Principios diagnosticos em Microbiologia Clinica

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Princípios Diagnóstico
em Microbiologia Clínica
Prof. Dr. Adilson C.A. Bernardi
Patogênicos Saprófitas
Causam doença? Não causam doença?
Microrganismos que causam 
doença, que são chamados de:
?
2Prof Dr Adilson C A Bernardi
Ciclo Diagnóstico
A amostra é examinada diretamente.
Podem ou ser feitos montagens,
esfregaços ou colorações.
(podem ser feitos ou não relatos definitivos)
Amostra(s) é(são)
colhida(s) para cultivo.
Ao chegar ao laboratório, os dados do
formulário são transcritos em um terminal
de computador
As solicitaçãoes são transcritas
para os formulários de laboratório.
O formulário e a amostra são enviados
ao laboratório.
O médico examina o paciente
e faz uma tentativa de diagnóstico clínico
Paciente com sinais ou sintomas
de doença infecciosa consulta o médico
As amostras são processadas, os
meios de cultura são selecionados,
inoculados e incubados.
Após incubação, os cultivos são
examinados. Sistemas de identificação
definitiva são utilizados.
Os subcultivos e os resultados de
sistemas de identificação
são examinados.
(podem ser feito ou não relatos prliminares)
A informação final do cultivo é
preparada e enviada ao médico.
O médico interpreta as informações
e institui terapia apropriada.
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Prof Dr Adilson C A Bernardi
Laboratório de Bacteriologia
• A atividade mais importante do
microbiologista na medicina é a de isolar e
identificar os agentes que causam
doenças infecciosas.
• A maior área da microbiologia é chamada
de Clínica (médica) ou Microbiologia
Diagnóstica.
4Prof Dr Adilson C A Bernardi
Laboratório de Bacteriologia
• As principais funções do laboratório de bacteriologia
clínica são:
– Examinar e cultivar amostras biológicas para detecção de
microrganismos,
– Identificar com certeza as espécies envolvidas em
isolamentos importantes e realizar as provas de
sensibilidade a antibióticos quando indicadas.
• Essas tarefas auxiliarão os médicos no diagnóstico e
tratamento das doenças infecciosas.
• Os dados bacteriológicos são também importantes
para avaliar o curso da antibioticoterapia.
5Prof Dr Adilson C A Bernardi
Princípios Diagnóstico
• Ambientes
(MICROBIOTA)
– Microrganismos se 
encontram, quase
sempre sob a forma de 
populações mistas;
– Para seu estudo é 
necessário usar técnicas
de isolamento e 
identificação por meio
de culturas “puras”.
6Prof Dr Adilson C A Bernardi
Procurar o Que????
 Trata-se o que se diagnostica.
 Diagnostica-se o que se vê.
 Vê-se o que se procura.
 Procura-se o que se sabe que se tem que 
procurar.
 Sabe-se o que se tem que procurar se você 
estuda.
 Hugo Miyahira
7Prof Dr Adilson C A Bernardi
Em outras palavras…
• É necessário
– Conhecer a respeito do microrganismo que se vai
pesquisar e sobre sua patogênese;
– Conhecer o modo de coleta apropriada a fim de
evitar-se a contaminação com o ambiente ou
com a microbiota normal e transitória;
– Conhecer o transporte e armazenamento correto
até o laboratório;
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Métodos Diagnóstico
• Convencional;
• Automatizado;
• Molecular;
• Imunológico ;
• Celular
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Métodos Convencionais
 Geralmente emprega-se métodos fenotípicos:
 Caracterização morfológica
 Preparados à fresco ou coráveis
 Característica da célula
 Arranjo que apresenta
 Caracterização do perfil bioquímico-fisiológico
 Uso de substratos específicos;
 Verificação da atividade enzimática;
 Testes de tolerância
 Resistência aos antimicrobianos
 Resistência intrínseca
10Prof Dr Adilson C A Bernardi
Processamento Inicial dos Materiais Clínicos 
para Cultura de Bactérias
• Semeadura primária.
• Importante e fundamental.
• Seleção correta dos meios de cultura.
• Seleção correta da metodologia
• Isolamento do agente em cultura e sua
identificação.
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CALDO
Á
G
A
R
REVISÃO:
Classificação dos Meios de Cultura
Prof Dr Adilson C A Bernardi
ÁGAR SIMPLES
ÁGAR SANGUE/ÁGAR 
CHOCOLATE
Classificação dos Meios de Cultura
13Prof Dr Adilson C A Bernardi
Classificação dos Meios de Cultura
TRANSPORTE DIFERENCIAIS
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SELETIVOS
ÁGAR MAC CONKEY ÁGAR SS
15Prof Dr Adilson C A Bernardi
SELETIVOS E DIFERENCIAIS
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Presença ou Ausência de E.coli
17Prof Dr Adilson C A Bernardi
Presença ou ausência de S.aureus
18Prof Dr Adilson C A Bernardi
Presença ou ausência de Salmonella 
sp
Ágar Hektoen: aspecto colonial de 
Shigella sonnei
Ágar SS: aspecto colonial de Shigella 
sonnei
Ágar XLD: aspecto colonial de 
Shigella sonnei
Ágar Hektoen: aspecto colonial de 
Salmonella sp – ausência de 
fermentação dos carboidratos do 
meio e produção de H2S
Ágar SS: aspecto colonial de 
Salmonella sp – lactose negativa e 
produção de H2S
Ágar rambach: aspecto colonial de 
Salmonella não tifóide – fermentação do 
propilenoglicol 19Prof Dr Adilson C A Bernardi
20Prof Dr Adilson C A Bernardi
Técnicas de Isolamento e Contagem de 
Microrganismo
Medidas de Crescimento Microbiano
Isolamento de Microrganismos em Cultura Pura
Métodos de Quantificação Direta e Indireta
Isolamento de Microrganismos em Cultura 
Pura
Para as 
análises de 
semeadura
usam-se 
equipamentos
específicos
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Alça de Drigalski
Prof Dr Adilson C A Bernardi
Isolamento de Microrganismos em 
Cultura Pura
23Prof Dr Adilson C A Bernardi
Isolamento de Microrganismos em Cultura 
Pura
• Técnica do esgotamento;
• Técnica das diluições em placas
• Princípio de que uma célula
microbiana isolada, quando
depositada em meio de cultura
sólida adequado dará origem a 
um grupamento chamado
colônia
Dentre as 
técnicas
conhecidas para
o isolamento de 
microrganismos
mais
comumente
utilizada são:
24Prof Dr Adilson C A Bernardi
Uso de uma alça de inoculação, com uma
porção da suspensão de microrganismos;
Fazendo na superfície do meio uma
sequência de estrias não sobrepostas,
que vão das bordas para o centro da
placa, em quatro setores distintos.
• A quantidade de material contida na alça será 
progressivamente menor ao término da técnica
Técnica do Esgotamento ou Estriamento 
em Placa - direto
25Prof Dr Adilson C A Bernardi
Técnica do Esgotamento ou Estriamento 
em Placa
26Prof Dr Adilson C A Bernardi
O INTUITO É ISOLAR 
COLÔNIAS
Isolamento de Microrganismos em 
Cultura Pura
27Prof Dr Adilson C A Bernardi
28Prof Dr Adilson C A Bernardi
29Prof Dr Adilson C A Bernardi
30Prof Dr Adilson C A Bernardi
31Prof Dr Adilson C A Bernardi
32Prof Dr Adilson C A Bernardi
33Prof Dr Adilson C A Bernardi
Método da Alça Calibrada
Este método envolve o uso de alças 
calibradas com volumes conhecidos;
Compreende a transferência para 
superfície do ágar de um volume 
específico da diluição contendo alguns 
microrganismos e sua contagem.
34Prof Dr Adilson C A Bernardi
Método alça calibrada
35Prof Dr Adilson C A Bernardi
Método da Alça Calibrada
Prof Dr Adilson CA Bernardi 36
www,medbunker.blogspot.com
Método da Alça Calibrada
Prof Dr Adilson CA Bernardi 37
Prof Dr Adilson C A Bernardi 38
Prof Dr Adilson C A Bernardi 39
IDENTIFICAÇÃO DE 
MICRORGANISMOS
40Prof Dr Adilson C A Bernardi
MÉTODOS CONVENCIONAIS
 Matriz em Tabuleiro de Xadrez (MTX)
 Apresenta características bioquímicas, gênero e
espécies.
 Possui um alto grau de exatidão diagnóstica, porém é
muito cansativo analisar a tabela toda.
 Diagramas Sequenciais Ramificados
 Menos cansativo que o métodoMTX e maior
facilidade na identificação.
 São colocados pontos (+) e (-) indicados por chaves.
Menos exato, pois se alguma reação sair errada, for
mal interpretada ou se for resultado de cultura
mista, poderá ocorrer erro na identificação.
41Prof Dr Adilson C A Bernardi
Matriz em Tabuleiro de Xadrez (MTX)
42Prof Dr Adilson C A Bernardi
Matriz em Tabuleiro de Xadrez (MTX)
43Prof Dr Adilson C A Bernardi
Diagramas Sequenciais Ramificados 
44Prof Dr Adilson C A Bernardi
SISTEMAS MINIATURIZADOS
 Utiliza substratos
convencionais,
fluorogênicos, e
cromogênicos.
 Os substratos são
degradados pelos
microrganismos
submetidos ao teste, o
que resulta em alteração
do pH do meio e
mudança da coloração
dos substratos.
45Prof Dr Adilson C A Bernardi
Sistema API (analytica profile index) 
20E/20STAPH/20STREP...
46Prof Dr Adilson C A Bernardi
Sistema API (analytica profile index) 
20E/20STAPH/20STREP...
47Prof Dr Adilson C A Bernardi
Automação- Sistema Microscan
 Placas de microtitulação de plástico, sendo
incluído até 32 substratos reativos.
48Prof Dr Adilson C A Bernardi
49Prof Dr Adilson C A Bernardi
CONTAGEM DIRETA AO
MICROSCÓPIO
50Prof Dr Adilson C A Bernardi
Contagem Direta ao Microscópio
• Método que apresenta limitações por não
diferenciar células vivas das mortas;
• Células muito pequenas não podem ser
observadas;
• Muitas células, fica inviável a leitura;
• Preferivelmente corar por Gram.
51Prof Dr Adilson C A Bernardi
Contagem Direta ao Microscópio
52Prof Dr Adilson C A Bernardi
Medidas Turbidimétricas
• Mede-se a turvação do meio líquido devido ao
crescimento da população bacteriana;
• A turvação pode ser medida em um fotômetro
ou em um espectrofotômetro;
• As bactérias absorvem e dispersam a luz;
• Lê-se o comprimento de onda em nanômetros
(nm) ou a Densidade Óptica (DO).
• Escala de Mac Farland
53Prof Dr Adilson C A Bernardi
Medida Turbidimétrica
 Turbidez
54Prof Dr Adilson C A Bernardi
Medida Turbidimétrica
 Escala de Mac Farland
55Prof Dr Adilson C A Bernardi
E quando a cultura é difícil?
• Testes Imunológicos:
– Utilizando antisoros específicos
• Reação de intumescimento capsular;
• Teste de aglutinação em lâmina;
• Teste de aglutinação em látex;
• Teste de contraimunoeletroforese;
• Ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas;
• Teste com anticorpos fluorescentes
56Prof Dr Adilson C A Bernardi
AGLUTINAÇÃO EM LÁTEX
57Prof Dr Adilson C A Bernardi
Tipos de Testes Diagnósticos
58Prof Dr Adilson C A Bernardi
SDS - PAGE – 12,5 %
Eletroforese em Gel
59Prof Dr Adilson C A Bernardi
E quando a cultura é difícil?
• Testes Moleculares
– Reação de polimerização em cadeia-PCR e suas 
variações;
– Sondas de ácido nucleico;
– Análise da sequência do DNA 
60Prof Dr Adilson C A Bernardi
61Prof Dr Adilson C A Bernardi
62Prof Dr Adilson C A Bernardi
63Prof Dr Adilson C A Bernardi
Coleta, Conservação e Transporte de 
Materiais Biológicos
Rotina Dos Principais Exames Em 
Bacteriologia Clínica
Considerações Gerais
• Alguns cuidados gerais devem 
ser observados na coleta de 
material microbiológico.
65Prof Dr Adilson C A Bernardi
Considerações Gerais
 Seguir orientações para precauções universais-biossegurança;
 Coletar as amostras, preferencialmente, antes do uso de
antimicrobianos ou de medicação tópica;
 Obter material do verdadeiro sítio de infecção;
 Realizar anti-sepsia adequada para minimizar contaminação
externa;
 Certificar-se que o volume coletados é adequado para as
análises;
 Utilizar dispositivos de coleta, recipientes para transporte e
meios de cultura padronizados pelo laboratório;
66Prof Dr Adilson C A Bernardi
Considerações Gerais
Não iniciar qualquer coleta sem certificar-se da
segurança do paciente, estando prevenido em casos
de desmaio e intercorrências;
 Instruir claramente o paciente sobre o procedimento.
Todo resultado liberado pelo laboratório de
bacteriologia é conseqüência da qualidade da
amostra recebida.
67Prof Dr Adilson C A Bernardi
Considerações Gerais
• Considerar o estágio da doença na escolha do
material. Patógenos entéricos, causadores de
diarréia, estão presentes em maior quantidade e
são mais facilmente isolados durante a fase
aguda ou diarréica do processo infeccioso
intestinal.
• Na suspeita de febre tifóide a fase da doença irá
determinar o melhor local da coleta (sangue/fezes);
68Prof Dr Adilson C A Bernardi
Considerações Gerais
Não utilizar meios de cultura gelados, ressecados ou
contaminados;
Como regra, deve-se transportar os materiais para
análises microbiológicas imediatamente ao
laboratório, à temperatura ambiente;
Quando não for possível o envio imediato, o material
poderá ser armazenado, respeitando-se as
particularidades de cada amostra;
69Prof Dr Adilson C A Bernardi
Qual é o MAIOR problema 
com a administração da 
amostra biológica?
• Médicos que pedem testes inapropriados;
• Médicos que não dá retorno;
• Pessoal não treinado e que não sabe fazer a coleta;
• Qualidade das amostras coletadas;
• Não ter certeza de qual metodologia utilizar.
70Prof Dr Adilson C A Bernardi
Usar ou não “swab”?
• Bactérias aeróbias – swabs de algodão, dacron, ou alginato são
normalmente mais aceitáveis
• Bactérias anaeróbias - tecido ou aspirado é mais recomendado. Resista
usar “swabs” em cirurgias. Use só transporte para anaeróbio.
• Chlamydia – “swabs de Dacron ou alginato mas não algodão. Escova
de coleta é o material de escolha. Nenhum cabo de madeira!!
• Fungos – “swabs não são recomendados
• Vírus – “swabs” de algodão ou dacron mas não alginato. Nenhum cabo
de madeira ou carvão.
71Prof Dr Adilson C A Bernardi
Prof Dr Adilson C A Bernardi 72
Usar ou não “swab”?
Prof Dr Adilson C A Bernardi 73
Materiais 
Biológicos 
coletados 
com swab
Feridas 
abertas
Corrimentos
Genitais
Secreção de 
ouvido 
externo
Secreção de 
garaganta
Secreção 
nasal/nasof
aringe
Secreção 
conjuntival
Swab
Anal