Imunofluorescência

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imunofluorescência
Discentes:
Adriane jardim
Cristiane ferreira
Daisy c. m. dos santos
Gabriella s.l. ferraz
Isadora lulio
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Introdução
As respostas imunes são úteis de dois modos para diagnosticar uma doença
Anticorpos específicos podem ser utilizados para detectar ou identificar um antígeno de interesse.
Através da detecção de anticorpos específicos no soro, pode-se determinar uma prévia exposição a um agente infeccioso.
A mensuração das interações Ag x Ac com o propósito de diagnóstico é denominada SOROLOGIA.
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As técnicas sorológicas podem ser classificadas em três grandes categorias
Testes de ligação primária
Mensura diretamente a ligação do Ag x Ac
Permitem o reconhecimento do Ag pelo Ac e os complexos imunes formados são, então, mensurados.
Para mensuração desta reação, um dos reagentes deve estar quimicamente marcado
Testes de ligação secundária
Mensura os resultados da interação Ag x Ac in vitro.
Testes terciários
Compreende os testes in vivo, que mensuram o real efeito protetor dos Acs em um animal.
Introdução
Radioimunoensaios;
Ensaios de imunofluorescência;
Ensaios imunoenzimáticos;
Citometria de fluxo.
imunofluorescência
Utiliza anticorpos para identificar a distribuição anatômica de um antígeno dentro de um tecido ou dentro de compartimentos de uma célula;
Essencial no diagnóstico de dermatoses bolhosas autoimunes e desordens inflamatórias através da detecção de imunocomplexos in situ e/ou circulantes; 
Utiliza marcadores como fluorocromos e enzimas;
Na leitura das reações , devem-se enumerar três formas distintas de fluorescência: específica, não específica e autofluorescência;
Existem dois tipos de imunoflorescencia: a direta e a indireta
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Imunofluorescência direta
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Os princípios da imunofluorescência direta começaram em 1942, quando dois cientistas demonstraram a marcação de anticorpos antipneumococos com fluoresceína, no tecido pulmonar;
Na reação de IFD, o anticorpo do conjugado anticorpo-fluoróforo, é primário, isso significa que ele é específico ao antígeno que se deseja detectar. Portanto, a ligação entre o conjugado e o antígeno é direta;
A IFD é utilizada para identificar fenótipos de células tumorais e diagnosticar doenças imunológicas relacionadas a pele e rins, devido o fato de o antígeno normalmente se encontrar na superfície celular de células e de microrganismos;
Imunofluorescência direta
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Os fluoróforos são os principais corantes utilizados na técnica de imunofluorescência;
Absorvem radiação (luz ultravioleta) são excitados por ela e emitem luz visível;
Para funcionar como marcadores, esses corantes necessitam possuir grupos químicos capazes de formar ligações covalentes com moléculas proteicas, emitindo alta fluorescência no espectro visível com coloração distinta da emitida pelos tecidos;
A conjugação deve ser simples, retenção da atividade do anticorpo na proteína marcada e estabilidade do conjugado fluorescente obtido;
Um dos fluoróforos mais utilizados é o isotiocianato de fluoresceína (FITC), de cor verde e o rodamina de cor vermelha;
O microscópio utilizado para a leitura do IFD pode ser o de epiluminescência ou confocal.
Corantes utilizados no teste de imunofluorescência
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Corantes utilizados no teste de imunofluorescência
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Os resultados desses testes são observados por meio da emissão de luz fluorescente, através de um microscópio que esteja em boas condições para a visualização;
Uma vantagem importante das reações de imunofluorescência, é que há emissão de luminosidade intensa, mesmo com a quantidade de fluoróforo ligado ao complexo reduzida;
Uma observação relevante, é que o pH do meio em que a reação ocorre deve estar adequado, pois quanto mais básico for o meio, maior é a intensidade da fluorescência emitida. Portanto, é viável que o material seja preparado em meio com glicerina tamponada alcalina para em seguida ser observado no microscópio.
Microscópio para imunofluorescência
Imunofluorescência Indireta
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Apresenta importante auxílio diagnóstico nas dermatoses vesicobolhosas autoimunes (DVB) e permite avaliar auto anticorpos circulantes;
Utiliza como substrato o epitélio normal, dentre os quais destacam-se o Prepúcio, Mama e Pálpebra devido sua fácil obtenção e boa antigenicidade.
Imunofluorescência indireta
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Preparo da imunofluorescência indireta
VANTAGENS E DESVANTAGENS DA IMUNOFLUORESCÊNCIA
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DESVANTAGENS
Microscópio de fluorescência; 
Diminuição da fluorescência;
Sob irradiação; subjetividade na leitura;
Ausência de automação.
VANTAGENS
Limiar de detecção;
Específica; 
Reprodutível; 
Simples execução;
Determinação de classes e subclasses de anticorpos.
APLICAÇÕES DA Imunofluorescência
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Indicado para:
detecção de vírus;
parasitas;
antígenos de tumor de amostras;
monocamadas de células do paciente;
utilizado na identificação da distribuição de um antígeno no interior de um tecido ou compartimento de uma célula.
Imunofluorescência Direta 
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Aplicação da técnica de imunofluorescência direta para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina em aspirado de linfonodo (MOREIRA et.al., 2002)
Cães atendidos no Hospital Veterinário do Curso de Medicina Veterinária da UNESP, Araçatuba em 2000.
Leishmaniose visceral: importante endemia brasileira causada pela Leishmania chagasi;
Transmitida ao homem por picada do mosquito Lutzomyia longipalpis, tem como reservatório canídeos silvestres e domésticos;
Artigo científico
Artigo científico
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RESULTADO
Método de imunofluorescência direta (IFD) apresentou maior sensibilidade quando comparado a pesquisa direta do parasito pela coloração de Romanowsky. 
DIAGNÓSTICO INDIRETO
Pesquisa de anticorpos em soro, pode ser feito métodos como o de 2. imunofluorescência indireta. 
Realizado a partir de esfregaços de punção de linfonodo poplíteo corados pelo método de Romanowsky (Diff-Quik®). 
Com o objetivo de aprimorar o diagnóstico em regiões endêmicas, foi aplicado (artigo) o método de imunofluorescência direta para a pesquisa de parasitos e seus produtos antigênicos nos esfregaços de biópsia aspirativa de linfonodos de cães com sinais clínicos da doença.
Artigo científico
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Habitualmente utilizada para:
Detecção de auto-anticorpos;
Detecção de anticorpos anti-nucleares encontrados no soro de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico.
Imunofluorescência Indireta 
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Reação baseada na interação do próprio T. cruzi (formas epimastigotas) com os anticorpos contra esse parasita presentes no soro.
Teste sorológico utilizados para a detecção da infecção pelo T. cruzi 
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Introduzida na década de 60;
Beutner e Jordon revelaram anticorpos tanto no tecido como circulantes nas dermatoses vesicobolhosas autoimunes, especialmente, nos pênfigos vulgar e foliáceo e penfigoide bolhoso;
Atualmente, os estudos de imunofluorescência são determinantes no diagnóstico laboratorial das dermatoses bolhosas autoimunes;
Desempenham importante papel na investigação de outras enfermidades, como: dermatoses inflamatórias (lúpus eritematoso, líquen plano, porfírias, vasculites).
A imunofluorescência na Dermatologia 
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Pênfigo foliáceo: IgG linear, intercelular, intraepitelial. 
Pênfigo vulgar: C3 linear, intercelular, camadas inferiores do epitélio.
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Aoki V, Huang MH, Perigo AM, Fukumori LM, Maruta CW, Santi CG, et al. Endemic pemphigus foliaceus (fogo selvagem) and pemphigus vulgaris: immunoglobulin G heterogeneity detected by indirect immunofluorescence. Rev Hosp Clin Fac Med Sao Paulo. 2004;59:251-6. 
Beutner EH, Jordon RE. Demonstration of Skin Antibodies in Sera of Pemphigus Vulgaris Patients by Indirect Immunofluorescent Staining. Proc Soc Exp Biol Med. 1964;117:505-10. 
BRAMMER, Sandra, TONIAZZO, Claudia, POERSCH, Liane. Corantes comumente empregados na citogenética vegetal. Biotechnology / Scientific Communication, São Paulo, v. 82, p. 1-8, 2015.
Doença de Chagas – Triagem e diagnóstico sorológico em unidadeshemoterápicas e laboratórios de saúde público. – Brasília: Ministério da Saúde, Coordenação Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e Aids. 1998. 76. p. : il (Série TELELAB)
Jordon RE, Beutner EH, Witebsky E, Blumental G, Hale WL, Lever WF. Basement zone antibodies in bullous pemphigoid. JAMA. 1967;29;200:751-6
MEDINA, Norma H., et al. Análise de exames de imunofluorescência direta para o diagnóstico de tracoma. Revista de saúde Pública, São Paulo, v. 30, n. 2, 135-40, 1996.
MOREIRA, M.A.B.; LUVIZOTTO, M.C.R.; NUNES, C.M.; SILVA, T.C.C.; LAURENTI, M.D.; CORBETT, C.E.P. Aplicação da técnica de imunofluorescência direta para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina em aspirado de linfonodo. Braz. J. vet. Res. anim. Sci., São Paulo, v.39, n.2, p. 103-106, 2002.
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Referências
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