Relatório aulas práticas :IMUNOLOGIA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA 
INSTITUTO DE CIÊNCIA DA SAÚDE 
BACHARELADO EM BIOTECNOLOGIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS 
 
 
 
 
 
 
Discente: Mariana Coutinho Silva 
 
 
 
 
 
 
 
 
Salvador- BA 
Novembro de 2019. 
 
 
 
Preparação de esfregaços e identificação de leucócitos 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
O esfregaço sanguíneo é um teste realizado em hematologia para a contagem de células 
sanguíneas, bem como para a análise dessas células. O objetivo desse teste é fornecer 
informações sobre a estimativa do número de leucócitos e plaquetas por meio da análise da 
morfologia das células , sendo uma ferramenta importante para investigar distúrbios , 
problemas hematológicos, bem como verificar a presença ou não de alguns parasitas. 
Os Leucócitos conhecidos também como glóbulos brancos não possuem coloração como 
as hemácias e são responsáveis pela defesa do organismo contra agentes infecciosos. 
Além disso, os leucócitos são divididos em granulócitos e agranulócitos; o primeiro grupo é 
formado por neutrófilos, basófilos e eosinófilos e o segundo grupo é formado por linfócitos e 
monócitos. 
★ Hemácias - coloração rósea 
★ Plaquetas - coloração violeta 
★ Linfócitos - núcleo grande e roxo com citoplasma azul 
★ Monócitos - células grandes , núcleo lobulado e azul violeta e citoplasma 
púrpura 
★ Neutrófilos - grânulos em tom de rosa claro e azul claro, núcleo multilobulado 
de cor roxo escuro e citoplasma rosa pálido 
★ Basófilos - grânulos volumosos e de cor azul escuro e núcleo roxo escuro 
★ Eosinófilos - grânulos rosas, citoplasma rosa pálido e núcleo roxo 
As células analisadas na aula prática foram os linfócitos. 
 
2. MATERIAIS E MÉTODOS 
2.1. MATERIAIS 
● amostra de sangue 
● pipeta semiautomática 
● ponteiras descartáveis 
● lâminas 
● corante Giemza 
● corante Leishman 
● corante Rosenfeld 
 
 
2.2. METODOLOGIA 
 
➔ Preparar duas lâminas desengorduradas, sendo que uma das lâminas tem que ter uma 
região fosca para identificação do lado da amostra. 
 
 
➔ Colocar uma gota de sangue na lâmina (próximo à região fosca) com o uso da pipeta 
semiautomática. 
➔ Colocar a outra lâmina na frente da gota em um ângulo de 45º e fazer um ligeiro 
movimento para trás e movimentos leves descendo e subindo a parte da lâmina que está 
sem tocar na outra lâmina para espalhar o sangue na lâmina. 
➔ Com um movimento uniforme e para frente, fazer esta lâmina deslizar sobre a outra, 
arrastando o sangue e formando uma fina camada. 
➔ O movimento deve ser suave, único, rápido e firme. 
➔ Agitar a lâmina ao ar até o esfregaço secar completamente e identificar com lápis. 
Esfregaço sanguíneo. Disponível em : ​http://hemo-citologia.blogspot.com/2010/08/esfregaco-do-sangue-periferico.html​. 
Acesso 26 de Outubro de 2019. 
 
➔ Após a secagem do sangue na lâmina utilizamos o panótico rápido para coloração do 
esfregaço. 
➔ Fixação → coloração → contra coloração → lavagem 
➔ Mergulhar a lâmina por 10 segundos na solução de triarilmetano a 0,1% - responsável 
por segurar as células na lâmina. ( CORANTE GIEMZA) 
➔ Mergulhar a lâmina por 10 segundos na solução de xantenos a 0,1% - corante ácido e 
que possui afinidade por substâncias básicas , como citoplasma e grânulos. ( CORANTE 
LEISHMAN) 
➔ Mergulhar a lâmina por 15 a 20 segundos na solução de tiazinas a 0,1% - corante básico 
e que possui afinidade por substâncias ácidas, como o núcleo. ( CORANTE 
ROSENFELD) 
➔ Por fim, lava-se a lâmina em água corrente, mas sem deixar a água tocar diretamente no 
esfregaço, pois pode retirar a amostra. 
➔ Esperar secar a lâmina e visualizar no microscópio. 
 
 
 
http://hemo-citologia.blogspot.com/2010/08/esfregaco-do-sangue-periferico.html
 
Ensaios de Imunoprecipitação 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
O teste de imunoprecipitação é usado para detectar se há ou não a presença de anticorpos 
específicos em fluidos corporais a partir da formação do complexo antígeno/anticorpo e sua 
precipitação. O teste apresenta boa especificidade, ou seja, o risco de aparecer 
falsos-positivos é menor, porém a sensibilidade é baixa, o que pode ocorrer a formação de 
falsos-negativos. Ademais, permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo. 
Existem três tipos principais de imunoprecipitação: 
● Imunodifusão radial simples : dosagem de anticorpo e antígeno 
● Imunodifusão radial dupla: detecção de anticorpo 
● Imunoeletroforese: avaliação de imunoglobulinas 
 
Na aula prática, executamos o teste de imunodifusão dupla, usando como antígeno, 
proteínas e lipopolissacarídeos extraídos da bactéria ​Brucella ovis. ​A infecção de ​Brucella 
ovis provoca placentite em ovelhas, interferindo na nutrição fetal e fazendo com que os 
cordeiros nascidos sejam fracos e tenham pouco peso. Já nos carneiros, as consequências 
são epididimite e esterilidade. 
 
2. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
2.1. MATERIAIS 
 
● placa de Petri 
● gel de agarose ou ágar nobre 
● antígeno purificado (controle positivo) 
● antígeno purificado ( imunodifusão dupla) 
● soros a serem testados 
● roseta ou perfurador 
● pipeta semiautomática 
● ponteiras 
 
2.2. METODOLOGIA 
 
➔ Adiciona-se o gel de ágar na placa de Petri, espera solidificar e depois da solidificação, a 
placa é perfurada com o uso da roseta que contém 7 perfuradores, sendo 1 central e 6 
periféricos. Se ficar gel nos poços, fazer o uso de uma agulha encurvada para retirar o 
gel. 
 
 
 
 
 
 
+ = 
➔ O antígeno e os soros de controle positivo e de teste devem ser armazenados em 
frascos com identificação. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
➔ Adiciona-se 25 µL de antígeno com o uso de uma pipeta no poço central e descarta o 
bico em um recipiente adequado. Em seguida, adiciona-se 25 µL de soros a testar em 3 
poços periféricos e 25 µL de soros de controle positivo intercalados com os soros a 
testar. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
➔ Colocar as placas em um ambiente úmido e incubá-las em temperatura ambiente ou em 
uma estufa entre 18°C e 28°C e deixar por 48 h. 
➔ Após o período de 48h, é possível verificar que os soros 1,2 e 3 são positivos , visto que 
há a formação de linhas de precipitação entre os soros testes. Já os soros 4,5 e 6 são 
negativas, pois não houve formação de linhas de precipitação. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ensaios de Imunoaglutinação 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
As reações de aglutinação ocorrem com a ligação entre o anticorpo e o antígeno. O ensaio 
de aglutinação possui baixo custo, boa especificidade , facilidade de execução e é possível 
fazer uma leitura visual, devido a formação de grânulos. Existem 3 tipos de reação de 
aglutinação: 
Aglutinação direta: o antígeno faz parte da célula (naturalmente) e a aglutinação 
será feita por anticorpos contra esses antígenos. Usado na tipagem sanguínea (sistema 
ABO) e na detecção de doenças como brucelose, salmonelose e leptospirose ,sendo que 
nesse caso, as células bacterianas são os antígenos e são usados para pesquisar 
anticorpos em soro de pacientes. 
Aglutinação indireta: adsorção de anticorpos ou antígenos solúveis proteicos na 
superfície de micropartículas inertes que não interferem na interação antígeno-anticorpo, 
como látex e gelatina. Na reação usando látex, por exemplo, as moléculas de anticorpo se 
ligam ao látex e depois os anticorpos se ligam a esses antígenos específicos. 
No casoda ​inibição da aglutinação​, tem-se o teste de gravidez que diferente dos 
testes acima, a aglutinação quer dizer que o teste deu negativo e não positivo. Assim, 
coloca-se o soro anti-HCG junto com a urina e deixa incubados por um tempo, depois 
verifica-se se os anticorpos anti-HCG se ligaram na HCG presente na urina, se ocorrer a 
aglutinação, o teste deu negativo , pois os anticorpos anti-HCG se ligaram nas partículas 
revestidas com HCG. 
 
2. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
2.1. MATERIAIS 
● Pipeta semiautomática 
● Ponteiras descartáveis 
● Antígeno Rosa Bengala (suspensão de ​Brucella abortus​) 
● Placa de vidro 
● Soro de controle positivo e negativo 
● Soros de testes 
● Luvas 
 
 
 
 
2.2. METODOLOGIA 
 
➔ Adiciona-se a Rosa Bengala na placa de vidro e ao lado adiciona-se o soro teste. é 
importante ter o soro de controle positivo e negativo e todos devem estar armazenados e 
identificados (como mostrado acima). 
 
Rosa Bengala Soro a ser testado ao lado do Rosa Bengala 
 
➔ Em seguida, mistura-se o soro e a Rosa Bengala fazendo movimentos circulares suaves. 
E depois faz-se movimentos circulares e suaves com a placa de vidro. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
➔ Esperar de 2 a 5 minutos para visualizar os resultados da aglutinação. Na imagem 
abaixo a amostra da esquerda é negativa e a amostra da direita é positiva, uma vez que 
houve aglutinação. 
 
 
Teste de ELISA 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
O teste de ELISA é usado para detectar a presença de antígenos ou anticorpos específicos 
em amostras de fluidos corporais ou sobrenadantes de cultura, sendo assim pode 
diagnosticar diversas doenças , como Herpes vírus bovino tipo I, AIDS, Leishmaniose, 
Toxoplasmose e também serve para dosagem de hormônios, como T3 e T4 e testosterona . 
O resultado positivo do teste se dá pela mudança de cor nos poços contendo o anticorpo e 
o soro a ser testado. Há 4 tipos de ELISA: 
 
● INDIRETO: detecta principalmente anticorpos 
● SANDUÍCHE: detecta principalmente antígenos 
● COMPETIÇÃO: detecta antígenos com baixo peso molecular 
● CAPTURA: detecta anticorpos principalmente IgM 
 
Na aula prática, fez-se o Ensaio Imunoenzimático (ELISA) indireto para a detecção de 
anticorpos contra o ​Treponema pallidum​, responsável por causar a Sífilis e utilizou-se o KIT 
da Wiener lab. 
 
2. MATERIAIS E MÉTODOS 
2.1. MATERIAIS 
● Tampão de lavagem 
● Microplaca 
● Conjugado 
● Reveladores A eB 
● Stopper 
● Diluente de amostras 
● Controles positivos e negativos 
● Amostras de soro teste 
 
2.2. METODOLOGIA 
 
➔ Adicionou-se 200 µL de diluente de amostras nos poços de A à H e depois colocou 10 µL 
de amostras e de controles nos poços : controle positivo nos poços A e B, o controle 
negativo nos poços C e D, o soro 1 nos poços E e F e o soro 2 nos poços G e H. Em 
seguida,misturou os líquidos dando leves batidas nas laterais da microplaca e por fim, 
colocou na estufa a 37°C por 30 minutos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
➔ Após esse tempo na estufa, a microplaca foi retirada, o líquido foi desprezado em 
recipiente contendo hipoclorito de sódio a 5% , os poços foram lavados com 300 µL de 
tampão de lavagem por cinco vezes em cada cubeta e o líquido da lavagem foi 
descartado também em um recipiente com com hipoclorito. 
➔ Depois desse processo, para eliminar os resíduos de líquido da placa, ela foi invertida e 
bateu-se várias vezes com ela sobre o papel absorvente. 
➔ Em seguida, adicionou-se 1 gota de conjugado nas cubetas, deixou por 10 segundos e 
incubou a placa por mais 30 minutos na temperatura de 37°C. No fim desse processo, 
retirou-se o conjugado e adicionou 300µL de tampão de lavagem por cinco vezes em 
cada cubeta e depois realizou o mesmo processo do citado acima. Retirado todo o 
resíduo de líquido, foram adicionados 1 gota de cada revelador ( A e B) nas cubetas, 
misturou com leves batidas na lateral e incubou por 30 minutos em temperatura 
ambiente. 
➔ Ao fim desse tempo, foi acrescentado 1 gota de Stopper em cada cubeta durante 10 
segundos e percebeu-se a mudança de cor nas cubetas A e B que eram de controle 
positivo, ou seja os poços contendo os soros 1 e 2 e o de controle negativo não 
mudaram de cor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Imunocromatografia (testes rápidos) 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
Os testes rápidos foram desenvolvidos no final da década de 80 e com o desenvolvimento 
da tecnologia com a produção de kits, esses testes se tornaram eficientes na detecção de 
HIV , Sífilis, Hepatite B e C. 
● O ​HIV ​é um vírus de RNA (retrovírus) que contém a enzima transcriptase reversa, 
responsável por fazer uma cópia de DNA complementar a partir da transcrição do 
RNA viral. Esse vírus ataca células do sistema imune como os linfócitos TCD4 + e a 
diminuição dessas células permite o desenvolvimento de doenças oportunistas. 
● A ​Sífilis é uma doença sexualmente transmissível provocada pela bactéria 
Treponema pallidum e é curável. Além disso, apresenta estágios diferentes: 
primário, secundário, latente e terciário. 
● A ​Hepatite B ​é uma doença infecciosa causada por um vírus de DNA e geralmente 
não apresenta sintomas, ou seja, a detecção da doença muitas vezes é feita por 
conta de doenças relacionadas ao fígado, sendo que os sintomas só aparecem em 
fases avançadas da doença. Ademais, a hepatite B possui vacina como forma de 
prevenção. 
● A Hepatite C é causado por um vírus de RNA que não sobrevive fora do organismo 
hospedeiro por um longo período de tempo e não possui vacina como forma de 
prevenção. 
 
A tecnologia empregada nos testes é a da imunocromatografia lateral e a de dupla migração 
-DDP, as quais permitem a detecção de anticorpos ou antígenos em amostras de sangue 
ou soro em até 30 minutos. Na aula prática a imunocromatografia lateral foi usada para os 
testes de Sífilis e as Hepatites B e C. Já a imunocromatografia dupla foi usada no teste de 
HIV. 
 
 
 
Imunocromatografia dupla ( DDP) 
Utilizam uma membrana de nitrocelulose, 
na qual os antígenos estão ligados. Além 
disso, o teste possui três áreas: 1 , 2 e 3. 
Área 1: onde se aplica a amostra e o 
diluente 
Área 2: onde se aplica o tampão que 
permite a migração do conjugado. 
Área 3: onde se tem os antígenos fixados 
e onde faz a leitura do teste controle. 
 
 
 
 
 
Imunocromatografia lateral 
Utiliza também a membrana de 
nitrocelulose e é dividido em quatro 
áreas: 
Área (A): amostra e solução tampão 
Área (I): contém o conjugado, 
geralmente composto por ouro coloidal 
ligado a anticorpos . 
Área de teste (T): contém antígenos fixados na membrana de nitrocelulose e é onde se lê o 
resultado . 
Área de controle (C): local de controle da reação e que permite a validação do teste. 
 
2. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
2.1. MATERIAIS 
● Luvas 
● Álcool 70% 
● Algodão 
● Lancetas para punção digital 
● Envelopes lacrados contendo os kits de detecção de HIV, Sífilis, Hepatites B e C 
● Pipetas para transferência da amostra de sangue 
● Amostra de sangue 
● Tampão 
● Solução diluente de cada kit 
● Alça coletora ( kit HIV) 
 
2.2. METODOLOGIA 
 
Nos testes da Sífilis e das Hepatites B e C, foram feitos os seguintes procedimentos para a 
obtenção dos resultados: 
➔ Higienizara região do dedo com algodão ou gaze embebida de álcool 70%, pegar a 
lanceta de punção digital e pressionar no dedo. Em seguida, pega uma pipeta de 
plástico, recolhe a amostra de sangue e transfere a amostra para a área/poço da 
amostra, evitando a formação de bolhas de ar. Lembrando que o dispositivo de teste 
deve ser colocado em uma superfície plana e limpa. 
➔ Depois, aplique o diluente, espere 15 minutos e faça a leitura do teste. 
➔ A leitura dos resultados dos testes acima deram negativas, ou seja, foram não 
reagentes, uma vez que apareceu uma linha rosa na área de controle (C) nos 
dispositivos de Sífilis e Hepatite C e uma linha azul no dispositivo de Hepatite B e não 
apareceu nenhuma linha na área de teste (T) dos três dispositivos. 
 
 
Hepatite B 
 
 
 
 
 
 
 
 
Hepatite C 
Sífilis 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
No teste para HIV, a execução é um pouco diferente e seguiu-se os seguintes passos para 
a realização: 
➔ O frasco de eluição possui uma tampa branca e logo em cima uma tampa preta. 
➔ Desenrosque a tampa branca do frasco e mantenha a tampa preta do dosador 
fechada. Em seguida higienize o dedo com algodão e álcool 70% e com o uso da 
lanceta de punção, pressione-a no dedo e recolha a amostra de sangue com o uso 
da alça coletora. 
Frasco de eluição 
 
➔ Insira a alça coletora com o sangue no frasco de eluição, quebre a alça na região 
marcada e feche o frasco. Em seguida, faça no frasco movimentos suaves e 
circulares por 10 segundos. 
➔ Retire a tampa preta do frasco de eluição e adicione duas gotas da solução na área 
1, evitando a formação de bolhas e marque 5 minutos. 
◆ OBS: Na área 3 possui a marcação com as letras T e C e nessa região vai 
formar uma linha azul na região do T (teste) e uma linha verde na região C 
(controle). 
 
 
➔ Após os 5 minutos, adicione quatro gotas de tampão na área 2, evitando a formação 
de bolhas de ar. Espere de 10-25 minutos para fazer a leitura dos resultados. 
 Tampão de corrida 
 
➔ Por fim, foi feita a análise do resultado e obteve-se apenas uma linha rosa na região 
do controle ( C ) , ou seja, o resultado deu não reagente. 
 
 
HIV 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
OBS: ​Os resultados dos testes podem ser reagentes ( positivos) quando são formadas duas 
linhas, uma linha no C e outra linha no T e podem ser não reagentes (negativos) quando só 
aparece uma linha na região C . Além disso, o teste pode ser inválido se não aparecer uma 
linha na região C no tempo informado pelo fabricante. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
REFERÊNCIAS 
 
Teste rápido para diagnóstico de hepatite C. TELELAB. ​Disponpivel em : 
https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22183/mod_resource/content/2/Hep
atites%20-%20Manual%20Aula%204.pdf​. Acesso 22 de Novembro de 2019. 
 
O que é HIV. ​Ministério da Saúde. Disponível em: 
http://www.aids.gov.br/pt-br/publico-geral/o-que-e-hiv​. Acesso 22 de Novembro de 
2019. 
 
Hepatites B e C​. Secretaria de Saúde. ​Disponível em: 
https://cevs.rs.gov.br/hepatites-bc​. Acesso 23 de Novembro de 2019. 
 
Sífilis. ​Ministério da Saúde​. Disponível em : 
http://www.aids.gov.br/pt-br/publico-geral/o-que-sao-ist/sifilis​. Acesso 23 de 
Novembro de 2019. 
 
Cachay, Edward. Infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). ​Manual 
MSD versão saúde para a família​. Disponível em: 
https://www.msdmanuals.com/pt-br/casa/infec%C3%A7%C3%B5es/infec%C3%A7%
C3%A3o-pelo-v%C3%ADrus-da-imunodefici%C3%AAncia-humana-hiv/infec%C3%A
7%C3%A3o-pelo-v%C3%ADrus-da-imunodefici%C3%AAncia-humana-h​iv. Acesso 
23 de Novembro de 2019. 
 
https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22183/mod_resource/content/2/Hepatites%20-%20Manual%20Aula%204.pdf
https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22183/mod_resource/content/2/Hepatites%20-%20Manual%20Aula%204.pdf
http://www.aids.gov.br/pt-br/publico-geral/o-que-e-hiv
https://cevs.rs.gov.br/hepatites-bc
http://www.aids.gov.br/pt-br/publico-geral/o-que-sao-ist/sifilis
https://www.msdmanuals.com/pt-br/casa/infec%C3%A7%C3%B5es/infec%C3%A7%C3%A3o-pelo-v%C3%ADrus-da-imunodefici%C3%AAncia-humana-hiv/infec%C3%A7%C3%A3o-pelo-v%C3%ADrus-da-imunodefici%C3%AAncia-humana-hiv
https://www.msdmanuals.com/pt-br/casa/infec%C3%A7%C3%B5es/infec%C3%A7%C3%A3o-pelo-v%C3%ADrus-da-imunodefici%C3%AAncia-humana-hiv/infec%C3%A7%C3%A3o-pelo-v%C3%ADrus-da-imunodefici%C3%AAncia-humana-hiv
https://www.msdmanuals.com/pt-br/casa/infec%C3%A7%C3%B5es/infec%C3%A7%C3%A3o-pelo-v%C3%ADrus-da-imunodefici%C3%AAncia-humana-hiv/infec%C3%A7%C3%A3o-pelo-v%C3%ADrus-da-imunodefici%C3%AAncia-humana-hiv