos amostrar:
		 X = 0,5 . √n
		 X = 0.5 . √136
		 X = 0,5 . 11,6619
		 X = 5,83 copos
	Arredondamos para 6 e dividimos por 2, pois o mesmo dispenser iria ser analisado por dois grupos, coletando, assim, 3 copos plásticos, 1 copo de cada extremidade do dispenser e 1 da metade dele. Armazenamos em um saco plástico e 
nos dirigimos ao laboratório de química para então contaminarmos as placas feitas na semana anterior.
	Para começar, acendemos a chama do bico de Bunsen, pegamos um molde de 10cm2, assepsiamos com álcool 70% e algodão, e, trabalhando atrás da chama, usamos o molde para determinar a área do copo a ser amostrada. Molhamos um swab na água peptonada e passamos - na área que foi delimitada com o molde – na vertical, horizontal e fazendo movimentos circulatórios. Repetimos o procedimento nos 3 copos, sempre colocando o swab no tubo 1, que continha água peptonada, após cada copo.
	Depois de amostrar os 3 copos, colocamos o swab no tubo de água peptonada (1), agitamos para homogenizar e transferimos 1 mL para outro tubo (2).
Tubo 1: 10-1
Tubo 2: 10-2
	Preparamos 4 placas com o meio de cultura, então, inoculamos 2 delas com 0,1 mL do líquido do tubo 1 ( 10-1 ) e as outras 2 com também 0,1 mL do líquido do tubo 2 ( 10-2 ). Com a alça de Drigalski, espalhamos por toda a superfície do meio de cultura e então levamos para a incubadora a 25 +/-1°C por 6 dias.
 
4.2.1 FLUXOGRAMA DOS PROCEDIMENTOS DE CONTAMINAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
4.3 PROCEDIMENTO DE contagem de bolores e leveduras
	
Com o auxílio de uma lupa e de um contador de colônias, realizamos a análise quantitativa de cada placa, marcando cada colônia contada com uma caneta para a mesma não ser contada novamente.
	Analisamos qualitativamente as placas com o auxílio de um material fornecido pelo professor Horst, que continha foto e os nomes de cada tipo de fungo. Em duas colônias da placa 1 que não conseguimos identificar a olho nu, realizamos a coloração de gram e analisamos em microscópio óptico.
4.3.1 FLUXOGRAMA DO PROCEDIMENTO DE contagem de bolores e leveduras
5. AVALIAÇÃO DE BOLORES E LEVEDURAS EM PROCESSOS INDUSTRIAIS
5.1 AVALIAÇÃO DE BOLORES E LEVEDURAS EM IOGURTE
	
A presença de leveduras e fungos filamentosos em iogurte é um indicativo de práticas sanitárias insatisfatórias na fabricação ou na embalagem. Pesquisas afirmam que as leveduras são uma das maiores fontes de contaminação dos iogurtes, já que o pH ácido inibe o crescimento de outros microrganismos, vários estudos mostram problemas pela contaminação do iogurte por fungos. Para a avaliação de bolores e leveduras, foi utilizado o Ágar Batata Dextrose (BDA) com 2 mL de ácido tartárico (10% p/v) de modo que o pH se estabilizasse em 3,5 para inibir o crescimento bacteriano. O meio de cultura é contaminado com a amostra e incubado. Ao fim do período de incubação, é feita a contagem de bolores e leveduras crescentes nas placas.
5.2 DIFERENTES TESTES QUE PODEM SER REALIZADOS COM O MEIO DE CULTURA BDA
Meio para isolamento, cultivo e contagem de bolores e leveduras;
Meio para manutenção de culturas de dermatófitos geofílicos (fungos que causam infecções em animais e humanos);
Meio diferencial para variedades atípicas de dermatófitos;
Estudo e identificação de micoses;
6. RESULTADOS
	Após preparar, contaminar e incubar o meio de cultura, partimos para as análises qualitativas e quantitativas. Nossas placas apresentaram grande desenvolvimento depois dos 6 dias incubados.
6.1 RESULTADOS PLACA 1 ( 10-2)
Legenda:
1: Fusarium sp					4: 34 bolores em desenvolvimento
2: Aspergilus sp					5: Rhizopus sp
3: Aspergilus sp					Total de 38 colônias.
UFC/mL = número de colônias/ volume inoculado X diluição utilizada
UFC/mL = 38 / 0,1x10-2 = 38 / 0,01 = 3800 UFC/mL 
6.2 RESULTADOS PLACA 2 (10-2)
Legenda:
1: Fusarium sp					3: Fusarium sp
2: Fusarium sp					4: 63 bolores em desenvolvimentoTotal de 66 colônias.
UFC/mL = 66 / 0,1x10-2 = 66 / 0,01 = 6600 UFC/mL 
6.3 RESULTADOS PLACA 3 (10-1)
Legenda:
1: Epicoccum sp					3: 139 bolores em desenvolvimento
2: Epicoccum sp
			Total de 141 colônias.
UFC/mL = 141 / 0,1x10-1 = 141 / 0,1 = 1410 UFC/mL 
6.4 RESULTADOS PLACA 4 (10-1)
Legenda:
1: 27 Rhizopus sp					3: Rhizopus sp
2: Cladosporium sp					4: 130 bolores em desenvolvimento
				Total de 159 colônias.
UFC/mL = 159 / 0,1x10-1 = 159 / 0,1 = 1590 UFC/mL
Para uma comparação visual do resultado de número de colônias que contamos nas nossas placas, elaboramos o seguinte gráfico.
Neste gráfico conseguimos perceber que as placas que continham a diluição deram um resultado metade ou menor que a metade das placas que continham diluição .
7. CONCLUSÃO
	Concluímos que é muito importante o cuidado que devemos ter desde o preparo do meio de cultura e plaqueamento até a contaminação das placas. Cada processo precisa de muita atenção e cuidado para que não haja contaminação paralela e a análise seja comprometida. 
Percebemos que mesmo os copos plásticos estando relativamente limpos, há sim contaminação de fungos e leveduras. Isso acontece devido ao ambiente que a amostra está sujeita.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAs
Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, p.147-155, 2013
Disponível em: http://www.deag.ufcg.edu.br/rbpa/rev152/Art1526.pdf
PLAST Labor. Ágar batata dextrose 90mm.
Disponível em: http://www.plastlabor.com.br/produtos-diagnostico/meios-de-cultura/agar-batata-dextrose-90mm/1-329
FOOD Safety. Ágar batata dextrose – potato dextrose agar (7149)
Disponível em: http://foodsafety.neogen.com/pdf/acumedia_pi/7149_pt_pi.pdf
BORGES, Larissa Rolim. ANÁLISE DE QUALIDADE MICROBIOLÓGICA (BOLORES E LEVEDURAS) EM ERVA-MATE E IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS POTENCIALMENTE MICOTOXIGÊNICOS. Ciências Biológicas. Curitiba, v.1, n.1, p. 16-18, 1999.