Marcadores_moleculares (1) 3

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Marcadores moleculares
Prof. Danilo Flademir A. de Oliveira 
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
UNIDADE ACADÊMICA ESPECIALIZADA EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS
CURSO DE ENGENHARIA FLORESTAL
DISCIPLINA: EFL0EFL0324 – MELHORAMENTO FLORESTAL
Caixeta et al., 2003
Marcadores moleculares
 Marcadores
• Utilizados para marcar alelos cuja expressão seja de
difícil identificação;
• Pode-se selecionar o alelo de interesse de forma
indireta, através do marcardor;
• Os marcadores são utilizados em estudos evolutivos,
teste de paternidade e identificação de genótipos;
• Em espécies florestais, são utilizados desde a década de
80: estudos de sistemas de cruzamento em pomares de
sementes > produção das primeiras versões de mapas
genéticos de coníferas.
Marcadores moleculares
 Marcadores
• Utilização dos marcadores genéticos:
- Feijão: através de experimentos, foi constatado
que:
* O alelo responsável pela ausência de pigmento no
tegumento da semente está ligado a alguns alelos de
genes que condicionam o tamanho da semente;
* Seleção de linhagens de feijão com grãos grandes
de forma indireta:
- Seleção de sementes de cor clara (o
tegumento claro foi utilizado como um
marcador).
Marcadores moleculares
 Marcadores genéticos
• Considerações:
- O marcador deve ser herdável e de fácil avaliação;
- Herdabilidade elevada;
- O marcador tem que estar intimamente ligado ao alelo
que se deseja selecionar: sempre que um indivíduo
expressar o fenótipo do marcador ele deverá também
ser portador do alelo de interesse;
- Eficiência na seleção indireta de alelos cujos fenótipos
são avaliados com menor precisão, do que a seleção
direta.
Marcadores moleculares
 Marcadores genéticos
• Podem ser:
* Morfológicos; * Bioquímicos;
* Citológicos; * Moleculares.
Marcadores moleculares
 Marcadores morfológicos
• Características fenotípicas herdáveis e mono ou oligogênicas são
observadas;
• As informações destes marcadores são correlacionadas com as
características de interesse;
• Genes que controlam a coloração, forma, resistência à 
pragas. 
Marcadores moleculares
 Marcadores morfológicos
• Normalmente são fenótipos de fácil identificação;
• Determinado por um único alelo e herdabilidade
próxima de 1,0;
• A eficiência máxima do marcador se constitui no
próprio alelo de interesse;
• Porém, estes marcadores apresentam algumas
limitações:
- Ocorrência em número reduzido (baixa eficiência para
marcar alelos de interesse);
- Processo de avaliação limitado;
- Dependência do desenvolvimento da planta e sua expressão
gênica pode estar sujeita à variações ambientais.
Marcadores moleculares
 Marcadores bioquímicos
• Utilizados para identificar hormônios, enzimas, anticorpos ou quaisquer
outras substâncias também herdáveis e diferentes em dois ou mais
indivíduos;
• Os mais usados são representados pelas isoenzimas e pelas proteínas de
reserva de sementes;
• São os produtos diretos dos alelos: basta identificá-los para selecionarmos
o indivíduo como fenótipo desejado, que é produzido pelo alelo de
interesse.
Marcadores moleculares
 Marcadores bioquímicos
• Uso destes marcadores: extração da proteína e no uso de reações que as
identifique;
Lemes et al., 2018 
Marcadores moleculares 
- Quando se trata de marcadores moleculares, dois conceitos devem ser
levados em consideração:
• Presença de polimorfismo e a natureza o marcador;
• Uma sequência de DNA que é idêntica em todos os indivíduos analisados
não gera informação que permita identificar geneticamente os indivíduos
(chamados de marcadores não-polimórficos);
• Desta forma, um dos critérios utilizados na seleção de marcadores
moleculares é a presença de polimorfismo na população.
Monomorfismo Polimorfismo
Marcadores moleculares
• Marcadores que utilizam o próprio DNA.
- Permitem observar a grande variabilidade entre os indivíduos
de uma espécie;
- Utilizando o DNA, consegue-se um número de marcadores
suficientes para marcar todos alelos de todos os genes de uma
espécie;
- Porém, as técnicas empregadas são mais caras quando
comparadas às utilizadas nas isoenzimas.
Marcadores moleculares
 Tipos de marcadores moleculares
• Microssatélites ou SSR (Simple SequenceRepeat)
- Consistem em uma sequência do genoma que varia de 1 a 6 pares de bases
repetidas consecutivamente n vezes (tandem);
- Exemplo:
- Esta sequência é um microssatélite possível de ser utilizado como marcador
genético e que é representado como (TG)5.
TGTGTGTGTG
Marcadores moleculares
 Tipos de marcadores moleculares
• Microssatélites ou SSR (Simple SequenceRepeat)
- Consistem em uma sequência do genoma que varia de 1 a 6 pares de bases
repetidas consecutivamente n vezes (tandem);
- Estas sequências são amplificadas e o resultado pode ser observado em um
gel ou através da eletroforese capilar.
Lanza et al., 2000
Marcadores moleculares
 Tipos de marcadores moleculares
* RFLP (Restriction Fragmente Lenght Polymorphism);
- Polimorfismo de comprimentos de fragmentos de restrição;
- Baseado no corte do DNA por mais de uma ou mais enzimas de restrição, gerando
milhares de fragmentos, que serão separados em seguida, com base nos seus
tamanhos;
Marcadores moleculares
 Tipos de marcadores moleculares
• RAPD (Random Amplified PolymorphicDNA);
- Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso. Consiste na extração de DNA dos indivíduos a
serem analisados e submeterem à reações de amplificação;
- Fornece uma identificação direta da variabilidade genética: indicação de genitores para
híbridos específicos.
Gottardi et al., 2001
Marcadores moleculares
 Tipos de marcadores moleculares
* SNP (SingleNucleotide Polymorphisms)
- Polimorfismo de base única;
- São diferenças de DNA em uma simples base (nucleotídeo) entre indivíduos
(polimorfismo resultante da alteração de uma única base).
Gottardi et al., 2001
Marcadores moleculares
- Mapas genéticos: representação de ordem e distância entre marcadores
genéticos.
Figura. Mapeamento genético de espécies florestais.
Borém, 2007
Marcadores moleculares
 Técnicas aplicadas na Genética Molecular
- Eletroforese
• É uma técnica utilizada para separar macromoléculas, como
DNA, RNA e proteínas;
• Estas macromoléculas são submetidas a um campo elétrico,
no qual migram para um polo positivo ou negativo, de
acordo com sua carga;
• No caso do DNA e RNA, estas moléculas apresentam carga
negativa; quando colocadas em um campo elétrico, migram
para o polo positivo.
Marcadores moleculares
 Técnicas aplicadas na Genética Molecular
- Eletroforese
Cuba horizontal Cuba vertical
Marcadores moleculares
 Técnicas aplicadas na Genética Molecular
- Eletroforese
• O fluxo migratório é determinado pelo
peso molecular, na qual moléculas de
menor peso migram mais rápido que
as de maior peso, formando bandas
características que serão visualizadas
posteriormente.
Bandas
Marcadores moleculares
 Técnicas aplicadas na Genética Molecular
- Eletroforese em gel
- O gel é uma placa de material gelatinoso;
- Geralmente o gel é feito através do polissacarídeo agarose (pó) ou através da
poliacrilamida.
Gel de agarose
Gel de poliacrilamida
Marcadores moleculares
 Técnicas aplicadas na Genética Molecular
- Eletroforese em gel
- O gel é preparado e adicionado na caixa de gel;
- Em uma extremidade, o gel apresenta cavidades, denominada poços, onde
as amostras de DNA vão ser colocadas.
Marcadores moleculares
 Técnicas aplicadas na Genética Molecular
- Eletroforese em gel
- Uma extremidade da caixa é ligada a um eletrodo
positivo e outra a um eletrodo negativo;
- O corpo principal da caixa (onde o gel é colocado)
é preenchidopor uma solução tampão contendo
um sal que pode conduzir corrente.
Marcadores moleculares
Lehninger, 2007
 Técnicas aplicadas na Genética
Molecular
- Eletroforese em gel
- Colocadas todas as amostras, a caixa é ligada e
a corrente começa a fluir através do gel;
- Iniciada a “corrida”, as moléculas de DNA de
tamanhos diferentes irão migrar com
velocidades diferentes através dos poros do gel,
em direção ao eletrodo positivo;
- Quanto menor for a molécula, mais rápida será
a sua migração.
Marcadores moleculares
Sentido 
de 
migração 
do DNA
 Técnicas aplicadas na Genética
Molecular
- Eletroforese em gel
- Terminada a “corrida”, os fragmentos de DNA
agora estão separados por tamanho;
- Pode-se então, examinar o gel para ver quais
tamanhos de faixas são encontrados;
- Geralmente, a visualização é feita através de um
corante e no próprio gel, com um composto que
torne o DNA visível;
- Um dos corantes utilizados é o brometo de
etídeo: quando a molécula está ligada a ele e é
submetida a luz ultravioleta, ele fluoresce em
uma cor avermelhada.
Marcadores moleculares
 Técnicas aplicadas na Genética Molecular
- Eletroforese em gel
Araújo, 2006
Marcadores moleculares
 Técnicas aplicadas na Genética Molecular
- Aplicações da eletroforese
- Ciência forense: comparar o DNA encontrado no local
de um crime com o de possíveis suspeitos;
- Genética: teste de paternidade, diferenciação de espécies
ou linhagens e engenharia genética;
- Microbiologia: detecção de fungos, vírus e bactérias;
- Bioquímica: detecção e expressão de proteínas.
Marcadores moleculares
 Técnicas aplicadas na Genética Molecular
- Reação em cadeia da polimerase (PCR)
- Do inglês Polymerase ChainReaction;
- Técnica pela qual moléculas de DNA são amplificadas
milhares de vezes e de uma forma bastante rápida;
- É uma técnica sensível, possibilitando a amplificação do
DNA a partir de uma quantidade mínima de amostra;
- O objetivo da PCR é fabricar quantidade suficiente da
região de interesse do DNA, para que possa ser usada de
uma outra maneira (sequenciamento ou eletroforese, por
exemplo).
Marcadores moleculares
 Técnicas aplicadas na Genética Molecular
- Reação em cadeia da polimerase (PCR)
- Permite a amplificação de segmentos definidos da
molécula de DNA;
- Em geral, uma reação de amplificação contém:
• O DNA com a sequência alvo a ser amplificada;
• Uma enzima DNA-polimerase termoestável (Taq
polimerase – proveniente de uma bactéria resistente ao
calor da qual a enzima foi isolada);
• Oligonucleotídeos iniciadores (primers): fornecem o
ponto de partida para a síntese do DNA pela polimerase;
• Desoxirribonucleotídeos e tampão de reação.
Marcadores moleculares
 Técnicas aplicadas na Genética Molecular
- Reação em cadeia da polimerase (PCR)
- Os componentes da reação são misturados e as amostras são colocadas em
um termociclador, equipamento que possibilita o aquecimento e o
resfriamento rápido de amostras (constituindo ciclos).
Marcadores moleculares
 Técnicas aplicadas na Genética Molecular
- Reação em cadeia da polimerase (PCR)
- Etapas da PCR
• Desnaturação (95°C): aquece fortemente para separar ou desnaturar as fitas
de DNA;
• Anelamento ou hibridização (55 – 65°C): resfriamento da reação,
permitindo que os primers se liguem as suas sequências complementares no
DNA molde;
• Extensão (68 – 72°C): aumento da temperatura para que a polimerase
estenda os primers, sintetizando novas fitas de DNA (polimerização).
Repetindo-se várias vezes estas etapas (20 a 30 ciclos), possibilitam a amplificação do
DNA
Marcadores moleculares
Alberts et al., 2017
- Reação em cadeia da polimerase (PCR)
1- O DNA é aquecido brevemente para separar as duas fitas;
2 – O DNA é exposto a uma quantidade de significativa de um par de iniciadores
(primers) específicos. A amostra é resfriada para hibridização dos iniciadores com as
sequências complementares nas duas fitas do DNA;
3 – A mistura é incubada com DNA-polimerase e os 4 desoxirribonucleosídeos fosfato,
de modo que o DNA possa ser sintetizado, a partir dos dois iniciadores.
Marcadores moleculares
Alberts et al., 2017
- Reação em cadeia da polimerase (PCR)
- A PCR utiliza ciclos repetidos para separação das fitas, hibridização e síntese para
amplificar o DNA;
- Desta forma, todos os fragmentos recém-sintetizados servem como molde, no
próximo ciclo.
Marcadores moleculares
Alberts et al., 2017
- Reação em cadeia da polimerase (PCR)
- Cada ciclo duplica a quantidade de DNA sintetizada no ciclo anterior, de modo que
dentro de poucos ciclos, o DNA predominante seja idêntico à sequência delimitada
pelos dois iniciadores no molde original, incluindo a sequência destes.
Marcadores moleculares
 Técnicas aplicadas na Genética Molecular
- Reação em cadeia da polimerase (PCR)
- Os resultados da PCR geralmente são vistos através da eletroforese em gel;
- Fragmentos de DNA de mesmo comprimento forma uma banda no gel (vista
a olho nu quando corada – o DNA se liga ao corante).
Caixeta et al., 2003
Marcadores moleculares
 Técnicas aplicadas na Genética Molecular
- Aplicações da PCR
• Laboratórios de pesquisa;
• Ciências forenses;
• Testes genéticos;
• Diagnósticos.
Marcadores moleculares
 Técnicas aplicadas na Genética Molecular
- Aplicações da PCR
• Teste de paternidade – Que resultado a análise mostrou em relação ao filho
1? E ao filho 2?
O filho 1 é do outro
homem, porque não
há coincidência das
bandas de DNA com
as do marido;
O filho 2 é do marido
pois a bandas são
coincidentes.