Relatório prática_ Biologia Molecular_02

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VERSÃO:01
	
	RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS - EaD
	
AULA ____
	
	
	DATA:
______/______/______
RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS: Biologia Molecular 
DADOS DO(A) ALUNO(A):
	NOME: PAULO DO O MONTEIRO
	MATRÍCULA: 04026297
	CURSO: FARMACIA
	POLO: MARABA
	PROFESSOR(A) ORIENTADOR(A): JULIANA PRADO GONÇALES
	ORIENTAÇÕES GERAIS: 
O relatório deve ser elaborado individualmente e deve ser escrito de forma clara e
concisa;
O relatório deve conter apenas 01 (uma) lauda por tema;
Fonte: Arial ou Times New Roman (Normal e Justificado);
Tamanho: 12;
Margens: Superior 3 cm; Inferior: 2 cm; Esquerda: 3 cm; Direita: 2 cm;
Espaçamento entre linhas: simples;
Título: Arial ou Times New Roman (Negrito e Centralizado). 
			TEMA DE AULA: ELETROFORESE
RELATÓRIO:
Identificar todos os equipamentos e reagentes necessários para a realização da eletroforese
 Cuba de eletroforese
 Gel Agarose
 Tampão
 Amostra
 Sonda (Corante Fluorescente)
 Transluminador
 Fotodocumentador
 Magnésio
 Taq Polimerase
 Primers
 Nucleotídeos
 Tubos de PCR
 Termociclador
Descrever cada etapa dessa metodologia.
Eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel que possibilita a corrida da amostra. O gel é introduzido dentro de uma solução tampão específica para eletroforese que fornece as condições ideais para a passagem da corrente e a manutenção do valor do pH.
Em seguida, as amostras são pipetadas em pequenos poços feitos com um pente no gel. Para ocorrer a migração, a cuba e fonte de eletroforese exercem uma voltagem, corrente e potência constantes, esses fatores irão determinar o sucesso da técnica.
E por fim, as bandas são visualizadas sob luz ultravioleta ou LED, através do equipamento chamado de transiluminador.
A agarose é um polissacarídeo composto por agar e pectina.
Para preparar este gel, simplesmente faz-se a mistura entre o pó de agarose e solução tampão. Após fundir, coloca-se brometo de etidium, que tem ampla afinidade pelo DNA, e revela sobre presença de UV(ultra violeta) os
Ácidos nucléicos.
Quando a mistura esfriar o gel estará duro. Esse endurecimento é feito em um local apropriado, o mesmo local onde será feita a corrida da amostra. Um detalhe importante é a colocação do pente no gel durante o endurecimento. O pente cria poços que serão utilizados para a colocação das amostras. Podemos ver este processo como uma corrida. Cada um é colocado numa pista e na presença de uma corrente elétrica vai deixando o seu rasto. São estes rastos que serão comparados no método.
O gel de agarose e usado pois tem uma maior extensão de separação para fragmentos longos de DNA( identifica os ácidos nucléicos presente neste). O tamanho e a conformação da molécula de DNA, a concentração do gel de agarose, a corrente elétrica aplicada e tipo de tampão usado influenciam a velocidade da partícula no gel.
Justificar a aplicação das diferentes concentrações dos géis.
A agarose é utilizada como gel para a eletroforese. A agarose é um polissacarídeo forma uma rede que prende as moléculas durante a migração. Dependendo da concentração de agarose, há uma diferença no gradiente de separação, isto é, quanto maior a concentração de agarose, menor o tamanho dos poros e maior a dificuldade da migração dos fragmentos de DNA e de RNA, aumentando o tempo de migração.
 Para preparar um gel de agarose, faz-se a mistura entre o pó de agarose e a solução tampão TBE ou TAE. Após a polimerização do gel, coloca-se brometo de etídio, que fará o DNA e o RNA "brilhar" quando exposto ao UV. A menores temperaturas o gel ganha consistência. Um detalhe fundamental é a colocação do pente no gel durante o endurecimento. 
O pente cria poços que serão utilizados para a colocação das amostras de DNA e RNA. Podemos ver este processo como uma corrida. Cada um é colocado numa pista e na presença de uma corrente elétrica vai deixando o seu rastro. São estes rastros que vamos comparar.
Referências Bibliográficas 
https://kasvi.com.br/principios-da-tecnica-de-eletroforese/ 
http://www2.dbd.puc-rio.br/pergamum/tesesabertas/0212144_06_cap_02.pdf 
http://www.geocities.com/~esabio/eletrof.htm 
http://www.chemkeys.com/artigo/1/14 
http://ciencia.hsw.uol.com.br/evidencias-de-dna1.htm 
https://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese_em_gel
			TEMA DE AULA: REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE 
RELATÓRIO:
Descrever cada uma das etapas da PCR, explicando detalhadamente cada uma.
1 – DESNATURAÇÃO 
O DNA genômico contendo a sequência a ser amplificada é desnaturado por aquecimento a cerca de 95°C por cerca de 30 segundos. A dupla fita é aberta (desnaturada), tornando-se uma fita única.
 
2 – ANELAMENTO OU HIBRIDIZAÇÃO 
Após a separação das fitas, um par de iniciadores ou primers (uma fita de DNA específica para o gene que se quer estudar) complementam a fita oposta da sequência de DNA a ser amplificada. Ou seja, um deles é complementar à sequência em uma fita da dupla-hélice de DNA e o outro é complementar à sequência na outra fita. O molde é determinado pela posição dos iniciadores que se anelam a fita. Essa etapa ocorre a uma temperatura de 60°C.
 
3 – EXTENSÃO OU POLIMERIZAÇÃO 
Com o molde já identificado, a enzima DNA-polimerase adiciona as bases complementares, formando uma nova fita e então tem-se novamente a duplicação da fita de DNA. Esse processo acontece a uma temperatura de 72°C.
Fonte: Bruces, ALBERTS,, JOHSON, Alexander, LEWIS, Julian, ROBERTS, Keith, WALTER, Peter, and RAFF, Martin. Biologia Molecular da Celula, 5ª edição. ArtMed, 2011. pág 545.
O ciclo inteiro é então reiniciado, os produtos do primeiro ciclo de replicação são então desnaturados, hibridizados e novamente replicados com DNA-polimerase. O procedimento é repetido muitas vezes até́ que o nível desejado de amplificação seja obtido. 
Na prática, a amplificação efetiva do DNA requer de 20 a 30 ciclos de reação, com os produtos de cada ciclo servindo como DNA-molde para o próximo – dando origem ao termo “reação em cadeia” da polimerase. 
Como cada etapa da reação ocorre em uma temperatura especifica, a reação pode ser controlada. É utilizado um termociclador para determinar a temperatura e o tempo de cada etapa, bem como o número de ciclos de replicação. 
A detecção do produto de amplificação normalmente é feita em eletroforese em gel de agarose, que é corado com brometo de etídio, permitindo a visualização direta do DNA pesquisado. Hoje, existem termocicladores que, além de amplificar o DNA, permitem a sua detecção – chamada PCR em tempo real (qPCR).
Realizar o cálculo para 10 reações da PCR.
	Quantidade para 1 reação 
	Quantidade para 10 reações 
	
	Amostra de DNA 
	
	5uL 
	
	Amostra de DNA 
	
	50 uL 
	dNTPs 
	
	2,5 uL 
	
	dNTPs 
	
	25 uL 
	MgCl2 
	
	1,25 uL 
	
	MgCl2 
	
	12,5 uL 
	Primers 
	
	2 uL (1 + 1) 
	
	Primers 
	
	20 uL (10 +10) 
	Taq Polimerase 
	
	1 uL 
	
	Taq Polimerase 
	
	10 uL 
	
	Tampão 
	
	4 uL 
	
	Tampão 
	
	40 uL 
	
	H2O ultrapura (q.s.p)* 
	
	9,5 uL 
	
	H2O ultrapura (q.s.p)* 
	
	95 uL 
	
	Total preparado 
	
	25 uL 
	
	Total preparado 
	
	250 uL 
	
	*Quantidade suficiente para 25 Ul
Referências Bibliográficas
https://kasvi.com.br/3-etapas-pcr/