RELATORIO FUNGOS FILAMENTOSOS E COLORAÇÃO GRAM

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RELATÓRIO AULA PRATÍCA INOCULAÇÃO E OBSERVAÇÃO DE FUNGOS FILAMENTOSOS, EXPERIMENTO DE COLORAÇÃO DE GRAM E INOCULAÇÃO DE BACTÉRIAS POR ESPALHAMENTO
(Aula 4)
Sumário 
Introdução.................................................................................................................. 1
Objetivo..................................................................................................................... 2
Materiais utilizados...............................................................................................3 e 4
Metodologia..........................................................................................................5 a 8
Inoculação de fungos filamentosos..................................................................... 5
Análise microscópica...........................................................................................5
Inoculação de bactérias por espalhamento...........................................................6
Experimento de coloração de Gram...............................................................6 a 8
Resultados e discussões......................................................................................9 e 10
Conclusão .............................................................................................................. 11
Referências bibliográficas.......................................................................................12
Introdução 
“Das mais de 100 mil espécies conhecidas de fungos, apenas cerca de 200 são patogênicos aos seres humanos e aos animais.” (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017)
 Os fungos são organismos que podem ser macro ou microscópicos, pertencentes a um reino exclusivo, o Reino Fungi. São eucarióticos e quimioheterotróficos – fonte de energia e fonte de carbono são de compostos orgânicos -. Alguns decompõem a matéria orgânica, outros são causadores de doenças e outra parte é utilizada na alimentação. Os fungos filamentosos compõem o grupo microbiano com maior número de espécies e apresentam uma enorme variedade quanto a morfologia e a suas características bioquímicas e fisiológicas. Essa diversidade tem possibilitado o homem a fazer a exploração de alguns tipos de fungos. 
Os fungos filamentosos possuem o talo, que é o corpo de um fungo filamentoso e consiste em longos filamentos de células de células conectadas. Esses filamentos são chamados de hifas. As hifas podem crescer em proporções imensas, a maioria dos fungos 0filamentosos possuem hifas com paredes cruzadas chamadas de septos, que dividem as hifas em unidades semelhantes as células uninucleadas distintas, ou seja, cada hifa possui apenas um núcleo por septo. Essas hifas são denominadas hifas septadas. Em menor número, existem classes de fungos que as hifas não contém septos e se apresentam como células longas e contínuas com muitos núcleos, sendo denominadas hifas cenóticas ou hifas não septadas.
Ao realizarmos o processo de observação e inoculação de fungos filamentosos, conseguimos observar no microscópio se o fungo coletado possuía hifas septadas ou não septadas. Além disso efetuamos o processo de inoculação de fungos filamentosos em um meio de cultura específico para fungos e suas peculiaridades, sendo esse meio o Ágar Saboraud, que favorece o crescimento de fungos tanto os leveduriformes quando os filamentosos.
O processo de identificação dos microrganismos na natureza sem a criação de métodos que facilitem sua visualização é de grande dificuldade já que esses seres dificilmente são observados sem a ajuda de um microscópio, além de serem necessários procedimentos que ajudem na caracterização e diferenciação dos mesmos. Sendo assim, um desses métodos criados foi a Coloração de Gram que foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista dinamarquês Hans Christian Gram. Ela é um dos processos mais úteis, pois classifica as bactérias em dois grandes grupos: gram-positivas e gram-negativas. 
Para isolar o microrganismo e começar sua análise realizamos a inoculação por espalhamento, um método que realiza a contaminação proposital de um meio de cultura, ou seja, ocorre a passagem de um número de organismos de um meio de cultura ou material a ser analisado para outro meio de cultura, com o propósito que os microrganismos ali presentes se desenvolvam e permitam a identificação. Para assegurar que apenas os microrganismos desejados sejam inoculados, são utilizadas técnicas assépticas: procedimentos que devem ser seguidos visando a não contaminação de materiais e meios de culturas.
Objetivo 
Realizar o processo de inoculação e observação dos fungos filamentosos no microscópio, com o objetivo de classificar suas hifas em septadas ou não septadas. Além disso, a efetuação do processo de coloração de bactérias pelo experimento de Gram.
Materiais utilizados 
Inoculação e observação de fungos filamentosos
- Lâmina de vidro
- Lamínula
- Conta gotas ou pipeta descartável 
- Água (2 gotas)
- Microscópio: visualização
-Amostra: Pão em processo de decomposição
- Alça de platina
- Ágar Saboraud (1 unidade)
- Álcool 70% e papel toalha: Higienização e desinfecção da bancada e do bico de Bunsen.
- Bico de Bunsen: Efetuar esterilização de objetos de uso do laboratório e manter o ambiente de trabalho asséptico.
Inoculação de bactérias por espalhamento
-Alça de Drigalski: Realizar o espalhamento da amostra por toda a placa de Petri
- Ponteiras da pipetadora
- Pipetadora (100 µm)
- Amostra: Doce de leite
- Ágar nutriente (1 unidade)
- Bico de Bunsen :Efetuar esterilização de objetos de uso do laboratório e manter o ambiente de trabalho asséptico.
- Álcool 70% e papel toalha: Higienização e desinfecção da bancada e do bico de Bunsen.
-Estufa bacteriológica (T°C 37)
• Experimento de coloração de Gram
- Lâmina de vidro
- Alça de platina
- Água destilada
- Cristal violeta
- Lugol
- Álcool/ acetona
- Fucsina 
- Bico de Bunsen: Efetuar esterilização de objetos de uso do laboratório e manter o ambiente de trabalho asséptico.
	
- Amostra: Carne
Metodologia 
Antes da iniciação das atividades foram higienizadas as mãos dos realizadores dos procedimentos, lavando-as com água e sabão, além da utilização de álcool. Posteriormente, com o auxílio de álcool 70% e papel toalha, realizamos a higienização da bancada e do Bico de Bunsen a serem utilizados. A limpeza ocorria de maneira que o papel toalha não fosse utilizado mais de uma vez no mesmo lado e o sentido da limpeza acontecia com movimentos em linha reta limpando a bancada do centro as extremidades. Objetivando a garantia de que somente o organismo desejado seria inoculado. 
 Logo após, com o auxílio do professor, o Bico de Bunsen foi aceso e foi percebido que a chama estava amarelada não possuindo uma temperatura suficiente para o aquecimento - pela falta de oxigênio e presença de impurezas -, para conseguir uma chama com maior temperatura, a entrada de ar deve ser aberta até que a chama fique azul permitindo a entrada de oxigênio, tornando a queima mais eficiente. A utilização do bico de Bunsen tinha o objetivo de flambar a alça de platina e a boca dos tubos de amostras. Todos os passos foram realizados próximos a chama do Bico de Bunsen, este também tinha o objetivo de proporcionar um ambiente asséptico ao redor de todo o espaço da bancada onde estávamos trabalhando, diminuindo os riscos de contaminações provenientes do meio externo.
Inoculação de Fungos filamentosos
Nesta técnica, utilizamos como meio de cultura o Ágar Saboraud, que tem como características visuais, um amarelado claro opalescente. Esse meio contém peptonas e é utilizado especificamente para cultivo e isolamento de diversos fungos leveduriformes e filamentosos. No desenvolvimento da técnica, trabalhamos com o fungo classificado como Rhizopus, espécie de agentes infecciosos que contaminam o pão.
Primeiramente,com o bico de Bunsen aceso flambamos a alça de platina e esfriamos na extremidade da placa, em seguida coletamos uma pequena quantidade do pão infectado e depositamos no cento da placa de Petri. Em seguida aquela amostra inoculada ficaria reservada a temperatura ambiente por mais ou menos quatro dias, o tempo médio para a proliferação.
4.2 Análise microscópica
Com o intuito de visualizar o fungo através de microscopia, e identificar sua classificação, realizamos os seguintes passos utilizamos o pão contendo fungo Rhizopus: O bico de Bunsen já se encontrava aceso, nos possibilitando a continuação com a segurança de que não haveria contaminações, alterando nossos resultados.
Em um pedaço de papel toalha separamos uma lâmina para microscopia e uma lamínula. Utilizando o conta gotas ou pipeta descartável, pingamos no centro da lâmina duas gotas de água. Com a alça de platina flambada e esfriada na extremidade da placa de Petri onde só estava presente meio de cultura, pescamos uma pequena quantidade do pão infectado e dissolvemos na água presente na lâmina. Feito isso, flambamos novamente a alça de platina e colocamos acima da amostra uma lamínula e levamos ao microscópio, podendo identificar a classificação dos fungos.
 Inoculação de bactérias por espalhamento
Acendemos o bico de Bunsen e iniciamos fazendo a escolha de uma amostra – doce de leite -. Após, utilizando uma pipetadora, pescamos uma ponteira que se encontrava em meio estéril. O objetivo da pipetadora era promover a aspiração e realizar a inoculação da amostra corretamente. Antes da inoculação, utilizamos o polegar e mantemos a pipetadora em primeiro estágio, flambamos o tubo que continha a amostra, em seguida capturamos a amostra com a pipetadora e novamente flambamos o tubo para fechá-lo. Durante a coleta da amostra retiramos o polegar para que a solução seja aspirada. Sendo importante manter a pipetadora sempre com a ponteira para baixo.
No cento da placa contendo Ágar Nutriente dispensamos a inoculação em duas gotas, cada uma correspondente a um estágio da pipetadora, primeira gota, pressiona o botão com o polegar até o primeiro estágio. Segunda gota, pressionando mais um pouco até o segundo estágio, de modo que toda a amostra seja dispensada. Caso fique alguma gota da amostra na ponteira da pipetadora após a inoculação, basta encostá-la delicadamente ao meio de cultura da placa. Na sequência descartamos num béquer a ponteira da pipetadora.
 - O Próximo passo é o espalhamento utilizando a alça de Drigalski:
Ainda com o bico de Bunsen aceso, mergulhamos a alça de Drigalski no álcool 70% e flambamos, foi apresentado uma chama não protuberante devido ao álcool utilizado não ser puro. Repetimos esse processo mais uma vez, com um intervalo entre as flambagens para que ocorresse o resfriamento da alça, não correndo o risco do fogo se espalhar pelo álcool. Ao fim da segunda flambagem, esfriamos a alça de Drigalski na tampa da placa de Petri e em seguida, espalhamos a amostra por toda superfície do Ágar nutriente. Flambanos novamente a alça de Drigalski para terminar o seu uso. A amostra inoculada deveria ser armazenada na estufa bacteriológica por 24 horas na temperatura de 37°C.
Experimento de Coloração de Gram
Essa técnica é muito utilizada para classificar as bactérias em dois grandes grupos: gram-positivas e gram-negativas. Consiste em efetuar um esfregaço de uma amostra e adicionar alguns reagentes e posteriormente em microscópio óptico realizar a visualização e identificação das características presentes. Nesta técnica dispomos de 4 reagentes, os quais agirão diretamente na parede celular das bactérias, são eles:
• Cristal violeta: Coloração primária, a qual possui afinidade tanto na parede celular das bactérias gram-positivas, quanto das gram-negativas.
• Lugol: Também conhecido como mordente é uma substância rica de em iodo que faz a fixação do cristal violeta. Esse reagente só faz a fixação eficaz nas bactérias gram-positivas.
• Solvente orgânico Álcool/acetona: É o agente descolorante utilizado para descorar algumas das bactérias, descorando com mais eficiência as gram-negativas, por apresentarem o cristal violeta de forma insolúvel bem fixado na sua parede celular.
• Fuscina: Corante secundário que fará a coloração das gram-negativas que estavam descoradas após o uso do álcool/acetona.
A técnica para corar bactérias – coloração de Gram – refere-se à composição da parede celular, sendo que as gram-negativas possuem uma espessa camada de peptideoglicano e ácido teicóico. E as gram-positivas, uma fina camada de peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e lipopolissacarídeos. Durante o processo de coloração, o tratamento com álcool-acetona extrai os lipídeos, daí resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias Gram-negativas.
Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CVI) pode ser retirado e as bactérias gram-negativas são descoradas. A parede celular das bactérias gram-positivas, em virtude de sua composição diferente, torna-se desidratada durante o tratamento com álcool-acetona, a porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o complexo CVI não pode ser extraído.
Outra explicação baseia-se também em diferenças de permeabilidade entre os dois grupos de bactérias. Nas Gram-positivas, o complexo CVI é retido na parede após tratamento pelo álcool-acetona, o que causa, possivelmente, uma diminuição do diâmetro dos poros da camada de glicopeptídeo ou peptideoglicano da parede celular. A parede das bactérias Gram-negativas permanece com porosidade suficientemente grande, mesmo depois do tratamento com álcool-acetona, possibilitando a extração do complexo CVl.
- Procedimentos:
Preparar o esfregaço.
Corar os esfregaços pelo método de coloração de Gram.
Observar ao microscópio óptico, sob imersão e identificar a morfologia deste microrganismos e sua reação frente ao método de Gram.
- Preparo do esfregaço:
Nesse processo não era necessário a higienização do ambiente de trabalho, portanto começamos o procedimento. Usamos uma lâmina de microscopia limpa no recipiente e identificamos o lado da lâmina onde será feito o esfregaço, em seguida flambamos a alça bacteriológica e esfriamos na extremidade da placa. Abrimos a placa com a cultura teste próximo a chama do bico de Bunsen, coletamos as colônias e efetuamos o esfregaço do material na lâmina.
- Método de coloração de Gram
 Levamos as lâminas para a pia e lá demos início ao processo de coloração. Cobrimos toda a lâmina com solução cristal violeta (corante roxo) e aguardamos 1 minuto. Em seguida, lavamos rapidamente com água destilada. O próximo reagente utilizado foi o Lugol (mordente), foi deixado por 1 minuto. Dado o tempo aconteceu a lavagem com água destilada. Para descorar algumas das bactérias usamos o álcool/acetona, inclinamos a lâmina e logo em seguida lavamos com água destilada, para não descorar mais que o necessário. Por fim, adicionamos o corante fucsina e aguardamos 30 segundos, lavamos novamente a lâmina com água destilada e secamos cuidadosamente com o papel toalha. Levamos então para observação no microscópio. Na objetiva de 100 x, também chamada como objetiva de imersão, utilizamos o óleo de imersão, de modo que o índice de refração entre a lâmina e óleo fossem proporcional, permitindo uma melhor resolução.
Resultados e discussões 
Voltamos ao laboratório dia 29 de novembro para avaliar os resultados da inoculação de bactérias de espalhamento e da inoculação dos fungos filamentosos. O resultado da coloração de Gram observamos no mesmo dia que realizamos a atividade prática. Fizemos a análise, discussão e a coleta dos resultados sobre as placas do fungos e das bactérias.
Inoculação dos fungos
A nossa placa de Ágar Saboraud que foi inoculada com a amostra do pão em processo de decomposição. A amostra não apresentava nenhuma contaminação externa, porém a inoculação foi realizadaduas vezes no centro da placa em vez de apenas uma. Como consequência ocorreu o desenvolvimento de dois micélios – conjunto de hifas-. O crescimento do fungo ocorreu de forma centrifuga, o que significa que as hifas cresceram se afastando do centro em todas as direções. 
Ao efetuarmos a análise microscópica do fungos presente no pão, analisamos no microscópio os lugares mais espaçados e chegamos à conclusão que suas hifas são cenocíticas ou não septadas. Sendo caracterizadas por não apresentarem os septos que são paredes cruzadas e se apresentarem como células longas e contínuas com muitos núcleos.
Inoculação de bactérias por espalhamento
O procedimento foi realizado da maneira indicada e ao analisarmos a placa de Ágar nutriente deveríamos descrever as características da amostra em: coloração, odor – podre, adocicado ou ácido -, o número de colônias presente e se ocorreram contaminações externas. Coletamos os resultados tabelados abaixo:
	Amostra: Doce de leite
	Ágar Nutriente
	Cor
	Esbranquiçada
	Odor
	Adocicado
	Nº de UFC
	De 20 a 30 colônias
	Contaminações
	Não encontradas
Interpretação: Ao analisarmos a amostra de coloração esbranquiçada e odor adocicado e forte, era possível quantificar de 20 a 30 colônias presente na placa, acreditamos que não ocorreram contaminações porque as colônias apresentavam tamanhos similares e a mesma coloração.
Experimento de Coloração de Gram: 
“Uma coloração simples é uma solução aquosa ou alcoólica de um único corante básico. Embora diferentes corantes se liguem especificamente a diferentes partes das células, o objetivo primário de uma coloração simples é destacar todo o microrganismo, para que as formas celulares e as estruturas básicas fiquem visíveis” (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017)
Ao contrário das colorações simples, as colorações diferenciais como a coloração de Gram, reagem de forma diferente aos tipos de bactérias, e assim podem ser utilizadas para realizar a distinção entre ela. Com o fim do processo da coloração nos dirigimos ao microscópio para analisarmos os resultados. Deveríamos observar a forma, tamanho, morfologia celular e a propriedade tintorial das bactérias presentes na lâmina microscópica.
Com a observação na objetiva de imersão 100x, as bactérias coradas apresentavam uma coloração de azul a roxo sendo classificadas como gram-positivas, possuíam tamanhos semelhantes com formatos esféricos ou arredondados, sendo do tipo cocos.
Conclusão
A realização de testes básicos para identificação das características de organismos microscópicos como: o processo de inoculação e observação dos fungos filamentosos conseguimos visualizar a estrutura e coletar as características que nos possibilitaram perceber o diferencial entre as hifas septadas e cenocíticas, além de ser um método rápido e eficiente. Assim como, o mecanismo de inoculação de bactérias por espalhamento as bactérias foram bem distribuídas pela placa e observado tais aspectos: coloração, odor, número de colônias e a existência de contaminações.
 Já o método Coloração de Gram que nos permitiu concluir que existem diferenças significativas na composição da parede celular de bactérias gram-positivas e gram-negativas o mecanismo demonstrou-se um método eficiente de coloração diferencial, podendo-se, através dos resultados obtidos, diferenciar bactérias gram-positivas de gram-negativas, atuando como ferramenta auxiliar na identificação de bactérias fitopatogênicas. Todos os passos e procedimentos necessários para o método de inoculação e observação de fungos filamentosos, inoculação de bactérias por espalhamento e coloração de Gram foram feitos seguindo à risca as recomendações. Os objetivos foram alcançados, pois conseguimos identificar as propriedades dos fungos, na inoculação por espalhamento as bactérias foram bem distribuídas pela placa o que gerou bons resultados e no processo de coloração as bactérias gram-positivas e gram-negativas foram bem visualizadas e classificadas.
Referências bibliográficas 
VERMELHO, Alane Beatriz et al. Práticas de Microbiologia. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan Ltda, 2011. 256 p.
BLACK, Jacquelyn G. et al. Microbiologia: Fundamentos e Perspectivas. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002. 852 p. Eiler Fritsch Toros
TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R.; CASE, Christine L.. Microbiologia. 12. ed. Porto Alegre: Artmed Editora Sa, 2017. 964 p. Danielle Soares de Oliveira Daian.
CÂMARA, Brunno et al. ÁGAR SABOURAUD. , p.1. 22 mar. 2011. Disponível em: <https://www.biomedicinapadrao.com.br/2011/03/agar-sabouraud.html#.XAPctwxNboQ.whatsapp>. Acesso em: 02 dez. 2018.
BASTOS, Prof. Sidney T. G. et al. MEIOS DE CULTURA: Dept. de Micologia/CCB/UFPE, p. 1-10. nov. 2012. Disponível em: <https://pt.scribd.com/doc/113633897/Meios-de-Cultura-Para-Fungos>. Acesso em: 02 dez. 2018.