(13) Avaliação de melhores condições de oxigenação e agitação para a produção de óleos microbianos pela levedura Cryptococcus curvatus (2016)

Prévia do material em texto

Departamento de Engenharia Química 
 
 
 
 
 
 
Relatório Final de Iniciação Científica 
 
 
 
 
 
 
Avaliação de melhores condições de oxigenação e 
agitação para a produção de óleos microbianos pela 
levedura Cryptococcus curvatus 
 
 
 
 
 
Período de 24/08/2015 a 23/08/2016 
 
 
 
 
 
 
 
Aluno: Natalia Milan Nº USP: 9002565 
 
Orientador: Prof. Dr. João Paulo Alves Silva 
 
 
 
 
Lorena 
2016
2 
 
RESUMO 
 
Há muito tempo o homem depende de combustíveis para saciar seus interesses, porém a 
forma com que a sociedade e o mercado enxergam os diferentes tipos de combustíveis muda 
com o passar do tempo. Na atualidade, combustíveis derivados do petróleo têm seus preços 
oscilantes, além de gerarem gases poluentes e serem uma fonte não renovável. Uma 
alternativa para atender à demanda é os biocombustíveis. Tradicionalmente, o biodiesel é 
produzido a partir de sementes oleaginosas ou gordura animal, porém há vantagens ao 
utilizar-se lipídeos derivados de microrganismos oleaginosos, principalmente quando a fonte 
de carbono para a fermentação é o glicerol, subproduto do biodiesel feito de sementes 
oleaginosas. Dentre essas vantagens estão: a não concorrência com terras para alimentos, o 
maior rendimento e o menor trabalho envolvido. Este trabalho tem como objetivo estudar e 
determinar a melhor condição de agitação e aeração da levedura Cryptococcus curvatus para a 
produção de lipídeos. Para isso foi utilizado um planejamento fatorial do tipo 2
2
 no qual foi 
avaliado as variáveis agitação (nos níveis 150, 200, 250 rpm) e a razão dos volumes de frasco 
por volume de meio de cultura (razões de 1:5, 1:3,7 e 1:2,5, correspondendo, repetitivamente, 
a volumes de meio de 50, 66,7 e 100 mL em frascos de 250 mL). Como respostas do estudo 
foram avaliadas a quantidade de lipídeos produzidos, assim como o crescimento celular e o 
consumo de substrato. Nos ensaios realizados com diferentes agitações e razões de volume de 
frasco por volume de meio, verificou-se que o crescimento foi fortemente influenciado pela 
condição de fornecimento de oxigênio ao meio de cultivo, enquanto que o acúmulo de 
lipídeos foi baixo e oscilante. Dentro da faixa de variação avaliada, verificou-se que quanto 
maior a disponibilidade de oxigênio no meio, maior foi o crescimento celular, sendo 
alcançada na condição de maior aeração (250 rpm, e 50 mL de meio em frascos de 250 mL), 
uma concentração de cerca de 43,47 g/L de células, em 120 horas de cultivo. A análise 
estatística mostrou uma tendência que sugere um aumento nas concentrações de células para 
cultivos em maiores níveis de oxigenação, entretanto, devido a limitações físicas dos 
equipamentos, condições de maior agitação não puderam ser avaliadas em frascos agitados. 
 
Palavras-chave: biodiesel, leveduras oleaginosas, Cryptococcus curvatus, aeração, 
oxigenação, agitação. 
 
 
 
3 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1 - Conteúdo de lipídios de algumas leveduras oleaginosas. 14 
Tabela 2 - Planejamento fatorial do tipo 2
2
, com triplicata no ponto central, para a avaliação 
do efeito da agitação/aeração na produção de lipídeos por leveduras. 18 
Tabela 3 - Absorbâncias das suspensões celulares em diferentes diluições e suas 
concentrações. 20 
Tabela 4 - Concentração de lipídeos e concentração celular em 120 horas de cultivo segundo o 
planejamento fatorial do tipo 2² para a avaliação aeração/agitação. 23 
Tabela 5 - Análise da variância dos efeitos principais de interações dos fatores obre a 
concentração celular. 26 
Tabela 6 - Análise da variância dos efeitos principais de interações dos fatores obre a 
concentração de lipídeos. 26 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1 - Demanda mundial de energia desde 1990 até a previsão para 2035. 09 
Figura 2 - Diferentes combustíveis e seus percentuais de uso desde 1990 até a previsão para 
2035. 09 
Figura 3 - Oferta Interna de Energia no Brasil em 2014. 10 
Figura 4 - Curva de calibração e equação para levedura. 21 
Figura 5 - Curva de calibração e equação para óleo de soja. 22 
Figura 6 - Concentrações de biomassa e lipídeos obtidas nos cultivos realizados nas diferentes 
condições do planejamento exprimental. 24 
Figura 7 - Gráfico de Pareto que expressa as estimativas dos efeitos padronizados e limite de 
significância estatística para as respostas produção de biomassa (A) e de lipídeos (B). 25 
Figura 8 - Superfície de resposta que relaciona a produção de biomassa com a relação 
Vfrasco/Vmeio e agitação. 27 
 
 
 
 
 
5 
 
SUMÁRIO 
 
1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA 06 
2 REVISÃO BIBLIOGÁFICA 08 
2.1 Perspectiva mundial de consumo de combustíveis 08 
2.2 Biocombustíveis 10 
2.2.1 Etanol 11 
2.2.2 Biodiesel 11 
2.3 Microrganismos oleaginosos 12 
2.3.1 Cryptococcus curvatus 14 
2.4 Glicerol 14 
3 OBJETIVOS 16 
4 MATERIAS E MÉTODOS 17 
4.1 Microrganismo e preparo do inoculo 17 
4.2 Efeito da agitação/aeração no acúmulo de lipídeos 17 
4.3 Metodologias analíticas 18 
4.3.1 Determinação da concentração celular 18 
4.3.2 Determinação de lipídios totais 19 
4.4 Análise de resultados 19 
5 RESULTADOS 20 
5.1 Adequação de metodologias analíticas 20 
5.1.1 Determinação da concentração celular 20 
5.1.2 Determinação de lipídios 21 
5.2 Avaliação das condição de aeração 22 
5.3 Análise estatística dos resultados 24 
6 CONCLUSÃO 28 
REFERÊNCIAS 29 
 
 
 
 
 
 
 
6 
 
1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA 
 
A crescente demanda por combustíveis e a preocupação ambiental são fatores 
chaves para a busca constante por tecnologias que possam suprir as necessidades mundiais de 
energia de forma economicamente viável e ambientalmente correta. 
Osbiocombustíveis mostram-se como uma opção muito promissora, com ênfase 
no biodiesel, combustível este que pode ser obtido de diversas maneiras. Segundo Akasaka 
(2015), tradicionalmente o biodiesel é obtido da reação de transesterificação de óleos 
vegetais ou de gorduras animais em ésteres metílicos e glicerol na presença de metanol e com 
o auxílio de catalisadores homogêneos básicos. No entanto, Chisti (2007) realta em seu 
trabalho que seria necessário 24% da área cultivável dos Estados Unidos para atender a 
apenas 50% da demanda anual de combustíveis para transporte se o óleo de palma fosse 
utilizado para a produção de biocombustíveis. O trabalho foi feito com base nos dados de 
consumo de 2007, hoje o número seria na realidade ainda maior devido a alta da demanda. 
Além desse problema, outro mostra-se crucial no que se diz respeito à produção de biodiesel a 
partir de sementes oleaginosas: a concorrência com o mercado de alimentos. 
Como alternativa, o biodiesel oriundo de microrganismos presencia um crescente 
interesse devido ao seu maior rendimento e por não competir com a terra para produção de 
alimentos. Outra vantagem em utilizar microrganismos oleaginosos seria a possibilidade da 
obtenção de óleos pelo aproveitamento do glicerol residual da produção de biodiesel. De 
acordo com Bastos (2011), o glicerol é o principal coproduto da reação de transesterificação 
de trigliacilgliceróis para a produção de biodiesel, sendo que ele representa 10% do seu peso. 
Muitos microrganismos podem utilizar o glicerol como única fonte de carbono sob condições 
aeróbias ou anaeróbias para obtenção de energia, dentre eles destacam-se as algas e as 
leveduras. As últimas, segundo Aristizábal (2013), além de não precisarem de energia solar 
para a fotossíntese, apresentam outras vantagens quando comparadas às algas: os ácidos 
graxos produzidos por elas são altamente semelhante aos óleos vegetais, ou seja, podem ser 
usados para a produção de biodiesel; e sua parede celular é relativamente mais fina do que a 
das algas, o que torna a recuperação dos lipídeos mais fácil. 
Leveduras como a Cryptococcus curvatus, de acordo com Iassanova (2009), 
conseguem converter carbono em óleos em uma quantidade de entre 50 e 73% do seu peso 
seco. Thiru et al. (2011) complementa que o óleo produzido pela C. curvatus é semelhante ao 
óleo extraído de sementes como da Palma, necessitando portanto de tratamento semelhante 
para sua utilização em motores movidos a combustão interna de ciclo diesel. 
7 
 
Nesse contexto, o presente trabalho tem como objetivo estudar a produção de óleo 
microbiano pela levedura Cryptococcus curvatus utilizando glicerol como única fonte de 
carbono. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
8 
 
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 
 
Desde a pré-história o homem explora diversas formas de obter energia através de 
combustíveis, sejam eles sólidos, líquidos ou gasosos. De acordo com Sousa (2012), o 
primeiro combustível a ser explorado foi a madeira, ou lenha, uma matéria que ainda é 
utilizada por países de tímido desenvolvimento industrial. Entre os séculos XVIII e XIX, com 
a Revolução Industrial, o carvão mineral foi utilizado para mover as máquinas a vapor, sendo 
que seu consumo decaiu nas últimas décadas, variando devido a oscilação do preço do 
petróleo. Nos primeiros anos do século XX, com a produção em série de automóveis, a 
gasolina começou a ser o derivado do petróleo mais cobiçado, substituindo assim o 
querosene, e dando início a era dos combustíveis líquidos. O gás natural, descoberto em 1859, 
que tinha sido utilizado desde então para iluminação, em 1920 se destacou como alternativa 
aos combustíveis mais poluentes. Durante a Segunda Guerra Mundial outro derivado do 
petróleo ganha espaço como combustível de alto desempenho, o diesel, que possui maior 
eficiência que a gasolina, mas os motores movidos a diesel são mais onerosos. Após as crises 
do petróleo durante a década de 70, o mundo busca novas fontes de energia e uma alternativa 
é o álcool anidro produzido a partir da fermentação da sacarose, segundo BiodieleslBR 
(2006), a produção de álcool em 1975, de 600 milhões de litros, subiu para 12,3 bilhões em 
1986. Por fim, em 2000, as fontes renováveis voltaram ao foco do mercado energético com os 
biocombustíveis, com destaque para o biodiesel e o etanol. 
Dentre os combustíveis citados anteriormente, o carvão mineral, a gasolina, o gás 
natural e o diesel são energias chamadas não renováveis, ou seja, provêm de recursos 
teoricamente limitados e consequentemente serão esgotados em um certo prazo se o consumo 
continuar. Já a madeira, o álcool e os biocombustíveis são energias renováveis, que podem 
manter-se em aproveitamento por longos períodos sem a possibilidade de esgotamento. 
 
2.1 Perspectiva mundial de consumo de combustíveis 
Segundo a projeção feita pela EIA (2010), o consumo mundial de energia chegará 
a 739 quadrilhões de BTU em 2035 (Figura 1). 
 
 
 
 
 
9 
 
Figura 1 - Demanda mundial de energia desde 1990 até a previsão para 2035. 
 
Fonte: U.S. Energy Information Administration, 2010. 
 
Ainda segundo EIA (2010), as porcentagens de diferentes tipos de combustíveis 
mostra que as fontes renováveis e limpas estão em ascendência, enquanto que fontes não 
renováveis e poluentes estão em decadência ou estagnadas até 2035 (Figura 2). 
 
Figura 2 - Diferentes combustíveis e seus percentuais de uso desde 1990 até a 
previsão para 2035. 
 
Fonte: U.S. Energy Information Administration, 2010. 
10 
 
 
No cenário brasileiro, o Ministério de Minas e Energia mostra na Resenha 
Energética de 2015 a oferta interna de energia de 2014, onde observa-se que fontes renováveis 
somam 39,4% do total (Figura 3). 
 
Figura 3 - Oferta Interna de Energia no Brasil em 2014. 
 
Fonte: Ministério de Minas e Energia, 2015. 
 
2.2 Biocombustíveis 
Devido a instabilidade política nas regiões de maior extração, crescente aumento 
de preços e possível esgotamento, os combustíveis derivados do petróleo necessitam de 
substituintes que supram as necessidades mundiais de forma economicamente viável e 
ambientalmente correta. A opção que está em foco atualmente é os biocombustíveis, que, 
segundo Petrobras (2007), são definidos por serem "(...) combustíveis produzidos a partir da 
biomassa (matéria orgânica), isto é, de fontes renováveis - produtos vegetais ou compostos de 
origem animal" e que, de acordo com Bastos (2011), tem com principais características: 
potencial de substituir combustíveis fósseis sem afetar o suprimento global de alimentos; 
saldo positivo de energia, ou seja, produzir mais energia do que aquela utilizada para produzi-
lo; e ter menores impactos ambientais. 
 
 
11 
 
2.2.1 Etanol 
O etanol é um dos principais biocombustíveis da atualidades. Como Paludo 
(2014) define, ele é um derivado de biomassa renovável, cuja composição é principalmente 
feita de álcool etílico e que pode ser usado em motores de combustão interna com ignição por 
centelha, em outras formas de geração de energia ou em indústria petroquímica. 
Segundo Paludo (2014), o etanol possui um elevado teor de oxigênio, cerca de 
35% em massa, o que é uma grande diferença em relação aos combustíveis derivados do 
petróleo. Esse elevado teor significa que a combustão é mais limpa e o desempenho do motor 
é melhor, ou seja, isso reduz a emissão de gases poluentes. 
De acordo com Santos (2012), as tecnologias para a obtenção do bioetanol 
envolvem a hidrólise dos polissacarídeos da biomassa em açúcares fermentescíveis e posterior 
fermentaçãoe, para a realização dessa hidrólise, utiliza-se tecnologias complexas e 
multifásicas, com base no uso de rotas ácidas e/ou enzimáticas para a separação dos açúcares 
e remoção da lignina. 
 
2.2.2 Biodiesel 
Segundo a Resolução ANP nº 7/2008 Biodiesel é um combustível composto de 
alquil ésteres de ácidos graxos de cadeia longa, derivados de óleos vegetais ou de gorduras 
animais conforme especificação contida no Regulamento Técnico. Dabdoub (2009) 
complementa que o biodiesel é capaz de substituir total ou parcialmente o diesel em motores 
de combustão interna de ciclo diesel, sem a necessidade de modificações nos motores. No 
Brasil, o biodiesel tem de atender às especificações estabelecidas pela Agência Nacional do 
Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis (ANP) em sua Resolução ANP nº 07/2008, enquanto 
que, nos Estados Unidos, vale a norma ASTM D6751 da American Society for Testing and 
Materials (ASTM) e na Europa, a norma EN 14214 do European Committee for 
Standardization (CEN). 
Segundo Ramos (2011), a patente belga número 422.877 concedida no ano de 
1937 para Charles Chavanne foi o primeiro registro do que hoje se denomina biodiesel. Nesta 
patente, foi relatada a transesterificação em meio ácido em que se obtia ésteres etílicos do 
óleo de palma. O termo "biodiesel" foi utilizado, porém, pela primeira vez no artigo Taiyang-
neng Xuebao publicado em 1988 por R. Wang. O Brasil teve sua primeira patente relacionada 
ao assunto no ano de 1980, dado para o documento "Processo de produção de combustíveis a 
partir de frutos ou sementes de oleaginosas", cujo número é 8007957.28. A patente foi 
requerida de um processo de transesterificação que usa ácidos como o ácido sulfúrico ou 
12 
 
clorídrico e o hidróxido de sódio ou de potássio como catalisador alcalino para a produção de 
combustível de maneira semelhante à de Chavanne, com o adentro de que seria possível 
separar frações leves, que serviria como substituto do querosene, e frações pesadas, como 
substituto do diesel, dos ésteres do biodiesel obtido a partir de amêndoas de babaçú através de 
destilação à vácuo. 
Como Barbosa et al. (2007) relata, o biodiesel pode reduzir em 78% as emissões 
de gás carbônico quando comparado ao óleo diesel derivado do petróleo, isso já considerando 
a reabsorção das plantas, também pode reduzir em 90% as emissões de fumaça e praticamente 
eliminar as emissões de óxido de enxofre. No entanto, Chisti (2007) realta em seu trabalho 
que seria necessário 24% da área cultivável dos Estados Unidos para atender a apenas 50% da 
demanda anual de combustíveis para transporte se o óleo de palma fosse utilizado para a 
produção de biocombustíveis. O trabalho foi feito com base nos dados de consumo de 2007, 
hoje a realidade seria ainda maior devido a alta da demanda. 
Segundo Dabdoub (2009), o biodiesel é tradicionalmente produzido por reações 
de transesterificações de triglicerídeos na presença de catalisadores alcalinos ou por 
esterificação de ácidos graxos livres, sendo que por esterificação, os ácidos graxos livres 
reagem diretamente com um álcool de quatro ou menos carbonos na presença de catalisadores 
ácidos. O uso de catalisadores heterogêneos, homogêneos e enzimáticos também é possível. 
Existem muitas opções de matérias primas para a produção de biodiesel. Bastos 
(2011) mostra que, além de oleaginosas como a Colza, Soja e Girassol, também é possível o 
uso de microrganismos, gorduras animais e óleos residuais. O uso de matérias primas 
baseadas em óleos comestíveis gera concorrência com o mercado de alimentos, porém é 
possível também o uso de óleos não comestíveis como o Pinhão-manso, a Mamona e a 
Pongamia pinnata, por exemplo. Outro problema já relatado anteriormente é a 
indisponibilidade de terras para o cultivo da quantidade necessária para abastecer a demanda 
de biocombustíveis. Assim, o biodiesel oriundo de microrganismos presencia um crescente 
interesse devido ao seu maior rendimento e por não competir com terra para produção de 
alimentos. 
 
2.3 Microrganismos oleaginosos 
Segundo Amorim et al. (2013), todos os organismos eucarióticos e algumas 
bactérias gram-positivas armazenam trigliceróis em compartimentos chamados de partículas 
de lipídios, gotículas lipídicas, corpos lipídicos, corpos oleosos, oleossomas ou esferossomas 
(em plantas). Aristizábal (2013) complementa que bactérias, fungos, microalgas e leveduras 
13 
 
estão sendo estudados recentemente para a produção de óleos e gorduras por fermentação, 
sendo que os lipídios normalmente produzidos são triacilglicerídeos de ácidos graxos de 
cadeia longa e em menor quantidade fosfolipídeos, hidrocarbonetos, carotenoides e esteróis. 
Em comparação com óleos de outros vegetais ou de gorduras animais, Thiru et al. 
(2011) cita que a produção de óleos microbianos possui vantagens como: microrganismos 
possuem ciclo de vida muito mais curto do que de plantas, menos trabalho é requerido, óleo 
microbiano é menos afetado por localidade, estação e clima e o aumento de escala é mais 
facilmente realizado. 
Microrganismos oleaginosos produzem e acumulam lipídios em situações 
especiais. O esgotamento de ingredientes essenciais é apontado por Iassanova (2009) como a 
principal condição, em especial do nitrogênio. Segundo ele, durante a fase de crescimento, em 
que todos os nutrientes e minerais estão disponíveis, o crescimento é alto e o acúmulo de 
lipídios é baixo, entretanto, quando o nitrogênio começa a ser limitante e o carbono continua 
abundante, o microrganismo entre em uma fase chamada de idiofase, em que a proliferação 
cessa por causa da falta de nitrogênio para a síntese de ácidos nucleicos e proteínas, mas os 
microrganismos continuam consumindo carbono, sintetizando e acumulando lipídios como 
material de reserva para condições ambientais não favoráveis ou para quando não houver 
outra fonte de carbono disponível. 
Segundo Aristizábal (2013), algas e leveduras são capazes de armazenar grandes 
quantidades de lipídeos, alguns destes com importância nutricional e dietética. Leveduras, 
além de não precisarem de energia solar para a fotossíntese, apresentam outras vantagens 
quando comparadas às algas: os ácidos graxos produzidos por elas são altamente semelhante 
aos óleos vegetais, ou seja, podem ser usados para a produção de biodiesel; e sua parede 
celular é relativamente mais fina do que a das algas, o que torna a recuperação dos lipídeos 
mais fácil. 
Leveduras são consideradas oleaginosas quando armazenam acima de 20% do seu 
peso seco em lipídeos, sendo que algumas delas podem chegar a acumular até 70% do seu 
peso seco. Dentre as leveduras que mais se destacam na literatura, segundo Aristizábal (2013) 
e Thiru et al. (2011) têm-se: Cryptococcus sp. (com ênfase em Cryptococcus curvatus), 
Rhodotorula sp. (com ênfase em Rhodotorula glutinis), Rhodosporidium sp. (com ênfase em 
Rhodosporidium toruloides), Lipomyces sp. (com ênfase em Lipomyces starkeyi), Yarrowia 
sp. (com ênfase em Yarrowia lipolytica), Candida sp. e Trichosporon sp.. 
 
 
14 
 
Tabela 1 - Conteúdo de lipídios de algumas leveduras oleaginosas. 
 
Fonte: Aristizábal (2013). 
 
O mecanismo de biossíntese de lipídeos pode aparentar ser similar entre as 
leveduras, mas Aristizábal (2013) informa que a quantidade e o tipo de óleo produzido 
depende da linhagem e das condições de cultivo, condições essas: relação carbono/nitrogênio, 
temperatura, pH, oxigênio e concentração de microelementos e sais inorgânicos no meio de 
cultivo. 
 
2.3.1 Cryptococcus curvatus 
Anteriormente também conhecida como Apiotrichum curvatum ou Candida 
curvata, a levedura Cryptococcus curvatus foi descoberta em 1978 no estado de Iowa, 
Estados Unidos.De acordo com Iassanova (2009), essa levedura é uma eficiente produtora de 
óleos e cresce facilmente com recursos mínimos, além de que utilizar uma ampla variedade de 
substratos, como o glicerol e óleos, e convertê-los em reservas intracelulares de lipídeos. 
Ainda segundo Iassanova (2009), C. curvatus cresce bem enquanto usa o 
nitrogênio e carbono disponíveis, então ela começa a converter o carbono em óleos 
intracelulares e tipicamente para quando possui entre 50 e 73% de óleo em peso seco. A 
quantidade de lipídeos acumulada na levedura depende do substrato utilizado. Thiru et al. 
(2011) complementa que o óleo produzido pela C. curvatus é semelhante ao óleo extraído de 
sementes como da Palma e que o óleo formado pela levedura na forma de triacilgliceróis são 
predominantemente ácidos oleicos (C18:1), linoleicos (C18:2), esteáricos (C18:0), palmíticos 
(C16:0) ou palmitoleicos (C16:1). 
 
2.4 Glicerol 
Segundo Siqueira (2015), o 1,2,3-propanotriol, ou comunmente chamado de 
glicerol, é um álcool que se apresenta como um líquido viscoso, inodoro e com sabor doce. 
15 
 
O glicerol, de acordo com Bastos (2011), é o principal coproduto da reação de 
transesterificação de trigliacilgliceróis para a produção de Biodiesel, sendo que ele representa 
10% do peso de biodiesel. Ainda segundo Bastos (2011), durante o mês de abril de 2011 
foram produzidos 185.060 m³ de biodiesel e, consequentemente, cerca de 18.506 m³ de 
glicerol. Logo, a produção de biodiesel gera um excedente de glicerol residual que necessita 
ter aplicações a fim de não se tornar um rejeito industrial poluente. 
Diversas aplicações microbiológicas estão sendo estudadas para o aproveitamento 
do glicerol residual da produção de biodiesel. Já que muitos microrganismos podem utilizar o 
glicerol como única fonte de carbono sob condições aeróbicas ou anaeróbicas para obtenção 
de energia, é de interesse utilizá-lo como matéria-prima para fermentações industriais com o 
intuito de fortalecer a cadeia produtiva de Biodiesel e tornar este combustível um forte 
concorrente no mercado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
16 
 
3 OBJETIVOS 
 
Este trabalho tem por objetivo avaliar a influência das condições de fornecimento 
de oxigênio sobre a produção e acúmulo de óleo microbiano pela levedura Cryptococcus 
curvatus em cultivos realizados em meio contendo glicerol como principal fonte de carbono. 
Para isso, serão desenvolvidas as seguintes etapas: 
 Adequação de metodologia para a quantificação da concentração celular 
da levedura por espectrofotometria; 
 Adequação de metodologia para a quantificação do lipídio microbiano por 
técnica colorimétrica para amostras de pequeno volume de meio de 
cultura; 
 Desenvolvimento de cultivos de levedura em frascos agitados, sob 
diferentes condições de fornecimento de oxigênio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
17 
 
4 MATERIAS E MÉTODOS 
 
Os experimentos foram realizados no laboratório de biocombustíveis do 
Departamento de Engenharia Química (LOQ), da Escola de Engenharia de Lorena da 
Universidade de São Paulo (EEL-USP). 
 
4.1 Microrganismo e preparo do inoculo 
Foi utilizada a cepa da levedura Cryptococcus curvatus Y -1511, cedida pela 
USDA (United States Department of Agriculture), de Peoria, Illinois. A cultura foi mantida 
repicada em tubos de ensaio contendo ágar extrato de malte inclinado e conservada em 
geladeira a 4ºC. O inoculo foi preparado transferindo-se uma alçada de células, proveniente 
de um cultivo de 24 h em meio de manutenção, para frascos Erlenmeyer de 250 mL contendo 
50 mL do meio de cultura composto de 30,0 g/L de substrato (glicose ou glicerol), 3,0 g/L de 
Extrato de levedura, 1,0 g/L de MgSO4.7H2O e 3,0 g/L de (NH4)2HPO4, o qual foi preparado 
e esterilizados em autoclave a 121ºC por 20 minutos. Os frascos foram incubados à 30ºC em 
agitador rotatório a 200 rpm por 24 horas. Após este tempo as células foram separadas por 
centrifugação a 2000xg por 10 minutos e ressuspensas em água destilada estéril de modo a 
obter uma suspensão concentrada. Esta suspensão foi então adicionada como inoculo ao meio 
de cultivo de modo a obter uma concentração inicial de células de 1 g/L. 
 
4.2 Efeito da agitação/aeração no acúmulo de lipídeos 
Visando determinar as melhores condições de fornecimento de oxigênio para os 
cultivos em frascos agitados que possibilitem maximizar o acumulo de lipídeos pelas 
leveduras, serão realizados estudos utilizando a metodologia de planejamento experimental. 
Nesta etapa serão empregados planejamentos fatoriais do tipo 2
2
 com triplicata no ponto 
central, para avaliar os efeitos da variação da velocidade de agitação e da relação volume de 
frasco/volume de meio de fermentação, sobre o acúmulo de lipídeos pelas leveduras, 
conforme mostrado na Tabela 2. 
 
 
 
 
 
18 
 
Tabela 2 - Planejamento fatorial do tipo 2
2
, com triplicata no ponto central, para a avaliação 
do efeito da agitação/aeração na produção de lipídeos por leveduras. 
Ensaios 
Variáveis 
Agitação (rpm) V frasco/V meio 
Valor real (rpm) Nível Valor real Nível 
1 150 -1 2,50 -1 
2 250 +1 2,50 -1 
3 150 -1 5,00 +1 
4 250 +1 5,00 +1 
5 150 -1 3,75 0 
6 250 +1 3,75 0 
7 200 0 2,50 -1 
8 200 0 5,00 +1 
9 200 0 3,75 0 
10 200 0 3,75 0 
11 200 0 3,75 0 
Fonte: o autor. 
 
Levando-se em conta os resultados obtidos no ensaio do planejamento fatorial, 
caso necessário, poderão ser realizados ensaios adicionais para a quantificação dos níveis das 
variáveis estudadas através da metodologia de superfície de resposta. 
 
4.3 Metodologias analíticas 
 
4.3.1 Determinação da concentração celular 
A concentração celular foi determinada pela medida das absorbâncias das 
amostras em espectrofotômetro. As amostras foram centrifugadas a 2000 rpm por 10 minutos. 
As células foram lavadas e centrifugadas novamente nas mesmas condições, e ressuspensas 
em água destilada. A absorbância da suspensão celular foi determinada a 600 nm, utilizando-
se água como branco. A concentração celular foi calculada através da curva de calibração 
especifica para a levedura utilizada. 
 
4.3.2 Determinação de lipídios totais 
Para a determinação de lipídeos produzidos pela levedura, para a extração foi 
utilizado o método Bligh & Dyer (1959) adaptado e a quantificação foi realizada por 
colorimetria empregando o método de coloração por Sulfo-fosfo-vanilina (KNIGHT et al., 
1972). Durante a fermentação foram retiradas alíquotas de 1 mL do meio de cultivo a cada 24 
horas, as quais foram centrifugadas para a separação do sobrenadante. A extração de óleos foi 
19 
 
realizada adicionando-se 1 mL de metanol e 2 g de pérolas de vidro (0,50 mm de diâmetro) as 
células. Esta mistura foi submetida a agitação em vortex por quatro ciclos de um minuto com 
intervalos de um minuto em banho de gelo. Após a realização dos ciclos foram adicionados 
2 mL de clorofórmio e a mistura foi agitada durante 1 hora a 200 rpm, após este período 
foram acrescentados 1 mL de solução de cloreto de potássio 0,88% e 0,8 mL de água 
destilada. A mistura foi então centrifugada a 2000 rpm por 5 minutos havendo a separação de 
duas fases. Foi retirada uma alíquota de 0,4 mL da fase de fundo (orgânica) a qual foi 
colocada em tubos e levada a estufa a 80ºC por 24 horas para evaporação do solvente. 
Para o método colorimétrico, após a evaporação foi adicionado ao frasco 1 mL de 
ácido sulfúrico concentrado, e a mistura foi aquecida em banho maria sob fervura por 10 
minutos. As amostras foram então resfriadase foi adicionado à solução de ácido fosfórico e 
vanilina (17%) para desenvolver a coloração. As amostras foram colocadas no escuro por 45 
minutos. Após esse período foi então determinada a absorbância das amostras a 525 nm, 
tendo água como branco. A concentração de lipídeos foi calculada por uma curva de 
calibração. 
 
4.4 Análise de resultados 
Os resultados dos cultivos serão analisados considerando parâmetros como: fator 
de conversão de substrato em lipídio e produtividade volumétrica de lipídios. Os dados serão 
analisados quanto à cinética de crescimento considerando a velocidade específica de 
crescimento celular, velocidade específica de consumo, produção de lipídios e variação de 
pH. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
20 
 
5 RESULTADOS 
 
5.1 Adequação de metodologias analíticas 
 
5.1.1 Determinação da concentração celular 
A fim de se obter o crescimento celular durante a fermentação foi necessária curva 
de calibração que relacionasse a absorbância da suspensão em 600 nm e a concentração de 
células em termos do seu peso seco. A partir de diferentes diluições de uma suspensão celular 
concentrada feita, foi possível relacionar a absorbância medida nelas, em comprimento de 
onda de 600 nm, com sua a concentração já sabida. Os valores são mostrados na Tabela 3. 
 
Tabela 3 - Absorbâncias das suspensões celulares em diferentes diluições e suas 
concentrações. 
Absorbância (600nm) Concentração 
1,076 0,941 g/L 
0,619 0,3764 g/L 
0,373 0,1882 g/L 
0,215 0,0941 g/L 
0,082 0,03764 g/L 
0,044 0,0182 g/L 
0,023 0,00941 g/L 
Fonte: o autor. 
 
Os valores foram linearizados e então foi obtida a equação de concentração de 
biomassa da levedura, que relaciona a concentração de biomassa a uma determinada 
absorbância na faixa de onda de 600 nm, mostrada na Figura 4. 
 
 
 
 
 
 
 
21 
 
Figura 4 - Curva de calibração e equação para levedura. 
 
Fonte: o autor. 
 
A curva de calibração obtida por regressão linear dos dados apresentou um bom 
ajuste na região avaliada, tendo um coeficiente de determinação (R²) superior a 0,94. 
 
5.1.2 Determinação de lipídios 
A determinação da concentração de óleo microbiano foi realizada pela extração 
empregando o método Bligh & Dyer (1959) adaptado seguida pela quantificação por 
calorimetria utilizando a técnica de coloração pela reação Sulfo-fosfo-vanilina (KNIGHT et 
al., 1972). Para a utilização da técnica colorimétrica foi necessária a construção de uma curva 
de calibração que relacionasse a absorbância resultante da reação de coloração, medida em 
525 nm, com a concentração de lipídios no extrato celular. A curva de calibração obtida para 
produção de lipídios está apresentada na Figura 5. 
 
 
 
 
 
 
 
Concentração(g/L) = 0,8549(600nm) - 0,059 
R² = 0,9617 
0 
0,1 
0,2 
0,3 
0,4 
0,5 
0,6 
0,7 
0,8 
0,9 
1 
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 
C
o
n
ce
n
tr
a
çã
o
 (
g
/L
) 
Absorbância (600nm) 
22 
 
Figura 5 - Curva de calibração e equação para óleo de soja. 
 
Fonte: o autor. 
 
Dentro da região avaliada, o resultado seguiu a expectativa, tendo um 
comportamento linear, coeficiente de determinação (R²) superior a 0,94 e termo independente 
da equação próximo de zero. A amostra de clorofórmio pura não deveria conter óleos ou 
materiais orgânicos, o que faz com que sua absorbância fique próxima de zero (reta que passe 
pelo ponto 0,0). 
 
5.2 Avaliação da condição de aeração 
Segundo o planejamento experimental de fatorial 2², discutido no item 4.2 deste 
relatório, diferentes aerações foram testadas para a determinação das melhores condições de 
produção de lipídeos e biomassa. Para isso, variou-se a razão Vfrasco/Vmeio (2,5:1, 3,75:1e 5:1) 
e a agitação (150 rpm, 200 rpm e 250 rpm). A Tabela 4 contém os níveis das variáveis, as 
concentrações celulares e a produtividade máxima obtida em 120 horas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Massa(g) = 0,0008Abs(525nm) - 7×10-5 
R² = 0,9434 
0 
0,0002 
0,0004 
0,0006 
0,0008 
0,001 
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 
M
a
ss
a
 (
g
ra
m
a
s)
 
Absorbância (525nm) 
23 
 
Tabela 4 - Concentração de lipídeos e concentração celular em 120 horas de 
cultivo segundo o planejamento fatorial do tipo 2
2
 para a avaliação aeração/agitação. 
 
Ensaio 
Variável Concentração de lipídeos 
máxima (g/L) 
Concentração celular 
máxima (g/L) A B 
1 -1 -1 0,694 9,659 
2 +1 -1 1,547 30,348 
3 -1 +1 1,163 27,911 
4 +1 +1 1,551 43,470 
5 -1 0 0,379 19,533 
6 +1 0 1,500 38,982 
7 0 -1 2,237 24,834 
8 0 +1 1,589 28,467 
9 0 0 1,328 26,116 
10 0 0 1,274 33,169 
11 0 0 0,709 29,365 
A= agitação B= Razão de Vfrasco/Vmeio 
Fonte: o autor. 
 
A levedura foi capaz de produzir lipídeo em todas as condições de ensaio a que foi 
submetida, porém houve grande variação nas concentrações finais de células, sendo que, em 
geral, a produção de óleo foi muito baixa. 
A Figura 6 mostra os dados da Tabela 4 em forma de gráfico de barras, para 
facilitar a análise da influência da aeração na produção de óleo microbiano. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
24 
 
Figura 6 - Concentrações de biomassa e lipídeos obtidas nos cultivos realizados nas diferentes 
condições do planejamento experimental. 
 
Fonte: o autor. 
 
Os efeitos da agitação e da razão Vfrasco/Vmeio foram avaliados mais 
cuidadosamente através de análise estatística empregando metodologia de superfícies de 
resposta, como será apresentado no item a seguir. 
 
5.3 Análise estatística dos resultados 
Na Figura 7A e 7B são apresentados os gráficos de Pareto para as respostas 
Concentração Celular e Concentração de Lipídeos, respectivamente. Nesta análise são 
considerados significativos os termos cujos valores de t calculado (representado pelas barras no 
gráfico de Pareto) apresentam-se superiores ao valor de t tabelado (representado pela linha do 
gráfico), para distribuição de Student, a 95% de confiança. 
Em uma análise do gráficos de Pareto para a Concentração Celular (Figura 7A) 
observou-se que apenas os efeitos lineares da Agitação (1) e da razão V Frasco/V Meio (2) foram 
significativos a um nível de 0,05 de significância. Para a resposta de Concentração de 
Lipídeos (Figura 7B), nenhuma das variáveis se mostrou significativa, entretanto o modelo 
não se torna confiável devido às baixas concentrações de lipídeos observadas e suas 
oscilações. 
0 
0,5 
1 
1,5 
2 
2,5 
0 
5 
10 
15 
20 
25 
30 
35 
40 
45 
50 
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 
C
o
n
ce
n
tr
a
çã
o
 d
e 
li
p
íd
eo
s 
(g
/L
) 
C
o
n
ce
n
tr
a
çã
o
 d
e 
ce
lu
la
s 
(g
/L
) 
Ensaio 
Concentração de lipídeos 
Concentração celular 
25 
 
Figura 7 - Gráficos de Pareto que expressa as estimativas dos efeitos padronizados e limite de 
significância estatística para as respostas produção de biomassa (A) e de lipídeos (B). 
 
Fonte: o autor. 
 
Para confirmar a significância estatística dos efeitos principais e de suas 
interações sobre respostas de crescimento celular e concentração de lipídeos foi feita a análise 
da variância dos efeitos (Tabelas 5 e 6 respectivamente). Os termos considerados 
significativos foram os mesmos observados nos gráficos de Pareto. O coeficiente de 
correlação alcançado para a resposta concentração celular foi superior a 0,907, o que 
demonstra a relevância das variáveis estudadas. A influência das variáveis nesta resposta pode 
ser representadapor um modelo linear, visto que não apresentou nenhum efeito quadrático 
significativo dentro da região de variação avaliada. De um modo geral esta análise sugeriu 
que, a um nível de significância de 0,05, o modelo para produção de biomassa foi adequado 
para descrever o comportamento observado, visto que o coeficiente de correlação foi 
significativo e não apresentou falta de ajuste significativa, o que o valida e possibilita 
representá-lo por meio de superfície de resposta, ao passo que o modelo para a produção de 
lipídeos não foi adequado para descrever o comportamento observado, devido tanto ao baixo 
coeficiente de correlação, de 0,724, quanto à oscilação na concentração observada durante os 
cultivos. 
 
 
 
 
 
(A) (B) 
26 
 
Tabela 5 - Análise de variância dos efeitos principais e de interações dos fatores sobre a 
concentração celular. 
Fonte de variação Soma Quadrática Nº de g.l. Média Quadrática p 
Agitação - A 517,4531 1 517,4531 0,002055 * 
A² 0,5862 1 0,5862 0,851461 
Vfrasco/Vmeio - B 206,1548 1 206,1548 0,014038 * 
B² 11,4283 1 11,4283 0,423825 
AB 6,5792 1 6,5792 0,538135 
Residual 75,4013 5 15,08032 
Total 817,0365 10 
R²= 90,771% 
* Significativo a 95% de confiança. 
Fonte: o autor. 
 
Tabela 6 - Análise de variância dos efeitos principais e de interações dos fatores sobre a 
concentração de lipídeos. 
Fonte de variação Soma Quadrática Nº de g.l. Média Quadrática p 
Agitação - A 0,930313 1 0,930313 0,05438 
A² 0,475434 1 0,475434 0,13375 
Vfrasco/Vmeio - B 0,005222 1 0,005222 0,85870 
B² 0,741430 1 0,741430 0,07585 
AB 0,054056 1 0,054056 0,57280 
Residual 0,743291 5 0,148658 
Total 2,702012 10 
R²= 72,491% 
Fonte: o autor. 
 
A Figura 8 apresenta o gráfico da superfície de resposta que descreve a 
concentração celular em 120 horas de cultivo em função das variáveis agitação e razão 
27 
 
Vfrasco/Vmeio. Nota-se que o aumento das variáveis avaliadas leva a um aumento na 
concentração de biomassa, ou seja, leva a um aumento positivo sobre a resposta. Dentro da 
região de variação observada o aumento da agitação apresentou um efeito mais pronunciado 
sobre a resposta quando comparado ao efeito da variável razão Vfrasco/Vmeio. A concentração 
máxima de célula, de 43,470 g/L, foi obtida no nível +1 de agitação e +1 de Vfrasco/Vmeio, que 
correspondem a 250 rpm e 5:1, respectivamente. 
Dentro da região de variação estudada, não foi observada a ocorrência de um 
ponto ótimo. De um modo geral, os resultados sugerem que maiores concentrações de células 
poderiam ser alcançadas aumentando-se a agitação ou reduzindo a ração Vfrasco/Vmeio, ou seja, 
proporcionado maiores níveis de oxigenação ao meio de cultivo. Apesar da tendência 
observada, ensaios com maiores agitações não puderam ser desenvolvidos devido à limitação 
dos equipamentos utilizados. A agitação foi limitada a 250 rpm, uma vez que está é a máxima 
agitação possível de atingida na incubadora de agitação orbital disponível para o trabalho. 
Também não foi possível aumentar significativamente a razão Vfrasco/Vmeio devido ao baixo 
volume de meio de cultivo no frasco agitado. 
 
Figura 8 - Superfície de resposta que relaciona a produção de biomassa com a relação 
Vfrasco/Vmeio e agitação. 
 
Fonte: o autor. 
28 
 
6 CONCLUSÃO 
 
A adaptação de metodologias para a determinação de óleos microbianos por 
espectrofotometria possibilitou o acompanhamento da produção de lipídios pela levedura, o 
que viabilizou a quantificação em pequenos volumes de amostra, ou seja, em quantidade de 
células presentes em cerca de 1 mL do meio de cultivo. 
 Os ensaios realizados consistiram em diferentes agitações e razões de volume de 
frasco por volume de meio, sendo que a levedura avaliada foi capaz de consumir glicerol, 
crescer e acumular lipídios nas condições de cultivo avaliadas e pôde-se observar que seu 
crescimento foi fortemente afetado pela condição de fornecimento de oxigênio no meio, 
porém a quantidade de lipídeo acumulado não foi satisfatória o suficiente para adequá-la a 
modelos matemáticos. Verificou-se ainda que quanto maior a disponibilidade de oxigênio no 
meio, maior foi a concentração celular. A tendência observada na análise dos resultados 
sugere que maiores concentrações celulares devem ser obtidas com o aumento dos níveis de 
oxigenação, entretanto, devido a limitações físicas dos equipamentos utilizados, condições de 
maior agitação não puderam ser avaliadas em frascos agitados. Desta forma, novos estudos 
em equipamentos que permitam condições de maior fornecimento de oxigênio, como 
biorreatores, podem ser uma alternativa para estabelecer condições mais propícias para a 
produção e acúmulo de óleo microbiano. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
29 
 
REFERÊNCIAS 
 
 
 AKASAKA, Milena T. Hidroesterificação de óleos vegetais de elevada acidez utilizando 
catalisadores heterogêneos ácidos. Lorena: Departamento de Engenharia Química, Escola 
de Engenharia de Lorena/USP, 2015. 
AMORIM, Lucio M. de; ROSA, Priscila D. da; VALENTE, Patricia. Extração lipídica em 
leveduras oleaginosas de queijo artesanal. Porto Alegre: Programa de Pós-Graduação em 
Microbiologia Agrícola e do Meio Ambiente, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, 
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2013. Disponível em: 
http://www.lume.ufrgs.br/handle/10183/96801. Acesso em 02/jan/2016. 
ARISTIZÁBAL, Ruth Verónica S. Produção de leveduras oleaginosas em meio de cultura 
contendo hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar. Campinas: Faculdade de Engenharia 
Química/UNICAMP, 2013. Disponível em: http://www.bv.fapesp.br/en/publicacao/74931/. 
Acesso em 02/jan/2016. 
BARBOSA, Grazielly N.; PASQUALETTO, Antônio. Aproveitamento do óleo residual de 
fritura na produção de biodiesel. Goiânia: Departamento de Engenharia Ambiental, 
Universidade Católica de Goiás, 2007. 
BASTOS, Cristiana de S. Utilização de resíduos da produção de biodiesel como base de 
meio de cultura para leveduras de interesse comercial. Ouro Preto: Programa de Pós-
Graduação Mestrado em Biotecnologia, Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, 
Universidade Federal de Ouro Preto, 2011. Disponível em: 
http://www.nupeb.ufop.br/biotec/arquivos/dissertacoes/Defesas2011/CRISTIANA-DE-
SOUZA_Dissertacao.pdf. Acesso em 21/dez/2015. 
BEOPOULOS, A.; CESCUT, J.; HADDOUCHE, R.; URIBELARREA, J. L.; MOLINA-
JOUVE, C.; NICAUD, J. M. Yarrowia lipolytica as a model for bio-oil production. 
Progress in Lipid Research, v. 48, n. 6, p. 375-387, Nov 2009. 
BIODIESELBR. PróAlcool: Programa brasileiro de álcool. Publicado em 2006. Disponível 
em: http://www.biodieselbr.com/proalcool/pro-alcool/programa-etanol.htm. Acesso em 
21/dez/2015. 
CHISTI, Y. Biotechnol. Adv. 2007, 25, 294. [CrossRef] 
DABDOUB, Miguel J.; BRONZEL, João L. Biodiesel: visão crítica do status atual e 
perspectivas a academia e na indústria. Ribeirão Preto: Departamento de Química, Faculdade 
de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto/USP, 2009. Publicado em Química Nova, 
30 
 
Vol. 32, No. 3. Disponível em: http://www.scielo.br/pdf/qn/v32n3/a21v32n3.pdf. Acesso em: 
21/dez/2015. 
EIA. International Energy Outlook 2010: U.S. Energy Information Administration. 2010. 
EIA. International Energy Outlook 2013: U.S. Energy Information Administration. 2013. 
IASSANOVA, Diliara R. Lipid synthesis and encapsulation by Cryptococcus curvatus. 
Iowa: Iowa State University, 2009. Disponível em: http://lib.dr.iastate.edu/etd/10592/. Acesso 
em 02/jan/2016. 
MENG, X.; YANG, J.; XU, X.; ZHANG, L.; NIE, Q.; XIAN, M. Biodiesel production from 
oleaginous microorganisms.Renewable Energy, v. 34, n. 1, p. 1-5, 2009. 
MINISTÉRIO DE MINAS E ENERGIA. Resenha energética brasileira. Exercício de 2014, 
edição de junho de 2015. Disponível em: 
http://www.mme.gov.br/documents/1138787/1732840/Resenha+Energ%C3%A9tica+-
+Brasil+2015.pdf/4e6b9a34-6b2e-48fa-9ef8-dc7008470bf2. Acesso em 26/dez/2015. 
PALUDO, Graziela B. Microrganismos geneticamente modificados e sua relação com o 
aumento na produção de biocombustíveis. Palmas: Mestrado em Agronomia, Universidade 
Federal do Tocantins, 2014. Publicado na Enciclopédia Biosfera, Centro Científico Conhecer, 
Vol. 10, No. 18. 
PETROBRAS. Biocombustíveis: 50 perguntas e respostas sobre este novo mercado. Projeto 
editorial, pesquisa e redação Newsday Consultoria de comunicação e Marketing, 2007. 
RAMOS, L. P.; MANGRICH, A. S.; CORDEIRO, C. S. Tecnologias de produção de 
biodiesel. Curitiba: Departamento de Química, Centro de Pesquisa em Química Aplicada, 
Universidade Federal do Paraná, 2011. Publicado na Revista Virtual de Química, Vol. 3, No. 
5. Disponível em: http://www.uff.br/RVQ/index.php/rvq/article/viewArticle/190. Acesso em 
21/dez/2015. 
ROCCA, Daniela G. D.; TODESCATO, Diego; MAASS, Danielle; OLIVEIRA, Débora; 
SOUZA, Selene M. A. G. U. de; SOUZA, Antônio Augusto U. de. Estudo das condições de 
crescimento do Rhodococcus erythropolis ATCC 1277. Florianópolis: Laboratório de 
Transferência de Massa, Departamento de Engenharia Química e Engenharia de Alimentos, 
Universidade Federal de Santa Catarina, 2014. Publicado no XX Congresso Brasileiro de 
Engenharia Química. Disponível em: 
http://pdf.blucher.com.br/chemicalengineeringproceedings/cobeq2014/1199-20513-
145136.pdf. Acesso em: 21/dez/2015. 
31 
 
SANTOS, Ana Paulo B.; PINTO, Angelo C. Biodiesel: Uma alternativa de combustível 
limpo. Publicado em Química Nova na Escola, Vol. 31, No. 1, 2009. Disponível em: 
http://www.qnesc.sbq.org.br/online/qnesc31_1/11-EEQ-3707.pdf. Acesso em 21/dez/2015. 
SANTOS, Fernando A.; QUEIRÓZ, José H. de; COLODETTE, Jorge L.; FERNANDES, 
Sergio A.; GUIMARÃES, Valéria M.; REZENDE, Sebastião T.. Potencial da palha de 
cana-de-açúcar para produção de etanol. Universidade Federal de Viçosa, MG, 2012. 
Disponível em: http://quimicanova.sbq.org.br/imagebank/pdf/Vol35No5_1004_24-
RV11835_cor.pdf. Acesso em 30/mar/2016. 
SIQUEIRA, Filipe da S. Bioprospecção de leveduras oleaginosas capazes de utilizar o 
glicerol bruto como fonte de carbono. Ouro Preto: Laboratório de Biologia Celular e 
Molecular, Núcleo de Pesquisa em Ciência Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, 
2015. Disponível em: http://repositorio.sisbin.ufop.br/handle/123456789/4736. Acesso em 
02/jan/2016. 
SOUSA, Rainer. História dos combustíveis. Brasil Escola, 2012. Disponível em: 
http://brasilescola.uol.com.br/historia/historia-dos-combustiveis.htm. Acesso em 21/dez/2015. 
THIRU, Meikandhan; SANKH, Santosh; RANGASWAMY, Vidhya. Process for biodiesel 
production from Cryptococcus curvatus. Publicado em Bioresource Technology, editora 
Elsevier, Vol. 102, No. 22, 2011. Disponível em: 
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852411012120. Acesso em 
02/jan/2016. 
TOMA, Júlio M. Efeito da adição de oxigênio na produção de glicerol quiase pela 
Levedura recombinante de Pichia pastoris. Araraquara: Departamento de Alimentos e 
Nutrição, Faculdade de Ciências Farmacêuticas/UNESP, 2011. Disponível em: 
http://repositorio.unesp.br/handle/11449/121594. Acesso em: 21/dez/2015. 
ZHAO, X.; KONG, X. L.; HUA, Y. Y.; FENG, B.; ZHAO, Z. B. Medium optimization for 
lipid production through co-fermentation of glucose and xylose by the oleaginous yeast 
Lipomyces starkeyi. European Journal of Lipid Science and Technology, v. 110, n. 5, p. 405-
412, 2008. 
ZHAO, X.; HU, C.; WU, S.; SHEN, H.; ZHAO, Z. K. Lipid production by 
Rhodosporidium toruloides Y4 using different substrate feeding strategies. J Ind 
Microbiol Biotechnol, v. 38, n. 5, p. 627-32, May 2011.