Relatório biotec (1)

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UNIVERSIDADE MOGI DAS CRUZES
ALEXANDRA CUBAS
GABRIELE VITÓRIA BASTOS 
KATLYN DE ALMEIDA FELIZARDO DE SALES
LARISSA BARCELLOS PASQUETTO 
STHEFANI CAROLINE RAMOS
VIVIAN SILVA DO CARMO 
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA
Mogi das Cruzes, SP
2019
UNIVERSIDADE MOGI DAS CRUZES
ALEXANDRA CUBAS 11171400303
GABRIELE VITÓRIA BASTOS 11172001551
KATLYN DE ALMEIDA FELIZARDO DE SALES 11191402720
LARISSA BARCELLOS PASQUETTO 11181100881
STHEFANI CAROLINE RAMOS 11181502189
VIVIAN SILVA DO CARMO 11141503021
RELATÓRIO- ELETROFORESE 
Mogi das Cruzes, SP
2019
Sumário
41. INTRODUÇÃO	
1.1. ESTRUTURA DO DNA	4
1.2. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO	5
1.2.1. EcoRI	6
1.2.2. BamHI	6
1.2.3. HindIII	6
1.3. ELETROFORESE	7
1.3.1. Gel Agarose	7
1.4. DNA PLASMIDIAL	9
2. OBJETIVOS	10
2.1. OBJETIVO GERAL	10
2.2.OBJETIVO ESPECÍFICO	10
3. MATERIAIS E MÉTODOS	11
3.1. MATERIAIS	11
3.2. MÉTODOS	11
3.2.1. Digestão simples	11
3.3.2. Digestão dupla	11
4. RESULTADOS	13
5. CONCLUSÃO	18
6. REFERÊNCIAS	19
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1. INTRODUÇÃO
1.1. ESTRUTURA DO DNA
No ano de 1953, James Watson e Francis Crick, dois cientistas do Reino Unido, publicaram um artigo científico chamado Structure for DeoxyriboseNucleicAcid, onde abordaram sobre a estrutura do DNA (MOREIRA, 2003). 
Identificaram que o DNA era composto por duas cadeias helicoidais, onde cada uma era enrolada em seu próprio eixo; cada fita era composta por açúcar desoxirribose, fosfato e base nitrogenada (púricas e pirimídicas). Os açúcares eram unidos por uma cadeia de grupos fosfato ligados por uma ligação química fosfodiéster, com ligações de 3’ para 5’ e entre as fitas, fazia a se a ligação entre o açúcar e a base nitrogenada, que se encontram perpendicularmente às fitas, através das ligações de hidrogênio, sempre ligadas aos pares, uma base púrica ligada à uma pirimídica e com isso, as fitas são mantidas unidas. Esses pares de base são: adenina (púrica) com timina (pirimídica), e guanina (púrica) com citosina (pirimídica), ou seja, se de um lado da fita encontra se uma adenina, sua base complementar deve ser timina e isso também é válido para a guanina e a citosina (MOREIRA, 2003).
Ambas as cadeias seguem hélices que giram no sentido dextrógiro, mas, por causa do par, as sequências dos átomos nas duas cadeias vão a direções opostas, sendo uma fita sentido 3’ para 5’ e a outra, consequentemente, 5’ para 3’. Porém, para “conhecer” esse DNA estruturalmente para que ele sofra alguma modificação, é necessário “alcançá-lo” através do uso de enzimas de restrição, ou também denominadas endonucleases. Em 1970 essas enzimas foram descobertas e são produzidas naturalmente em bactérias para protegê-las contra a introdução do material genético viral. A bactéria reconhece o DNA viral como estranho e o destrói através das enzimas de restrição, que irão cortá-lo em vários fragmentos e com isso, impede a síntese de DNA, também a síntese de proteínas que irão compor a cápsula viral e consequentemente, impedem a replicação viral. (ROSELINO, 2008).
Essas enzimas são específicas para determinados sítios de restrição, ou seja, reconhecem apenas determinadas sequências de nucleotídeos e por isso não digerem o DNA da própria bactéria. Para que essas enzimas não degradem o DNA da bactéria que a sintetiza, ela criou um mecanismo de defesa, onde nesses sítios de restrições que são similares ao sítio de restrição viral, a bactéria adiciona nesse sítio um grupamento metil (CH3) e com isso, a enzima de restrição não reconhece esse sítio e não o degrada (ROSELINO, 2008).
Essas enzimas são utilizadas no método de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) e através dele, pôde-se fazer o sequenciamento de genomas, a determinação rápida da paternidade e, além disso, o diagnóstico rápido de doenças infecciosas, como as causadas pelos vírus da hepatite B e C, vírus dos herpes simples, vírus da rubéola, vírus do HIV, entre outros e também o diagnóstico de doenças genéticas. Na tecnologia forense, essa metodologia é usada na clonagem de um determinado fragmento de DNA, possibilitando sua clonagem, ou seja, através de uma pequena amostra de sangue pode-se obter a “impressão digital de DNA” dessa pessoa, fazendo assim comparações com os outros materiais genéticos coletados, sejam eles de vítimas e/ou suspeitos do caso. (NOVAIS, 2004).
1.2. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Dentro desse contexto, no século XX foram descobertas as enzimas de restrição, conhecidas também, como endonucleases. Esse evento proporcionou importantes avanços para a genética molecular e biotecnologia, levando até ao recebimento de prêmio Nobel aos pesquisadores Daniel Nathans, Werner Arber e Hamilton Smith, que esclarecem o mecanismo de ação dessas enzimas. (NASCIMENTO et al., 2003)
As enzimas de restrição são proteínas produzidas por bactérias para prevenir ou restringir a introdução de DNA exógeno. Elas atuam como “tesouras” de DNA cortando-o e inativando-o. As enzimas de restrição reconhecem e cortam sítios específicos ao longo da molécula de DNA, chamados sítios de restrição. (NASCIMENTO et al., 2003)
As enzimas do Tipo II são proteínas monoméricas ou diméricas e clivam o DNA no mesmo sítio do seu reconhecimento. Em geral, um sítio de restrição é uma sequência palindrômica de 4 a 8 pares de base e a sequência de bases de uma fita é a mesma da fita complementar, quando lida na direção oposta. (NASCIMENTO et al., 2003).
Hoje em dia, já foram identificadas mais de 1000 enzimas de restrição. Mas antes da ação das enzimas como ferramenta tecnológica, é necessária a extração do DNA através da lise física e/ou química, a separação das proteínas e membranas do DNA e a purificação do mesmo, após isso então, entram a ação das enzimas para clivagem (WALKER, 1999).
A nomenclatura desenvolvida para essas enzimas foi baseada na abreviação do nome do microrganismo do qual a enzima foi isolada. Nesse caso a primeira letra representa o gênero e as outras duas à espécie, seguido de um algarismo romano e/ou outra letra que indique a ordem da descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada. (NASCIMENTO, et al., 2003).
Figura 1 - Sequência de reconhecimento de bases nitrogenadas e o ponto de corte.
	Enzima
	Seqüência de corte no DNA
	Bam HI
	G ↓ GATC C 
C CTCG ↑ G
	Eco RI
	G ↓ AATT C 
C TTAA ↑ G
	Hind III
	A ↓ AGCT T 
T TCGA ↑ A
 
A (adenina), C (citosina), G (guanina) e T (timina)↓↑ = ponto de corte
Fonte: NOVAIS, C. M.; PIRES-ALVES, M. Enzimas de restrição. Revista Biotecnologia Ciências e Desenvolvimento, v. 33, p. 10–13, 2004.
1.2.1. EcoRI
EcoRI é uma enzima de restrição isolada a partir de cepas de Escherichiacoli. A sequência de ácido nucleico em que ocorrem os cortes é G’AATTC, e uma cria extremidade coesiva a qual permite a perfeita recombinação.
1.2.2. BamHI
BamHI é uma enzima de restrição, derivada de Bacillusamyloliquefaciens. A sua sequência de reconhecimento é G'GATCC, e deixa uma extremidade coesiva.
1.2.3. HindIII
Hindlll é uma enzima de restrição produzida pelo microrganismo Haemophilusinfluenzae que possui um local de restrição de cadeia dupla dependente de uma sequência metilada, palindrómica e assimétrica, sobre a qual a sua atividade catalítica de hidrolase gera extremos coesivos.
1.3. ELETROFORESE
O termo eletroforese descreve a migração de uma partícula carregada sobre influência de um campo elétrico. É uma técnica utilizada para separar, identificar e purificar moléculas carregadas, como DNA e proteínas (GOUVEIA E REGINATO, 2000). 
A técnica apresenta basicamente um sistema de suporte (gel de agarose), um tampão no qual estão imersos o gel e os eletrodos nas extremidades da cuba onde estão contidos o tampão e o gel (SAMBROOK E RUSSEL, 2002).
Várias moléculas, como aminoácidos, peptídeos, proteínas, nucleotídeos, e ácidos nucléicos, possuem grupos funcionais ionizáveis e, portanto,adquirem carga positiva ou negativa em um determinado valor de pH. Quando submetemos a um campo elétrico, as partículas carregadas irão migrar para o ânodo, devido a carga negativa das moléculas de DNA. Para análise de eletroforese é necessário basicamente dois itens: uma fonte de tensão e uma unidade de eletroforese; essas unidades são divididas em duas formas: gel de agarose, a qual promove a migração no sentido horizontal e o gel de poliacrilamida que realiza a migração no sentido oposto (WILSON E WALKER,2013).
Como os ácidos nucléicos (DNA e RNA) possuem carga elétrica negativa (devido ao grupamento fosfato) eles sempre migraram em direção ao pólo positivo, por tanto o fator determinante da taxa de migração será a massa da molécula (GOUVEIA E REGINATO, 2000).
1.3.1. Gel Agarose
O gel de agarose é um polissacarídeo linear não absorvível, não fermentável e atóxico, extraído de diversos gêneros de algas marinhas. Apresentam em sua composição diversas substâncias como fibras, sais minerais e proteínas, que podem interferir na migração proteica. Por isso, a pureza do ágar utilizado é que vai determinar o sucesso do fracionamento das proteínas (NAOUM, 2012). 
A escolha do corante ideal é fundamental para o sucesso do fracionamento eletroforético, pois uma boa revelação das frações permite que as análises quantitativas e qualitativas tenham maior sensibilidade e reprodutibilidade (NAOUM, 2012). 
O brometo de etídio é o exemplo mais usual; esse corante se intercala entre as bases dos ácidos nucléicos e, na presença de luz ultravioleta, fluoresce em vermelho alaranjado. Com este método pode-se detectar uma quantidade igual ou maior de 10 mg de DNA e a intensidade de fluorescências emitida é proporcional à concentração de DNA presente na amostra. O brometo de etídio pode ser empregado de três distintas formas, sendo elas: aplicado diretamente no gel; aplicado no tampão da amostra e/ou após a corrida quando o gel é submergido em solução de EtBr (NAOUM, 2012).
Figura 2 - Representação esquemática dos equipamentos necessários para a realização da eletroforese.
1 - Gel; 2 - Aplicação do marcador; 3 - Aplicação das amostras; 4 - Indução de corrente elétrica; 5 - Deslocamento e separação dos fragmentos; 6-Eletroforese realizada.
Fonte: SCITABLE. Gel electrophoresis 2014.
1.4. DNA PLASMIDIAL 
O DNA plasmidial, é uma molécula de DNA circular que se replica separadamente do cromossomo hospedeiro. A grande variedade de plasmídeos bacterianos que ocorre naturalmente varia de tamanho de 5.000 a 400.000 pb. Muitos dos plasmídeos encontrados em populações bacterianas são um pouco mais do que parasitas moleculares, semelhantes aos vírus, mas com capacidade mais limitada de se transferir de uma célula para outra. Para sobreviver na célula hospedeira, os plasmídeos incorporam várias sequências especializadas que os tornam capazes de utilizar a energia das células para sua própria replicação e expressão gênica. Os plasmídeos de ocorrência natural têm um papel simbiótico na célula: são capazes de fornecer genes que conferem resistência a antibióticos ou que realizam novas funções para a célula (NELSON, David L, 2014).
Portanto, neste trabalho foram realizados a digestão enzimática, simples e dupla, utilizando um DNA plasmidial (lambda HindIII), junto com enzimas de restrição, como Eco RI, Hind III e Bam H, com a finalidade de montar um mapa de restrição de um DNA plasmidial a partir da eletroforese em gel agarose.
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Realizar a digestão enzimática, simples e dupla e montar um mapa de restrição de um DNA plasmidial a partir dos dados obtidos após eletroforese em gel de agarose.
2.2.OBJETIVO ESPECÍFICO
Realizar a digestão enzimática simples utilizando a endonuclease HindIII;
Realizar a digestão enzimática dupla utilizando as endonucleases HindIII e BamHI;
Montar um mapa de restrição da digestão simples, dupla e tripla com base nos dados obtidos após eletroforese em gel de agarose
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. MATERIAIS
Agarose
Água destilada
Amostra de DNA 
Brometo de etídeo (1 g/ml)
Câmara com transiluminador
Cuba para eletroforese
Erlenmeyer
Fonte para eletroforese
Micropipeta de volume ajustável;
Ponteiras azuis (1000 μL = 1mL);
Tampão de corrida
3.2. MÉTODOS
3.2.1. Digestão simples
Em um tubo de 200 µL, adicionou-se 5 µL de DNA plasmidial previamente extraído e amplificado, 2 µL de tampão da enzima HindIII, 1 µL da endonuclease de restrição HindIII e 12 µL de água autoclavada Milli-Q®. 
3.3.2. Digestão dupla
Em um tubo de 200 µL, adicionou-se 5 µL de DNA plasmidial previamente extraído e amplificado, 2 µL de tampão da enzima HindIII, 1 µL de endonuclease de restrição HindIII, 1 µL de endonuclease de restrição BamHI e 11 µL de água autoclavada Milli-Q®. 
Após montadas as duas reações, simples e dupla, colocou-se os tubos em banho-Maria a 37°C por 30 minutos. Enquanto isso, preparou-se o gel de agarose 0,8% em tampão TBE 1X previamente diluído, aquecendo e dissolvendo a agarose num Erlenmeyer sobre a chama do bico de Bünsen. Posteriormente ao resfriamento parcial, despejou-se o conteúdo do erlenmeyer sobre a cuba de acrílico para se concluir a gelificação.
Adicionou-se então ao tubo contendo o DNA digerido 5 µL de corante à base de azul de bromofenol, xylenocianol e glicerol (previamente diluído a 50%) e homogeneizou-se. 
Aplicou-se então as amostras nos poços no gel de agarose e iniciou-se a corrida eletroforética numa corrente de aproximadamente 120 volts por 45 minutos. Corou-se o gel em solução de brometo de etídio em TBE 1x e registrou-se os resultados em foto documentador para posterior análise.
4. RESULTADOS
Foi utilizado na aula prática um DNA plasmidial (lambda HindIII) que tem formato circular, junto com enzimas de restrição, como Eco RI, HindIII e Bam H, afim de realizar digestão simples e dupla.
Após aplicar as amostras do material nos poços do gel de agarose, foi realizada a eletroforese e visto as bandas no transluminador, obtivemos o resultado apresentado na figura 1. 
Figura 3 – Fotografia do gel
Legenda - Poço 1 = λ/Hind III (DNA plasmidial) / Poço 2 = Grupo 2 – Simples (Eco RI) / Poço 3 = Grupo 2 – Dupla (Eco RI + HindIII) / Poço 4 = Grupo 11 – Simples (HindIII) / Poço 5 = Grupo 11 – Dupla (Eco RI + Bam HI) / Poço 6 = Grupo 3 – Simples (Bam HI) / Poço 7 = Grupo 3 – Dupla (Eco RI + Bam HI) / Poço 8 = Grupo 10 – Simples (Eco RI) / Poço 9 = Grupo 10 – Dupla (Eco RI + Bam HI) / Poço 10 = Grupo 4 – Simples (HindIII) / Poço 11 = Grupo 4 – Dupla (Bam HI + HindIII) / Poço 12 = Grupo 9 – Simples (Bam HI) / Poço 13 = Grupo 9 – Dupla (Bam HI + HindIII) / Poço 14 = Marcador 100pb (100, 200, 300... até 1500, 2000)
A seguir, nas figuras 4,5 e 6 estão representados os mapas de restrição no DNA plasmidial com digestão simples de cada enzima.
Figura 4 – Mapa de restrição da enzima Eco RI.
 
	Enzima de restrição Eco RI.
Figura 5 – Mapa de restrição da enzima HindIII.
Enzima de restrição HindIII.
Figura 6 – Mapa de restrição da enzima Bam Hi.
Enzima de restrição Bam Hi.
Nas figuras 7,8 e 9, com a digestão dupla, onde foram usadas duas enzimas no DNA plasmidial.
Figura 7 – Mapa de restrição das enzimas Eco RI + Bam Hi.
Enzima de restrição Bam Hi. Enzima de restrição Eco RI.
Figura 8 – Mapa de restrição das enzimas Bam Hi + HindIII.
Enzima de restrição Bam Hi. Enzima de restrição HindIII.
Figura 9 – Mapa de restrição das enzimas Eco RI + HindIII.
Enzima de restrição Eco RI . Enzima de restrição HindIII.
Na figura 10, é possível analisar o mapa de restrição triplo onde mostra o corte das três enzimas no DNA plasmidial.
Figura 10 – Mapa de restriçãotriplo das enzimas Eco RI + HindIII + Bam Hi.
Enzima de restrição Eco RI / Enzima de restrição HindIII
 Enzima de restrição Bam Hi.
6. DISCUSSÃO
As enzimas de restrição são responsáveis pelos cortes no DNA a partir de um reconhecimento de sequencias alvo, ou seja, locais específicos (sítios de restrição) no DNA em questão, estas enzimas cortam o DNA sempre entre o mesmo par de nucleotídeos em ambas as fitas. O DNA utilizado neste experimento, foi o DNA plasmidial, este DNA é circular de origem bacteriana e possui capacidade de replicação independente do DNA cromossômico, por exemplo (NASCIMENTO, et al.,2003). 
Cada tipo de enzima produz um tipo de corte quando entram em contato com o DNA. Existem enzimas, por exemplo, que realizam cortes cegos, onde há o corte simétrico das fitas e resulta em duas extremidades abruptas. Já algumas enzimas produzem cortes coesivos, como é o caso das enzimas de restrição utilizadas no procedimento aqui apresentado. O corte coesivo, é realizado no mesmo local nas duas fitas, resultando assim em extremidades assimétricas, que se sobrepostas, são iguais. Os cortes realizados pelas enzimas de restrição utilizadas, EcoRI, HindIII e Bam Hi, podem ser vistos como na figura 3 e ambas enzimas produziram cortes coesivos do DNA plasmidial. 
A partir da amostra conhecida no poço 1 de λ/Hind III e com o marcador de 1000pb no poço 14, pôde-se obter uma comparação dos tamanhos dos pares de base de cada DNA, sendo eles os de digestão simples e digestão dupla e estes estão demostrados na figura 3 seguido de sua legenda.
Com a aplicação da corrente elétrica, pôde-se notar a migração das moléculas de DNA do polo negativo em direção ao polo positivo, as moléculas menores se aproximaram mais do polo positivo, enquanto as maiores, do polo negativo. Isso ocorre, já que as moléculas de DNA são carregadas negativamente, logo, moléculas menores tendem a correr mais rapidamente para o polo positivo quando estimuladas por correntes elétricas, já as maiores tendem a correr mais lentamente (NASCIMENTO, et al.,2003).
A visualização da corrida no gel é possível graças a utilização de um corante que ao se ligar ao DNA, apresenta bandas, que são os fragmentos de DNA. Esta corrida foi realizada em gel de agarose, deve-se considerar que este gel tendo em vista a concentração em que é preparado pode não disseminar alguns pb, então, quanto maior a concentração, maior será a disseminação destes pb (NAOUM, 2012). 
O DNA contendo a enzima EcoRI apresentou duas digestões vistas no gel, com duas bandas com os tamanhos de 800pb e 4300pb, figura 3 e 4. O DNA contendo a enzima HindIII também apresentou duas digestões vistas no gel com tamanho de 4100pb e 1000pb, figura 3 e 5. Já o DNA contendo a enzima BamHi apresentou somente uma digestão vista no gel com tamanho de 5100pb figura 3 e 6. Essa única banda observada poderia significar que o DNA pode ter sido digerido ou não, a confirmação da digestão pode se dar a partir da comparação com as outras enzimas, por exemplo, comparar o resultado de BamHi+EcoRI que podem ser vistas nas figuras 1 e 7. Como ocorreu a digestão pode-se então verificar que o DNA possuía o tamanho de 5100pb.
Para as digestões duplas, foi verificado que o DNA com EcoRI e BamHi apresentou três bandas no gel, mantendo a banda de 800pb em comum e digerindo os 4300pb restantes em 3000pb (BamHi) e 1300pb (EcoRI) ou seja, tanto EcoRI (duas digestões) como BamHi (uma digestão) realizaram a digestão do DNA, figura 1 e 7. O DNA contendo BamHi e HindIII apresentou três bandas no gel, com tamanho de 2600pb (BamHi), 1000pb e 1500pb (HindIII), assim BamHi digeriu uma única vez e HindIII duas vezes, figura 3 e 8. E o DNA contendo EcoRI e HindIII apresentou quatro bandas no gel, onde foi mantida a banda de 800pb em comum e digeriu o restante em 500pb, 1000pb e 2800pb, sendo duas digestões de EcoRI e duas digestões de HindIII figura 3 e 9. Sabendo então o tamanho das bandas do DNA digerido com as enzimas, foi criado o mapa de restrição triplo apresentado na figura 10.
Os resultados obtidos foram eficientes e atenderam a expectativa daquilo que era esperado em laboratório. A partir do trabalho realizado, pôde-se obter então a digestão enzimática do DNA através das enzimas de restrição utilizadas, onde foi possível a criação dos mapas de restrição e visualização dos mesmos. Todo procedimento foi realizado utilizando os materiais e equipamentos disponíveis no laboratório da UMC e este trabalho foi construído a partir dos resultados obtidos e da literatura disponível. 
7. CONCLUSÃO
Ao término deste trabalho de pesquisa concluímos que a eletroforese é um processo analítico de separação de misturas, cujo principal agente é o campo elétrico. 
Tendo em vista os aspectos analisados na eletroforese, os grupos de uma forma geral apresentaram um bom resultado, não apresentamos dificuldade para realizar o teste proposto no roteiro, que nos resultou em boas bandas de DNA. 
A eletroforese é de grande importância para as ciências, permitindo a separação e identificação de moléculas de DNA por meio da diferença de velocidade de migração, identificação de pessoas em testes de paternidade pela comparação de DNA, na indústria farmacêutica e até mesmo na agropecuária.
Desta forma o procedimento sucedeu de forma produtiva e satisfatória, visto que aprimorou o conhecimento em aula através da técnica de eletroforese.
8. REFERÊNCIAS
GOUVEIA, J. J. de S.; REGITANO, L. C. de A.. Protocolo de biologia molecular – Eletroforese de Ácidos Nucléicos, 2000. Disponível em: https://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/CPPSE/17542/1/PROCILCAR2007.00420.pdf> Acesso em: 15 de setembro de 2019.
MOREIRA, ldeu de Castro. 50 Anos da dupla hélice e as contribuições da física, 2003.. Disponível em < http://www.sbfisica.org.br/fne/Vol4/Num1/a03.pdf> Acesso em: 16 de setembro de 2019.
NAOUM, P. C. Eletroforese: Hemoglobinopatias, Proteínas Séricas, Lipoproteínas e DNA. São Paulo: Editora Santos. 2012. 
NASCIMENTO, A.A. C; et. al. Tecnologia do DNA recombinante, 2003. Disponível em: < http://rbp.fmrp.usp.br/sites/default/files/apostilatd_2005.pdf> Acesso em: 17 de setembro de 2019.
NOVAIS, C. M.; PIRES-ALVES, M..PCR em tempo real, 2008. Disponível em Acesso em <http://rca.umc.br/file.php/339/Artigos/PCR_em_tempo_Real_-_portugues.pdf> Acesso em:14 de setembro de 2019.
NOVAIS, C. M.; PIRES-ALVES, M. Enzimas de restriçaõ. Revista Biotecnologia Ciências e Desenvolvimento, v. 33, p. 10–13, 2004.
ROSELINO, A. M.. Biologia molecular aplicada às dermatoses tropicais, 2008. Disponível em < http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0365-05962008000300002 24 Acesso em:16 de setembro de 2019.
SAMBROOK. J.; RUSSEL, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3.ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 2002. 
SCITABLE. Gel electrophoresis 2014. Disponível em: <http://www.nature.com/scitable/definition/gel-electrophoresis-286>. Acesso em: 16 de setembro de 2019
WILSON & WALKER. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology, 7ed. Page 399. Disponivel em < http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/bmb.20499/full > Acesso em:18 de setembro de 2019.
NELSON, David L. Princípios de bioquímica de Lehninger [recurso eletrônico]; [tradução: Ana Beatriz Gorini da Veiga ... et al.] ; revisão técnica: Carlos Termignoni ... [et al.]. – 6. ed. – Dados eletrônicos. – Porto Alegre :Artmed, 2014.
Relatório de aula prática na disciplina de BIOTECNOLOGIA do curso de FARMÁCIA, destinada a professora MARCELA ARAÚJO MANFREDI, com o objetivo de obter menção na M1.
4300 pb
5100 pb
800 pb
4100 pb
5100 pb
1000 pb
5100 pb
5100 pb
3000 pb
1300 pb
5100 pb
800 pb
2600 pb
5100 pb
1500 pb
1000 pb
1000 pb
2800 pb
5100pb
500 pb
800 pb
1500 pb
1000 pb
5100 pb
1300 pb
500 pb
800 pb
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