IMUNOFLUORESCÊNCIA - T gondii

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Universidade do Vale do Paraíba
Relatório de Imunologia Aplicada à Saúde
UNIVAP
PRÁTICA: IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA ANTI-TOXOPLASMA GONDII
Larissa Cavallieri
Maria Luiza Lopes
Biomedicina
Professor Antônio C. V. Canettieri
 São José dos Campos, SP 2019
INTRODUÇÃO
A técnica de imunofluorescência utiliza anticorpos marcados com corantes fluorescentes para revelar a formação de imunocomplexos vírus-anticorpo. Os anticorpos marcados são chamados de conjugados, e o corante fluorescente usado mais frequentemente é o isotiocianato de fluoresceína (FITC), o qual produz uma fluorescência verde-amarelada. Este fluorocromo tem a capacidade de absorver luz em comprimento de onda pequena e emitir energia na forma de luz em comprimento de onda maior que a recebida. Como o fluorocromo emite luz, para analisar o resultado é necessário um microscópio de fluorescência. 
A imunofluorescência pode ser classificada de dois modos, direta ou indireta. A direta ocorre quando o próprio antígeno é visualizado no microscópio de fluorescência com auxílio de anticorpo monoclonal conjugado a um fluorocromo. Já a imunofluorescência indireta, também chamada de dupla camada, consiste na detecção de anticorpos no soro do paciente por meio de antígenos fixados em uma lâmina, na qual se aplica primeiramente um anticorpo específico não fluorescente, e por fim, coloca-se um anticorpo fluorescente com especificidade marcada contra determinados antígenos do primeiro anticorpo usado para reagir com o antígeno. 
A toxoplasmose é uma doença causada pelo protozoário Toxoplasmagondii, que é capaz de parasitar células nucleadas e ultrapassar até mesmo a barreira placentária, podendo contaminar tanto a mãe quanto o feto, sendo este mais afetado, podendo ter deformações e problemas no sistema nervoso, podendo causar até mesmo aborto. Dessa forma, a busca por anticorpos anti-Toxoplasma gondii é uma forma de diagnosticar laboratorialmente a mulher que pretende ser mãe, permitindo maior atenção à saúde da mãe e feto. O anticorpo anti-Toxoplasma gondii pode ser evidenciado por meio do teste de imunofluorescência indireta.
OBJETIVO
 Realizar o teste teste de imunofluorescência indireta na busca por anticorpos anti-Toxoplasma gondii no soro humano.
METODOLOGIA
Kit WAMA contendo:
No Kit:
 - lâminas com suspensão de T. gondii; -anti-IgG humana marcada com isotiocianato de fluoresceína
- glicerina tamponada 
- corante azul de Evans
 - soros controle (positivo e negativo)
- lamínulas
Material para toda a turma:
 - Micropipetas de 100l, 25/30 l e 10 l e suas respectivas ponteiras 
- Quatro frascos com tampa, para colocação de lâminas, cheios de PBS 
- Quatro pissetas cheias de PBS (previamente preparado) 
- Eppendorfs vazios e com PBS
- Câmara de incubação (vasilha com tampa e algodão umedecido com água destilada) 
- Papel absorvente
PROCEDIMENTO
Consultar a bula do fabricante: 
Diluiu-se o soro 1/32: 310 l de PBS em 10 l de soro teste, no eppendorf. 
Retirou-se as lâminas do envelope, segurando apenas pelas laterais; 
Pingou-se uma gota do controle (soro controle), sem transbordar na área 1; 
Pingou-se uma gota do controle negativo (soro controle), sem transbordar na área 2;
Pingou-se os soros teste (1/32) nas positivo demais áreas da lâmina; 
Incubou-se em câmara úmida por 30 minutos, à temperatura ambiente; 
Após lavar a lâmina: 
A) A lâmina foi segurada pelas laterais e com a pisseta, foi lançado o PBS de modo que não atingisse diretamente as áreas das amostras.
B) Colocou-se as lâminas no frasco com PBS, e deixou-se submerso por 5 minutos, agitando delicadamente algumas vezes. Este procedimento foi repetido 3 vezes.
C) Após a última vez foi retirado o excesso de líquido com papel absorvente e secado em torno das áreas. 
Pingou-se uma gota do conjugado em cada área utilizada.
Incubou-se 30 minutos;
A lâmina foi novamente lavada conforme item 7. Foram pingados 2 a 3 gotas de azul de Evans no frasco na última lavagem. 
Pingou-se 3 a 4 gotas da glicerina tamponada entre as áreas reativas. Cobriu-se com a lamínula, evitando a formação de bolhas. Secar o excesso de glicerina. 
A lâmina foi reservada para que a leitura em microscópio de fluorescência fosse posteriormente realizada. Necessário evitar exposição a luz até a leitura.
Figura 1: Frascos com as lâminas Figura 2: Lâmina já coberta com a lamínula
Figura 3:
 Poço 1: Soro controle positivo
Poço 2: Soro controle negativo
Poço 3: Soro teste diluído.
RESULTADOS E CONCLUSÃO
Como apenas fizemos o experimento até a colocação da lamínula, não foi possível observar o resultado no microscópio. Porém, caso fosse continuado teríamos os seguintes resultados:
Reação negativa: Ausência de fluorescência amarelo-esverdeada em todo contorno do toxoplasma. Os parasitas exibem uma coloração avermelhada. 
Reação positiva: presença de fluorescência amarelo-esverdeada em todo contorno do toxoplasma.
 Figura 4: Representação de um resultado positivo para T. gondii 
Como não foi dado continuidade ao experimento pelo tempo escasso, não foram obtidos resultados finais a respeito deste experimento. Porém, após visualização da representação de um resultado positivo foi possível compreender melhor sobre o assunto.
Este é um teste extremamente importante que busca anticorpos anti-Toxoplasma Gondii por meio da Imunofluorescência Indireta, utilizando um microscópio de fluorescência. Para os resultados que derem reagente, observamos o parasita possuindo coloração esverdeada, para amostras não-reagentes, observamos colocação avermelhada.
QUESTÕES
a) Como se adquire a doença? 
- Ingestão de carne – bovina, suína ou de aves –, crua ou mal cozida, contendo cistos do protozoário. O consumo de leite cru, não pasteurizado, com presença de taquizoítos (uma outra forma do parasito) também consiste em uma fonte possível de infecção. Queijos preparados com leite não pasteurizado podem transmitir a doença.
- A forma mais grave de infecção é a transmissão transplacentária (a mãe transmite a doença para seu bebê durante a gravidez). Nesta forma de infecção, podem ocorrer malformações fetais e aborto.
- Através da ingestão de oocistos esporulados (forma que o protozoário adquire no meio ambiente) presentes nas fezes de um gato infectado. Ou seja: é preciso ingerir acidentalmente fezes contaminadas de gatos. Isto pode ocorrer através do consumo de verduras e legumes mal lavados ou pelo hábito de levar a mão à boca sem antes lavá-la, sobretudo após a prática de jardinagem ou outras formas de manipular terra e areia.
b) Qual é o papel dos gatos na transmissão da doença? Como eles se contaminam? 
O gato é o hospedeiro definitivo: é ele quem libera o parasito no ambiente. Gatos geralmente apresentam a doença quando filhotes e, nesta fase, podem eliminar os oocistos do protozoário nas fezes. Estima-se que apenas 1% da população felina elimine os cistos do protozoário T. gondii no ambiente.
o gato precisa ingerir oocistos esporulados de Toxoplasma presente na carne crua de outros animais conhecidos como hospedeiros intermediários ou ingerir oocistos eliminados nas fezes de outro gato infectado
c) Quais grupos populacionais são mais preocupantes em relação à infecção por Toxoplasma?
HIV/Aids – portadores da síndrome estão mais sujeitos à infecção pelo T.gondii e à reativação do parasita, que estava latente no organismo, porque o vírus da Aids ataca as células de defesa do organismo;
Tratamento quimioterápico – a quimioterapia pode provocar alterações no sistema imunológico que deixam o organismo mais vulnerável a infecções (redução dos leucócitos, os glóbulos brancos do sangue);
Uso de drogas esteroidais com ação anti-inflamatória e drogas imunossupressoras para evitar rejeição nos transplantes de órgãos;
Na gravidez,quando a mulher não possui anticorpos contra a doença (sorologia negativa), porque nunca esteve em contato com o parasita, ou quando está com o sistema imunológico deprimido.
d) Como a mulher gestante pode se prevenir? 
Não ingerir carne crua ou mal passada nem vegetais in natura, se não tiver a certeza de que foram higienizados convenientemente;
Lavar as mãos com água e sabão, depois de ter lidado com carne crua ou mal cozida e vegetais;
Caprichar na higiene dos utensílios de cozinha (facas, tábuas, colheres, escorredores), utilizados no preparo desses alimentos;
Evitar contato com as fezes de gatos ou de outros felinos. Usar luvas quando for mexer no jardim ou em vasos com terra;
e) É preciso se desfazer dos gatos da casa?
Não, pois o gato apenas transmite a doença através das fezes, o importante é apenas manter hábitos de higiene.
f) Interprete os seguintes resultados de exames sorológicos para Toxoplasma: 
1. IgM negativo ( não reagente) com IgG positivo (reagente): infecção antiga (meses ou anos já podem ter se passado desde a doença);
2. IgM negativo (não reagente) com IgG negativo (não reagente): infecção antiga (meses ou anos já podem ter se passado desde a doença);
3. IgM positivo (reagente) com IgG negativo (não reagente): Infecção recente (semanas ou meses já podem ter se passado desde a doença);
4. IgM positivo (reagente) e IgG positivo (reagente): Paciente está doente de toxoplasmose.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
IMUNO-CON TOXOPLASMOSE. 2016. Disponível em: <https://www.wamadiagnostica.com.br/bulas/imuno-con/Toxoplasmose-1.pdf>. Acesso em: 19 out. 2019.
TOXOPLASMOSE. -. Disponível em: <http://www0.rio.rj.gov.br/ijv/toxoplasmose.shtm>. Acesso em: 20 out. 2019.
PORTELLA, Luiza P. et al . Antibodies against Neospora caninum, Sarcocystis spp. and Toxoplasma gondii detected in buffaloes from Rio Grande do Sul, Brazil. Pesq. Vet. Bras.,  Rio de Janeiro ,  v. 36, n. 10, p. 947-950,  Oct.  2016 .   Available from <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-736X2016001000947&lng=en&nrm=iso>. access on  20  Oct.  2019.  http://dx.doi.org/10.1590/s0100-736x2016001000005.