Técnicas Imunológicas e Diagnósticas

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ESTUDO DIRIGIDO DA DISCIPLINA DE IMUNOLOGIA CLÍNICA
Curso: Farmácia 
Explique os princípios das técnicas: imunodifusão radial, imunodifusão simples linear, imunodifusão simples radial, nefelometria e turbidimetria.
Imunodifusão radial: É quando os imunocomplexos possuem movimento ao acaso em todas as direções, a partir do orifício no qual se coloca a amostra;
Imunodifusão simples linear: É quando um dos componentes (Ag ou Ac) se encontra fixado ao gel enquanto o outro migra em movimento para uma única direção até a formação do imunocomplexo; 
Nefelometria: Quando um feixe de luz incidente atravessa o meio contendo partículas, estas interferem com a passagem da luz, fazendo com que seja dispersa em todas as direções.
Turbidimetria: A turbidimetria está sujeita as mesmas condições dos sistemas nefelométricos. A diferença é que o sinal de detecção é a absorbância, e não a intensidade de luz dispersa. 
Explique por que as técnicas de aglutinação e de precipitação podem sofrer fenômenos de pró-zona ou pós-zona.
O efeito pró-zona apresenta uma quantidade maior de anticorpo e uma menor quantidade de antígeno, ocorrendo uma má precipitação/aglutinação, fazendo com que ocasione um exame falso-positivo. Já o efeito pós-zona apresenta uma quantidade maior de antígenos e menor de anticorpo. Para que ocorra a zona de equivalência, deve-se ter quantidades próximas de antígeno e anticorpo para que eles consigam se aglutinar ou precipitar com maior facilidade.
Explique e exemplifique: técnicas de aglutinação direta e passiva indireta
Aglutinação direta: O antígeno faz parte naturalmente da célula, e haverá aglutinação dessas células promovida por anticorpos contra esses antígenos. Ex: tipagem sanguínea. 
Aglutinação indireta: Pesquisa de anticorpos no soro por meio de uma reação de aglutinação com o antígeno artificialmente ligado ao material particulado (látex). Ex: Hemaglutinação passiva da doença de chagas; teste de gravidez. 
O que é proteína C reativa e como ocorre o ensaio?
A proteína C reativa é uma proteína produzida pelo fígado que está presente no sangue quando existe alguma inflamação ou infecção no organismo. Ela aparece no soro do paciente na fase aguda de algumas doenças. É detectada sua presença com partículas de látex contendo anticorpos anti-proteína C reativa. Sendo necessário fazer a diluição, para evitar o efeito pró-zona. 
Defina: 
Sensibilidade analítica e diagnóstica.
Sensibilidade analítica: Menor concentração que um teste é capaz de detectar ou menor limite de detecção de um teste.
Sensibilidade diagnóstica: Proporção de todos os pacientes com a doença que apresentam resultados positivos quando o teste em particular é utilizado.
Especificidade analítica e diagnóstica.
Especificidade analítica: Capacidade do teste analisar especificamente o analito;
• Perfil de reações cruzadas;
• Anticorpos que apresentam reatividade cruzada interferem no teste.
Especificidade diagnóstica: Proporção de todos os indivíduos sem a doença que apresentam resultados negativos quando o teste em particular é utilizado.
De acordo com a tabela abaixo, calcule:
	
	Gravidez +
	Gravidez -
	Total
	Teste +
	30
	15
	45
	Teste –
	20
	45
	65
	Total
	50
	60
	
VPP e VPN. 
Explique o significado destes valores.
VPP: Pode ser calculado pela proporção de indivíduos doente entre os resultados positivos obtidos no teste em estudo. Portanto, refere-se à probabilidade da doença quando o resultado do teste é positivo. 
VPN: Pode ser calculado pela proporção de indivíduos não doentes entre os resultados negativos do teste em estudo; portanto, refere-se à probabilidade de não ocorrência de doença quando o resultado do teste é negativo.
(%) VPP = 30/30 + 15 X 100 = 66,7 %
(%) VPN = 45/45 + 20 X 100 = 69, 23%
Encontre a Sensibilidade Diagnóstica e Especificidade Diagnóstica. Explique o significado destes valores.
Especificidade diagnóstica: Proporção de todos os indivíduos sem a doença que apresentam resultados negativos quando o teste em particular é utilizado.
Sensibilidade diagnóstica: Proporção de todos os pacientes com a doença que apresentam resultados positivos quando o teste em particular é utilizado.
(%) SD = 30/ 30 + 20 x 100 = 60%
(%) ED = 45/ 45 + 15 x 100 = 75%
 Explique o que é reação cruzada.
Quando anticorpos específicos para um epítopo de um determinada molécula reage com outro epítopo estruturalmente similar de uma molécula não relacionada.
O que é CUT-off?
Região de corte do teste sorológico, ou seja, um valor, o qual, à direita os resultados são considerados positivos e à esquerda, negativos.
O que é acurácia?
É um parâmetro que determina a capacidade do teste fornecer resultados muito próximos ao verdadeiro valor do que se está medindo.
Diferencie métodos sorológicos marcados de não marcados.
Os métodos sorológicos marcados: Não ocorre a visualização direta da interação Ag/Ac, portanto há uma emissão de sinalização. 
Os métodos sorológicos não-marcados: observam a interação do Ag com o Ac e não emitem uma sinalização.
O que são ensaios imunoenzimáticos homogêneos e heterogêneos?
Homogêneos: Não apresenta etapas de lavagem. (rápido e de fácil execução). É utilizado para drogas.
Heterogêneos: Apresentam etapas de lavagem. É utilizado para detecção de partículas maiores. 
O que são ensaios imunoenzimáticos? Explique os diferentes tipos de ELISA.
Possui como base a utilização de antígenos ou anticorpos marcados com enzimas e permitem a detecção, titulação e quantificação de substâncias de interesse biológico. É importante a eficiência do conjugado empregado; 
ELISA INDIRETO (AG/AC/AC)
ELISA SANDUÍCHE (AC/AG/AC ou AG/AC/AG)
ELISA DE COMPETIÇÃO (Marcado: AC/AG/AG; Não marcado: AG/AC/AG)
Como pode ser determinada a avidez de anticorpos Ig e qual sua aplicação?
Apresenta uma estabilidade da ligação do Ac com o Ag, através do método de Elisa Indireto, onde deve-se ser realizado o exame duas vezes. A primeira vez deve-se acrescentar a solução desestabilizante (ureia) antes do conjugado e na segunda vez realiza-se o teste sem a presença do desestabilizante. 
Onde o que apresenta baixa avidez, acontece o desligamento por desestabilização, apresentando uma ligação fraca, com baixa sinalização e se encontra na fase aguda. Já os que apresentam alta avidez, se encontram ligadas por mais tempo com o desestabilizante e apresentam uma ligação mais forte, estando na fase crônica. 
Diferencie a imunofluorescência direta da indireta.
Imunofluorescência direta: Detecção de antígenos diretamente em células ou tecidos intracelulares ou de membrana, utilizando um anticorpo especifico marcado com fluorocromo; 
Imunofluorescência indireta: utiliza anticorpos antiimunoglobulina marcado com fluorocromo para a detecção de anticorpos que se fixaram em antígenos celulares ou particulados. 
Quais os testes de diagnósticos para Sífilis, qual a diferença entre eles?
Testes não treponêmicos
Os testes não treponêmicos detectam anticorpos IgM e IgG contra o material lipídico liberado pelas células danificadas em decorrência da sífilis e possivelmente contra a cardiolipina liberada pelos treponemas, desenvolvidos pelo organismo do hospedeiro. 
Os testes não treponêmicos mais comumente utilizados e que possuem a metodologia de floculação são o VDRL: Ag: solução alcoólica contendo cardiolipina, colesterol e lecitina. 
O resultado do exame VDRL é dado em títulos: quanto maior o título, mais positivo é o resultado do teste. Basicamente o resultado do exame VDRL pode ser:
Positivo ou Reagente;
Negativo ou Não reagente.
Prova qualitativa: analisar amostra não diluída e diluída 1/8 ou 1/10;
Prova semi-quantitativa: As amostras devem ser tituladas por diluições sucessivas.
RPR (Rapid Plasm Reagin): utiliza partículas de carvão. Quando positivo, demonstra atividade de doença, sendo utilizados no diagnóstico inicial e no controle
Teste treponêmicos
Ostestes treponêmicos utilizam o T. pallidum como antígeno e detectam anticorpos IgG e IgM sem distinção de classes. Positivam mais precocemente que os testes não treponêmicos, porém, mantêm-se positivos por toda a vida em 85% dos pacientes tratados, não podendo ser utilizados para o controle de cura. 
FTA-Abs: É o primeiro teste a positivar após a infecção pelo T. pallidum. É considerado um teste com boa especificidade, pois nele ocorre a absorção ou bloqueio de anticorpos não específicos que eventualmente estão presentes no soro, pela utilização de treponemas saprófitos. Se a amostra possuir anticorpos anti-T. pallidum, eles se ligarão aos antígenos fixados na lâmina, formando um complexo antígeno-anticorpo. Em seguida, a antigamaglobulina marcada com FITC se liga ao complexo antígeno-anticorpo. Ao microscópio visualizam-se os treponemas de cor verde maçã brilhante quando ocorre a reação.
Testes de Hemaglutinação ou aglutinação indireta ou passiva: São de execução simples. Podem ser feitos em amostras de soro ou plasma. Não necessitam equipamentos para sua realização ou para a leitura dos resultados.
Imunoenzimáticos – ELISA, incluindo os quimioluminescente: São ensaios que podem ser automatizados e empregados em laboratórios que têm grande rotina. Podem ser feitos em amostras de soro ou plasma. Existem, ainda, kits padronizados para testar amostras de sangue seco em papel-filtro. A leitura dos resultados é feita por espectrofotometria1 ou outros métodos automatizados
Testes Rápidos – TR: Não necessitam de estrutura laboratorial para serem executados. Podem ser feitos em amostras de sangue total, soro ou plasma. Entre a coleta da amostra e a emissão do resultado decorrem cerca de 30 minutos.
Quais as fases da sífilis? Cite duas características de cada fase.
PRIMÁRIA:
O cancro (feridas indolores) dura em média 3 semanas no local da infecção, anticorpos são detectados concomitante ou em até 10 dias após o início da lesão. Presença de T. pallidum na lesão por microscopia de campo escuro. 
SECUNDÁRIA:
Acontece em média a partir da 6 semanas, T. pallidum invade a corrente sanguínea e linfática e ocorre a disseminação. Altamente infectante, IgGs e IgM em altas concentrações. Os sintomas podem desaparecer sem tratamento. Porém, se não for tratada, a infecção progredirá para o estágio latente e possivelmente para sífilis terciária.
LATENTE:
Pacientes não tratados. Precoce presença de grandes quantidades de anticorpos sem sintomas (muito infectante). Tardia de duração variável (invasão do SNC) termina quando os sintomas da fase terciária aparecem.
TERCIÁRIA:
Pode acontecer em até 10 anos. Pouco infectante, mas ocorre o comprometimento de órgãos, incluindo o cérebro, nervos, olhos, coração, vasos sanguíneos, fígado, ossos e articulações. Esses danos podem ocasionar problemas nos nervos, paralisia, cegueira, demência, e outros problemas de saúde. Presença de Gomas sifilíticas.
O que são testes considerados treponêmicos e não treponêmicos?
Testes treponêmicos: estimulam a produção de anticorpos contra os antígenos da bactéria; 
Testes não – treponêmicos: são anticorpos/expressões lipídicas produzidos decorrente da lesão provocada pelo treponema, que não normalmente não ocorre sua expressão. (Não são específicos da doença).
Qual o princípio do VDRL?
O teste VDRL consiste em um teste de floculação, não-treponêmico, que busca anticorpos no soro, plasma ou líquido cefalorraquidiano.
Detecta anticorpos antilipídios que se formam no hospedeiro como resposta ao material de natureza lipídica, liberado pelas células lesadas no início da infecção, e ao material lipídico do próprio treponema. 
O VDRL baseia-se em uma suspensão antigênica composta por uma solução alcoólica contendo cardiolipina, colesterol e lecitina purificada e utiliza soro inativado como amostra. 
Pesquisa de anticorpos na sífilis.
Cardiolipina + cristais de colesterol + lecitina.
• Anticorpos anticardiolipina.
• Prova qualitativa: analisar amostra não diluída e diluída 1/8 ou 1/10;
• Prova semi-quantitativa: As amostras devem ser tituladas por diluições sucessivas
Quais os diferentes isotipos de imunoglobulinas? Quais delas são divididas em subtipos? Quais as propriedades /atividades de cada uma dessas imunoglobulinas?
Imunoglobulina A – IgA – 2 Subtipos – IgA 1, 2 
Cadeia H Alfa – Pode se apresentar em Monômero, Dímero ou trímero. 
Anticorpos secretados nas células das mucosas, defende as mucosas dos agentes agressores, por exemplo: boca, bexiga e vagina.
Imunoglobulina D – IgD – Nenhum subtipo. 
Cadeia H Delta – Se apresenta na forma de Monômero.
É receptor antigênico de célula B inativa.
Imunoglobulina E – IgE – Nenhum Subtipo.
Cadeia H Épsilon – Se apresenta na forma de Monômero.
Responde à Hipersensibilidade imediata – Desencadeia eventos alérgicos.
Imunoglobulina G – IgG – 4 Subtipos 
Cadeia H Gama - Se apresenta na forma de Monômero. 
Vários efeitos no organismo – É a principal efetora no combate de agentes infecciosos ou antígenos na resposta imune-adaptativa, ela é o anticorpo mais potente pra combater especificamente algum antígeno.
Imunoglobulina M – IgM – Nenhum Subtipo.
Cadeia H Micro - Estrutura de Pentâmero, ela possui 5 imunoglobulinas grudadas entre si por intermédio da cadeia J, possui três domínios Ig na cadeia pesada.
Tem a capacidade de ativar o sistema complemento para poder combater os agentes infecciosos, é capaz de inativar uma serie de toxinas e ela tem uma valência muito grande, ela consegue se ligar a uma variedade enorme de antígenos de uma única só vez.
O que é janela imunológica?
A janela imunológica é o período entre a infecção e a produção de anticorpos pelo organismo contra a bactéria / fungo/ virus em uma quantidade suficiente para serem detectados pelos testes, como o teste rápido.
É o período entre a infecção e o início da formação de anticorpos específicos contra o agente causador, momento em que o indivíduo se torna reagente para o HIV, isto é, sai do status de negativo para o status de positivo para o HIV
O que imunidade inata e adaptativa?
Imunidade inata: ocorre rapidamente, é pré-formada e mais primitiva. É mediada principalmente por fagócitos. Não aumenta a intensidade em episódios subsequentes da infecção e é menos específica. Barreiras e células que participam do sistema imune inata: neutrófilos, macrófagos, linfócitos B e T, mastócitos, etc).
Imunidade adaptativa: é mais tardia, se amplia após contato com o patógeno, mais evoluída. Aumenta a intensidade com episódios subsequentes da infecção (células de memoria – memória imunológica), mais especifica. E é mediada basicamente pelos linfócitos B e T.
O que é epítopo e paratopo?
Epítopo: porção da molécula que se liga ao anticorpo receptor; 
Paratopo: região do anticorpo que se liga ao epítopo.