Aula 15 - Eletroforese PDF (1)

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Biologia Molecular
Técnicas - Aula I
Eletroforese
Fabio Hecht
biologiamolecularufrj@gmail.com
Definição
Mígração de íons em 
um campo elétrico.
Não necessariamente é feita em um gel.
O DNA é negativo
Cargas negat
ivas
Eletroforese em gel
Géis de Poliacrilamida ou Agarose
Gel de Agarose
A Agarose é um Polissacarídeo
Comumente é obtido de algas
Concentração de uso: 
Para DNA genômico ou RNA, que são moléculas grandes, usam-se géis 
pouco concentrados. Geralmente 0,7-1%.
Para moléculas de DNA pequenas, como as obtidas após uma reação 
de PCR, usa-se um gel mais concentrado, normalmente 1,5-2%
Ponte de fusão: 93-100 °C
Solidifica entre 34-38 °C
Obs: Existem agaroses com diferentes temperaturas de fusão
Gel de Agarose
Aplicação da amostra
https://www.youtube.com/watch?v=tTj8p05jAFM
Corantes para a migração
Os corantes permitem acompanhar a migração. 
Xileno Cianol
Azul de 
bromofenol
Corantes para a migração
538.61 g·mol−1
Xileno Cianol FF
669.96 g·mol−1
Azul de Bromofenol
Apesar do xileno cianol ter uma massa molar maior que o azul de bromofenol, migra 
muito mais devagar em função da sua carga (1 carga negativa)
Corantes para a migração
Tampão de amostra
Tampão de amostra com SDS
Tampão de amostra
Xileno Cianol
Azul de 
Bromofenol
RNA
Glicerol
Corantes para a migração
Os corantes permitem 
acompanhar a migração. 
No entanto, nós não 
vemos as amostras, 
apenas os corantes!
Como ver o RNA/DNA?
Xileno Cianol
Azul de 
bromofenol
Moléculas “reveladoras”
Brometo de etídio: uso veterinário
Usado para tratar gado infectados com tripanossomas.
Intercala com o DNA do parasita e muda sua conformação pra Z-DNA
Concentração de uso na veterinária: 1mg/kg
Moléculas “reveladoras”
Na Biologia Molecular:
Brometo de etídio é o “corante” mais comumente usado para visualizar 
DNA e RNA. Intercala com os ácidos nucleicos e emite fluorescência quando 
excitado com UV.
Concentração de uso para corar um gel: 0,25–1 microgramas/mL
Moléculas “reveladoras”
SYBR Green
Intercalante teoricamente menos tóxico que o BrEt
Obs: Também pode ser usado para o PCR em tempo real
Tampão de amostra
Xileno Cianol
Azul de 
Bromofenol
RNA
Glicerol
Brometo 
de etídio
(ou similares)
EM ALGUNS CASOS, A MOLÉCULA INTERCALANTE JÁ ESTÁ NO TAMPÃO DE AMOSTRA
Migração
Sem Ultra-Violeta Com UV + Brometo de Etídio
Xileno Cianol
Azul de 
bromofenol
28S
18S
5S
Para géis de RNA, evite xileno cianol!
Qual tampão usar, TAE ou TBE?
TAE (Tris-acetato-EDTA) 
• Fragmentos de DNA/RNA maiores que 1kb são 
resolvidos mais eficiente pelo tampão TAE. 
• Não inibe reações subsequentes
TBE (Tris-Borato-EDTA)
• Utilizado para fragmentos de RNA/RNA menores 
que 1kb.
Na maioria das vezes: tanto faz!
Fonte: https://www.thermofisher.com/br/pt/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-
center/molecular-biology-resource-library/spotlight-articles/8-DNA-ladder-tips.html
Tampão de corrida
Voltagem para a eletroforese: 5 V/cm 
Análises
Os diferentes RNAs da célula
Quantidades dos diferentes 
tipos de RNA em uma célula:
~85% rRNA
~10% tRNA
~3 % mRNA
Composição do ribossomo: 
RNA ribossomal (rRNA) (2/3 da massa)
+ Proteínas (1/3 da massa)
Subunidade 
menor (18S)
Subunidade 
maior
(28S + 5S + 5,8S)
Análises – Gel de RNA
Example of agarose gel electrophoresis of total RNA isolated.Visualization of three intact RNA bands for 28 S
RNA (b), 18 S RNA (c) and 5 S RNA (d). Lanes A and B contain 1 μg of total RNA from Chinese fir leaves, and
Lanes C and D contain 1 μg of total RNA from Chinese fir roots.
Quantidades dos 
diferentes tipos de 
RNA em uma célula 
~85% rRNA
~10% tRNA
~3 % mRNA
Como rRNA é muito 
mais abundante que os 
demais, em um gel de 
RNA total praticamente 
só se vê ele!
Quantificação de um gel de eletroforese
1 22.714.326
2 14.417.326
3 13.228.033
4 11.266.669
5 6.806.426
6 3.363.598 0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Quantificação
Análises - Gel de RNA
Armazenado a:
28S
18S
5S
-80ºC +50ºC
íntegro degradado
O que um gel de RNA deve ter:
1. Boa definição das banda 28S + Banda18S 
+ eventualmente a banda 5/5,8S 
2. A razão entre a intensidade das bandas 
28S/18S deve ser próximo de 2,00
3. Não ter “arraste” abaixo da banda 18S
4. Não ter material preso no poço (típico 
sinal de contaminação do DNA genômico)
arraste
Éxon 1
Éxon 2
Éxon 3
Éxon 4
Éxon 5
Íntron 1
Íntron 2
DNA – Gene A
RNA
mensageiro
Éxon 1
Éxon 2
Éxon 3
Íntron 3
Íntron 4
500
250
100
50
1 2
250 pb
3
3 = Amostra de RNA contaminada 
com DNA genômico (DNAg)
DNA 
complementar 
(cDNA)
Éxon 4
Éxon 5
2