APOSTILA_MICRO-ALIMENTOS_ATUALIZADA_2016 2

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Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
 
 
 
 
ENGENHARIA DE ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 
APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS 
 
 
 
 
 
 
 
Profa. Dra. Ana Flávia Santos Coelho 
Profa. Dra. Juliana Fonseca Moreira da Silva 
 
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Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
SUMÁRIO 
 
Normas para trabalho em laboratório de microbiologia ----------------------------------------03 
 
Considerações gerais ----------------------------------------------------------------------------------04 
 
Relatórios--------------------------------------------------------------------------------------------------05 
 
Aula prática nº01- Coleta, transporte e estocagem de amostras para análise 
microbiológica---------------------------------------------------------------------------------------------06 
 
Aula prática nº02 - Recepção e preparo de amostras para análise microbiológica--------
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------09 
 
Aula prática nº03 – Controle da população microbiana I --------------------------------------13 
 
Aula prática nº04 – Controle da população microbiana II -------------------------------------16 
 
Aula prática nº05 – Controle da população microbiana III ------------------------------------18 
 
Aula prática nº06 - Contagem total de microrganismos aeróbios mesófilos e 
psicrotrófilos em placas --------------------------------------------------------------------------------20 
 
Aula prática nº07 - Contagem total de bolores e leveduras em placas --------------------23 
 
Aula prática nº08 - Análise microbiológica de água potável ----------------------------------26 
 
Aula prática nº09 - Análise microbiológica de frutas e hortaliças ---------------------------29 
 
Aula prática nº10 - Análise microbiológica de produtos cárneos ----------------------------33 
 
Aula prática nº11 - Análise microbiológica de produtos lácteos -----------------------------37 
 
Anexo 1 ----------------------------------------------------------------------------------------------------39 
Anexo 2 ----------------------------------------------------------------------------------------------------41 
Anexo 3 ----------------------------------------------------------------------------------------------------42 
Anexo 4 ----------------------------------------------------------------------------------------------------43 
Anexo 5 ----------------------------------------------------------------------------------------------------45 
Anexo 6 ----------------------------------------------------------------------------------------------------49 
Referências Bibliográficas -----------------------------------------------------------------------------50 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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NORMAS PARA TRABALHO EM LABORATÓRIO DE 
MICROBIOLOGIA 
 
1. Os alunos deverão adquirir, para uso individual, o seguinte material: 
a) Fósforo ou isqueiro. 
b) Caneta de retro projetor. 
c) Lápis preto Nº 2 e de cor. 
2. O uso do avental é obrigatório. 
3. Os alunos deverão respeitar os horários das aulas e estarem sempre munidos do 
material. 
4. O laboratório deve ser um recinto calmo. Os alunos devem ocupar sempre o mesmo 
lugar, evitando falar em voz alta e sair, desnecessariamente de seus lugares. 
5. Deve ser evitado o acúmulo de objetos sobre a bancada. 
6. Em caso de acidente ou dano em equipamento, o professor deve ser comunicado 
imediatamente. 
7. As alças, pinças, pipetas, tubos e demais materiais devem ser acondicionados em 
local apropriado. 
8. Todo o material contaminado deve ser descartado em recipiente apropriado. 
9. O aluno deve seguir com rigor todas as normas de segurança, principalmente no 
manuseio de material contaminado e bico de gás. 
10. Ao acender o bico de gás, aproximar primeiro a chamo do bico e em seguida abrir o 
registro de gás, a chama deverá ficar acesa somente o tempo necessário para 
realização dos trabalhos. 
11. Alunos com cabelo comprido devem prendê-lo. 
12. Os alunos devem utilizar sapatos adequados, fechados. 
13. As alças, agulhas e espátulas de repicagem devem ser flambadas antes e após sua 
introdução nos tubos de cultura. Estes deverão ter as suas bocas flambadas após a 
retirada da rolha e também antes de recolocá-la. 
14. Ler o roteiro de aulas práticas antes de iniciar os trabalhos. 
15. Os meios de cultura utilizados devem ser devidamente identificados e acondicionados 
em local apropriado. 
16. Antes de qualquer observação microscópica, devem ser verificadas as condições 
gerais do microscópio. Para a objetiva de imersão (100x), sempre utilizar o óleo de 
imersão. 
17. Após o uso do microscópio com objetiva de imersão, limpar a lente com lenço de 
papel. 
18. Ao término da aula prática, guardar todo o material utilizado deixando a bancada 
pronta para ser utilizada pela próxima turma. 
19. Lavar sempre as mãos com água e sabão antes de deixar o laboratório. 
20. Manter portas e janela fechadas. 
 
 
 
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CONSIDERAÇÕES GERAIS 
 
1.1 CONSIDERAÇÕES DE SEGURANÇA 
 
Utilizar as barreiras de proteção necessárias a cada procedimento. 
Toda amostra deve ser tratada como potencialmente patogênica. 
Usar frascos e meios de transporte apropriados. 
Não manusear a amostra em trânsito. 
 
1.2 USO DO MICROSCÓPIO 
 
FOCALIZAÇÃO COM OBJETIVAS DE AUMENTO 10 E 45 X. 
 
1- Retirar a cobertura do microscópio; 
2- Ligar a lâmpada; 
3- Centrar o microscópio observando a posição da objetiva, do condensador e do 
diagrama, para se obter um campo bem iluminado; 
4- Colocar a lâmina preparada na platina do microscópio e com a objetiva de 10 X 
em posição de foco, abaixar o canhão do microscópio por meio do parafuso 
macrométrico até o aparecimento da imagem. Com o parafuso micrométrico, ajustar a 
sua nitidez; 
5- Sem mover o canhão e a platina do microscópio, mudar a objetiva para o aumento 
de 45X. Caso haja necessidade, ajustar a iluminação e foco (micrométrico). 
 
FOCALIZAÇÃO COM OBJETIVA DE IMERSÃO 
 
1- Retirar a cobertura do microscópio; 
2- Ligar a lâmpada; 
3- Suspender o condensador ao máximo. Abrir todo o diagrama. Verificar se o campo 
do microscópio está bem iluminado; 
4- Colocar a lâmina, com uma gota de óleo para imersão sobre o objeto a ser 
observado; 
5- Baixar o canhão do microscópio de modo a mergulhar a objetiva de imersão no 
óleo. Suspender o canhão do microscópio por meio do parafuso micrométrico até o 
aparecimento da imagem e focalização do objeto. 
 
 
 
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RELATÓRIOS 
Os relatórios são documentos preparados com o objetivo de estabelecer um 
balanço dos resultados alcançados por um programa de trabalho. Desta forma, o 
relatório deverá conter e abranger o conjunto de práticas executadas sobre um mesmo 
assunto e deverá ser composto dos resultados obtidos na prática, no Inal de cada 
prática existe um questionário que deverá ser entregue via moodle e individual. 
O cabeçalho do relatório deverá conter : 
1- Titulo da prática 
2- Nome do aluno 
3- RESULTADOS: Os resultados de acordo com o questionário e 
acompanhados, se necessário de desenhos e tabelas. 
4- .CONCLUSÃO: Interpretação dos resultados restrita aos dados obtidos ou 
seja, os resultados foram os esperados? 
 
OPCIONAL 
Sugestões: Os alunos podem e devem apresentar sugestões paraa melhoria das 
aulas práticas, bem como para a resolução de dúvidas surgidas no decorrer dos 
trabalhos. 
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Aula Prática nº 01 
 
 
COLETA, TRANSPORTE E ESTOCAGEM DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE 
MICROBIOLÓGICA 
 
 
Objetivo: Fornecer ao aluno noções básicas sobre os procedimentos de coleta, 
transporte e estocagem de amostras para análise microbiológica. 
 
Plano de amostragem: A coleta de amostras para a avaliação de lotes de 
alimentos processados, deve obedecer a planos de amostragem que permitam 
tomar decisões a respeito do destino dos lotes. Para a seleção de planos de 
amostragem adequados a cada tipo de produto, consultar International Commision 
on Microbiological Specifications for Foods (1978), cujas recomendações foram 
adotadas como oficiais pela Resolução RDC n° 12, de 02/01/01 da Agência Nacional 
de Vigilância Sanitária (ANVISA) (Anexo 1). 
 
1. Definções 
 
Lote: quantidade de alimento de mesma composição e características físicas, 
químicas e sensoriais, produzidos sob mesma condição, com produção dentro de 
um intervalo de tempo em uma linha de produção. 
 
Amostra de lote: Determinado número de entidades individuais escolhidas ao 
acaso. 
 
Unidade de amostra: são as entidades individuais. 
 
Unidade analítica: é a quantidade de alimento efetivamente utilizada na análise de 
uma unidade de amostra. 
 
A unidade de amostra tem uma quantidade variável de produto devendo sempre 
tomar o cuidado de tomar quantidades suficientes para estocagem de contra- 
amostras e prevenção de perdas por acidentes. 
Uma amostra de lote é composta de “n” unidades de amostra e cada unidade de 
amostra é sempre analisada individualmente. Os resultados da análise de uma única 
amostra não podem ser tomados como representativos do lote. 
 
2. Coleta de amostras para análise 
 
2.1 Alimentos acondicionados em embalagens individuais 
 
• Coletar e encaminhar o alimento ao laboratório para análise em sua 
embalagem comercial original, fechada e intacta; 
• A embalagem unitária deverá conter quantidade de alimento maior que 
duas vezes o peso ou volume da unidade analítica, no mínimo. Se não, 
recomenda-se coletar várias embalagens unitárias, como parte de uma 
mesma unidade de amostra. No momento da análise, juntar o conteúdo das 
diversas embalagens em um único frasco estéril, misturando bem e retirar a 
unidade analítica da mistura. Se o produto não permitir mistura, tomar de cada 
uma das embalagens unitárias, porções de peso aproximadamente igual, para 
compor a unidade analítica daquela unidade de amostra. 
 
 
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2.2 Alimentos acondicionados em embalagens não individuais 
 
• Exemplo: alimentos contidos em tanques ou grandes embalagens, 
impossíveis de serem transportadas para o laboratório. 
• Transferir porções representativas da massa total para frascos de coleta 
ou sacos estéreis (material aprovado para contato com alimentos, 
autoclavável, tampa a prova de vazamento, tamanho adequado – 
quantidade recomendável 
• 200g de alimentos sólidos ou 300-500mL de produtos líquidos), sob 
condições assépticas; 
• Utilizar no máximo ¾ da capacidade do frasco de coleta na tomada da unidade 
analítica para facilitar posterior mistura da amostra na tomada da unidade 
analítica; 
• Frascos e utensílios utilizados na coleta devem ser previamente 
esterilizados; 
 
Procedimento para coleta: promover uma mistura de toda a massa de alimento 
antes de iniciar a coleta das unidades de amostra. Se não for possível a mistura, 
compor a unidade de amostra com porções de diferentes partes do conteúdo. 
 
Obs.: Para amostras em pó utilizar amostradores. Usar um amostrador estéril 
diferente para cada unidade de amostra coletada ou desinfetar o instrumento entre 
uma amostragem e outra. Para compor uma unidade de amostra com porções de 
diferentes pontos em amostras sólidas, usar facas e pinças para cortar pedaços 
menores do alimento. 
 
2.3 Alimentos envolvidos em surtos de toxinfecções alimentares 
 
• Coletar a amostra o mais cedo possível; 
• Não coletar amostras que tenham sofrido abuso de temperatura ou que já se 
encontrem em estado de parcial deterioração; 
• Se não houver sobras do alimento suspeito: 
• Coletar vasilhames onde o mesmo encontrava-se acondicionado; 
o Coletar amostras do lote de ingredientes e matéria-prima 
utilizados em seu preparo; 
o Coletar amostras de refeições similares, preparadas 
posteriormente sob as mesmas condições. 
 
 
2.4 Água 
 
As amostras de água clorada devem ter o cloro residual neutralizado imediatamente 
após a coleta, para a continuação do seu efeito bactericida sobre a microbiota 
presente. 
• Procedimento de neutralização: Adicionar 0,1mL de uma solução 10% de 
tiossulfato de sódio aos frascos de coleta, antes da esterilização, para cada 
100mL de amostra que se pretende coletar. 
• Para amostras de torneiras e tubulações limpar a área externa com etanol 70%, 
flambar se o material for resistente ao fogo e deixar a água fluir por 2 a 3 
minutos antes da coleta; 
• Caso aconteça da amostra ser coletada e enviada ao laboratório pelo próprio 
interessado, sem prévia neutralização do cloro, adicionar a solução de 
tiossulfato de sódio estéril, imediatamente após a chegada da amostra, sob 
condições assépticas. 
 
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3. Informações que devem acompanhar a amostra 
 
• Tipo de amostra e processo utilizado na fabricação; 
• Fabricante, data de fabricação, código do lote; 
• Solicitante da análise; 
• Data e local de coleta da amostra; 
• Razão da análise. 
 
4. Transporte e estocagem das amostras para análise 
 
• Regra geral: transportar e estocar amostras de alimentos da mesma forma como
 o produto é normalmente transportado e estocado na sua comercialização: 
 
Tipos de alimentos Transporte e estocagem 
Estéreis em embalagens herméticas 
Temperatura ambiente e protegidos de temperaturas 
acima de 45ºC. Obs: Latas estufadas deverão ser 
transportadas e mantidas sob refrigeração. 
Desidratados, secos ou concentrados Temperatura ambiente e protegidos contra a umidade. 
Perecíveis comercializados na forma 
Refrigerada 
Refrigerados até o momento da análise. O tempo de 
estocagem máxima da amostra não deverá ultrapassar 36 
horas. 
Perecíveis comercializados na forma 
Congelada 
Congelados até o momento da análise. A temperatura de 
estocagem não deve ser superior a –10ºC. 
 
 
• O transporte de amostras perecíveis resfriadas ou congeladas pode ser 
feito em caixa de isopor com gelo (mantido dentro de sacos plásticos, para 
evitar o acúmulo de líquido nas caixas, durante 24-30 horas se bem 
fechadas e com gelo suficiente, envolvendo toda amostra); 
 
• No transporte prolongado usar gelo seco. 
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Aula Prática nº 02 
 
RECEPÇÃO E PREPARO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA 
 
Objetivo: Fornecer ao aluno noções básicas sobre a importância dos procedimentos 
de recepção e preparo de amostras para análise microbiológica de maneira a obter 
resultados laboratoriais válidos. 
 
 
1. Recepção 
 
• Observar as condições da embalagem; 
 
• Observar as condições em que foi feito o transporte; 
 
• Recusar qualquer amostra com embalagem rasgada, furada, violada, com 
corpos estranhos; 
 
• No caso de amostras encaminhadas por consumidores (embalagem aberta) 
anotaras condições em que a embalagem foi recebida. 
 
2. Preparação 
 
 
Etapas: 
 
• Retirada da unidade analítica; 
 
• Preparação de diluições decimais seriadas da unidade analítica, para 
inoculação nos meios de cultura. 
 
Técnica de diluição decimal seriada (Figura 1): 
 
• O diluente utilizado deve ser o mesmo em todas as diluições (Tipos de solução 
diluente – Anexo 2); 
 
• O número de diluições requeridas dependerá do nível de contaminação; 
 
• Na transferência de volumes entre as diluições, usar sempre pipetas diferentes 
para cada diluição, e que tenham capacidade no máximo 10 vezes superior ao 
volume a ser pipetado. A pipeta deve ser completamente preenchida e o 
volume descarregado a partir da marca superior, com a ponta da pipeta 
encostada na parede interna do tubo. 
 
Obs.: Não flambar pipetas. 
 
Figura 1. Esquema do preparo da diluição decimal seriada. 
 
2.1 Preparação de amostras de alimentos sólidos ou líquidos concentrados 
 
 
 
a) Antes de abrir a embalagem desinfetar a área externa com etanol 70% (Tipos de 
solução desinfetante – Anexo 2) para remover contaminantes presentes; 
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b) Promover a homogeneização da amostra; 
c) Abrir a embalagem utilizando um utensílio (faca, tesoura etc) previamente 
esterilizado. O intervalo entre a homogeneização e a retirada da unidade analítica 
não deverá exceder 15 minutos; 
d) Retirar assepticamente a unidade analítica (25 gramas para maioria dos 
alimentos) da amostra a ser utilizada na análise e transferir para um frasco de 
homogeneização esterilizado e tarado. 
 
Casos especiais: 
 
 
e) Adicionar o diluente e homogeneizar (pode-se agitar manualmente o frasco, usar 
“shaker” rotativo, triturar em liquidificador 8000 -15000rpm durante 1 a 2 min., 
usar “stomacher” por 30 a 60 segundos) a unidade analítica para permitir diluição 
e inoculação nos meios de cultura. O intervalo entre a homogeneização e o 
preparo das diluições não deverá ultrapassar 3 minutos; 
 
 
2.2 Preparação de amostras líquidas 
 
 
a) Antes de abrir a embalagem desinfetar a área externa com etanol 70% (Tipos de 
solução desinfetante – Anexo 3) para remover contaminantes presentes. Abrir a 
embalagem utilizando utensílio (faca, tesoura etc) previamente esterilizado; 
b) Para amostras líquidas promover a agitação quando acondicionadas em frascos 
com espaço suficiente, antes da retirada da unidade analítica. Se não houver 
espaço suficiente, utilizar um segundo frasco estéril, transferindo a amostra de 
um frasco para outro por três vezes; 
c) Realizar a diluição decimal seriada (primeiramente transferindo 1,0mL da 
amostra para 9,0mL de diluente ou 10mL da amostra para 90mL de diluente ou 
ainda 25 a 50mL para 225mL a 450mL de diluente, dependendo do grau de 
contaminação esperado); 
 
Obs.: Amostras de bebidas e refrigerantes gaseificadas, quando não analisadas 
pelo método de filtração em membrana, devem ser agitadas, em frasco estéril, até 
expulsão completa dos gases. 
 
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 d) O intervalo entre a retirada da unidade analítica não deve ultrapassar 3 minutos; 
 
 
2.3 Preparação de amostras pela técnica da lavagem superficial 
 
• Transferir toda a amostra ou parte dela (50g) para um frasco estéril tarado e 
pesar; 
• Adicionar o volume de diluente requerido para diluição inicial desejada (1:1 na 
maioria dos casos); 
• Lavar a amostra agitando vigorosamente o frasco por cerca de 50 vezes; 
• Realizar as diluições e proceder a análise microbiológica; 
 
Cálculo dos resultados 
 
Os resultados podem ser expressos em unidades formadores de colônias 
(UFC/grama) ou em número mais provável (NMP/grama); 
• Primeiramente calcular em UFC ou NMP por mL de água de 
lavagem, em função das diluições inoculadas dessa água, com 
concentração inicial de 100; 
• Em seguida, converter o UFC ou NMP obtido em UFC ou NMP por 
grama de amostra, em função da diluição inicial utilizada na lavagem 
(peso de amostra: volume de diluente). 
o Exemplo: Se a diluição for 1:1, cada mL de lavado corresponderá 
a 1,0g de amostra e o valor do NMP ou UFC/g será igual ao valor 
obtido por mL. Se a diluição for diferente de 1:1, deve-se primeiro 
calcular a quantos gramas de amostra corresponde 1,0mL de 
lavado. Por exemplo: se uma carcaça de frango de 1,5kg for lavada 
com 300mL de diluente, cada mL de lavado corresponderá a 5,0g de 
amostra. Neste caso o NMP ou UFC/g de amostra será igual ao 
NMP ou UFC/mL de lavado, dividido por cinco. 
 
2.4 Preparação de amostras pela técnica do esfregaço de superfície 
 
• Delimitar a área amostrada usando um molde estéril; 
• Aplicar o swab” com pressão, numa inclinação aproximada de 45º, 
descrevendo movimentos da esquerda para direita e depois de cima 
para baixo. Rodar continuamente o “swab” para que toda superfície 
do algodão entre em contato com a amostra. Se a superfície estiver 
seca, umedecer o “swab” no diluente antes da sua utilização e 
remover o excesso; 
 
Exemplos: 
 
Tipos de superfícies Procedimento 
Meias carcaças de bovinos e suínos Selecionar 5 pontos, aplicar um “swab” em cada um dos 
pontos; colocá-los em um mesmo frasco com 25mL de 
diluente; agitar por 2 min. 
Cortes comerciais de carcaças Selecionar 5 pontos de 10cm2 na superfície dos cortes e 
proceder como descrito anteriormente. 
Carcaças de aves Selecionar 5 pontos de 10cm2 na superfície da carcaça 
(dorso, asas, ante-coxas e pescoço) e proceder como 
anteriormente. 
Peixes Selecionar 5 pontos de 10cm2 na superfície de peixes 
grandes ou amostrar a peça inteira, no caso de peixes 
pequenos. Proceder como descrito anteriormente. 
 
 
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Cálculo dos resultados 
 
 
• Os resultados podem ser expressos em UFC ou NMP por cm2 de amostra; 
• Primeiramente calcular em UFC ou NMP por mL de diluente onde 
foi suspendido o material coletado com os “swabs”. Considerar essa 
suspensão com concentração inicial de 100; 
• Em seguida, converter o UFC ou NMP obtido em UFC ou NMP por cm2 
de amostra, calculando quantos cm2 corresponde cada mL da suspensão. 
• No caso de meias carcaças de bovinos, por exemplo, cada mL de 
suspensão corresponde a 2 cm2 de amostra, porém, essa relação pode 
ser alterada a critério do analista, dependendo do tipo de amostra 
e objetivo da amostragem. É recomendável trabalhar sempre com 
volumes de diluente múltiplos das áreas amostradas, para facilitar os 
cálculos. No caso das meias carcaças de bovinos, o NMP ou UFC/ cm2 
será igual ao valor obtido por mL de suspensão, dividido por dois. Numa 
outra situação, em que um esfregaço de 100 cm2 de área fosse 
suspendido em 10,0 mL de diluente, por exemplo, cada mL de suspensão 
corresponderia a 10 cm2 de área e o NMP ou UFC/ cm2 seria igual ao 
valor obtido por mL de suspensão, dividido por dez. 
 
3. Material requerido para análise 
 
- 1 Frasco para 225mL; 
 
- 2 Tubos de cultura para 9mL; 
 
- Água destilada – 1000mL; Peptona – 1,0g; cloreto de sódio – 8,5g; 
 
- Béquer, proveta, balão volumétrico, bastão de vidro, pipeta, espátula e balança, 
Papel kraft e barbante. 
4. Procedimento 
 
 
- Dissolver os componentes em água destilada; 
- Distribuir em frascos e tubos em volumes apropriados; 
- Esterilizar em autoclave a 121°C/15min. 
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Aula Prática Nº03 
 
CONTROLE DA POPULAÇÃO MICROBIANA I1. Introdução 
A microbiota das mãos, das fossas nasais, da garganta dentre outros, 
apresentam uma população de microrganismos representada por diferentes 
gêneros, e por uma diversificação muito grande de indivíduo para indivíduo, e em 
um mesmo indivíduo, de um momento a outro. Os folículos pilosos da pele são 
colonizados por bactérias não virulentas, que impedem a implantação de 
microrganismos patogênicos, constituindo a “microbiota normal ou residente”. 
Na superfície da pele são encontrados microrganismos da mais variadas 
fontes, mas que não colonizam e são de fácil remoção. A chamada “microbiota 
transitória”. 
Segundo a atividade profissional do indivíduo (Microbiologista, Médico, 
Enfermeiro, Dentista, Manipulador de alimentos, etc.) os microrganismos 
presentes em sua microbiota da mão, das fossas nasais e da garganta podem 
representar elevado risco para outros indivíduos, porque agem como um veículo 
de transmissão de microrganismos patogênicos. 
Muitos surtos de intoxicação alimentar, de infecções intestinais, podem ser 
evitados com um simples atos como por exemplo: lavar as mãos, evitar 
conversas, usar mascaras antes de preparar e manipular os alimentos. 
A lavagem das mãos com água e sabão ou detergente remove a 
microbiota transitória, mas a microbiota resistente persiste, havendo a 
necessidade de emprego de anti-sépticos e uso de luvas estéreis, quando for 
manipular alimentos. 
Para a anti-sepsia das mãos existe uma série de produtos comerciais, 
cabendo ao usuário uma escolha de critérios fundamentais em trabalhos 
científicos, que apontam as vantagens e desvantagens de cada um dos 
produtos. 
 
2. Objetivo 
 
Controlar a população microbiana por métodos químicos (ação de anti-sépticos 
sobre a microbiota das mãos). 
 
3. Material 
 
1- Placas com ágar simples (01 /grupo); 
2- Soluções anti-sépticas – álcool iodado e anti-séptico comercial; 
3- Sabão ou detergente; 
4- Toalhas de papel 
 
4. Execução 
CONTROLE DA POPULAÇÃO MICROBIANA POR MÉTODOSQUÍMICOS 
 
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1. Tomar uma placa de ágar simples e com uma caneta de retro-projetor dividir o 
fundo em três setores: 1 2,3. 
2. Sem lavar as mãos, abrir a placa, próximo da chama e tocar diretamente o 
dedo indicador no setor 1. em seguida fechar aplaca. 
3. Lavar e esfregar as mãos com sabão. Enxugar as mãos em toalha estéril e 
repetir o item 2, colocando o dedo indicador no setor2. 
4. Passar nas mãos álcool iodado: enxugar em toalha estéril. Repetir o item 2, 
colocando o dedo indicador no setor3. 
5. Incubar a placa a 35°C. 
 
5. Leitura e interpretação 
 
1. Retirar as placas de ágar simples da estufa. 
2. Observar o crescimento bacteriano nos diferentes setores da placa, 
caracterizando os tipos morfológicos das colônias e seu número em cada um dos 
setores. 
 
Setor 1 = microbiota transitória 
Setor 2 = microbiota residente 
Setor 3 = microbiota resistente ao anti-séptico empregado. 
 
6. Resultados 
 
Procedimento Setor N° total de colônias 
 
Mãos antes da lavagem 1 
 
Mãos após a lavagem 2 
 
Mãos após a anti-sepsia 3 
 
 
 
 
Aspecto morfológico das colônias 
Setor1 
 
Setor2 
 
Setor3 
 
 
VII. COMENTÁRIOS 
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O controle artificial da população microbiana, por agentes físicos e 
químicos, propicia a obtenção de condições assépticas e de esterilidade em 
ambientes e de materiais. O controle de população microbiana na pele e mucosas 
é um problema constante. 
A pesquisa de microbiota das mãos, fossas nasais e garganta devem ser 
feitas periodicamente em todos que manipulam alimentos. Não raro estes 
profissionais têm sido colonizados por bactérias patogênicas como Pseudomonas, 
E. coli e Staphylococcus aureus, Streptococcus sp. o que representa um grande 
risco de contaminação para os alimentos. 
Outro cuidado que deve ser tomado é em relação aos anti-sépticos 
indicados para a assepsia das mãos, verificando, antes de seu uso rotineiro, se os 
componentes de sua fórmula são germicidas nas concentrações indicadas; se no 
preparo das soluções são seguidas as especificações do fabricante, não deixando 
de se observar o tempo de validade das soluções em uso. Muitos produtos já 
lançados no mercado mostraram-se menos eficientes que o sabão neutro. Com 
relação ao álcool iodado, deve se salientar que, embora seja um anti-séptico de 
grande poder germicida. Seu uso constante provoca o ressecamento da pele e 
que pessoas alérgicas não devem usá-lo havendo, então, necessidade de 
substituí-lo por outro produto de eficiência comprovada e equivalente. 
 
MÉTODO DE GRAM (modificado por Kopelov e Beerman) 
 
Colocar a lâmina com esfregaço seco e fixado, voltado para cima, sobre suporte: 
1. Cobrir o esfregaço com solução de cristal violeta, acrescido de três gotas de 
solução de bicarbonato de sódio e deixar atuar por 1 minuto; 
2. Lavar o esfregaço com água cobri-lo com lugol e deixar atuar por 1 minuto; 
3. Lavar o esfregaço com água descorá-lo rapidamente com solução de éter-acetona 
(5 a 10 segundos); 
4. Lavar o esfregaço com água cobri-lo com solução de safranina e deixar atuar por 10 
segundos; 
5. Lavar o esfregaço com água e secá-lo próximo à chama do bico de Bunsen; 
6. Pingar uma gota de óleo de imersão na região do esfregaço e observar ao 
microscópio usando a objetiva de imersão (100x). 
 
LEITURA E INTERPRETAÇÃO DA COLORAÇÃO DE GRAM 
1. Observar cada esfregaço isoladamente; 
2. Diferenciar: 
 Células Gram positivas – coradas em roxo ou violáceo; 
 Células Gram negativas – coradas em róseo ou vermelho; 
3. Caracterizar os tipos e agrupamentos de bactérias Gram - positivas (cocos, 
diplococos, sarcinas, estafilococos, estreptococos e bacilos) e Gram - negativas 
(cocos, diplococos, bacilos, espirilos e vibriões). 
 
16 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
Aula Prática Nº 04 
 
CONTROLE DA POPULAÇÃO MICROBIANA II 
 
I. OBJETIVOS: 
 
1. Realizar a coleta e a semeadura do espécime das fossas nasais de um estudante a 
fim de obter colônias isoladas; 
2. Estabelecer portadores nasais de microrganismos; 
 
II. MATERIAL 
1- Bateria de Gram; 
2- Placas de ágar hipertônico manita; 
3- Tubos contendo caldo tioglicolato; 
4- ”Swabs” ou cotonetes estéreis 1 / grupo; 
 
III. EXECUÇÃO 
Coletar secreção da mucosa nasal de ambas as narinas com o “swab” ou 
cotonete e semeá-la no tubo com caldo tioglicolato e no meio hipertônico manita. 
Identificar os meios e incubá-los a 35 ºC por 24 horas. 
 
Meio Hipertônico Manita: meio seletivo que permite o crescimento de 
microrganismos do gênero Staphylococcus uma vez que a alta concentração de sal 
(7,5 %) presente neste meio é capaz de selecioná-los. A presença de manitol, como 
fonte de carbono, possibilita sua utilização por via fermentativa pelas espécies de S. 
aureus, que poderá ser evidenciada pela viragem do pH do meio de cultura. Outro 
fator importante na sua identificação encontra-se no fato de que tais bactérias crescem 
neste meio apresentando cor amarela. As colônias suspeitas de S. aureus, são 
aquelas que crescem no meio hipertônico (sal), viram o pH (fermentação do manitol) e 
apresentam cor amarela. 
 
Caldo Tioglicolato: meio rico, não seletivo que proporciona rapidez de crescimento 
de grande número de microrganismos, assim como admite o crescimento de 
microrganismos aeróbios, anaeróbios e microaerófilos. 
 
IV. LEITURA E RESULTADOS 
 
1. Observar a placa e o tubo 
Descrever o crescimento bacteriano observado no meio de tiogliclolato 
a) terço superiorb) terço médio 
c) terço inferior 
d) em todo o tubo 
e) ausência de crescimento 
 
Descrever o crescimento bacteriano observado na placa de Petri 
17 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
Observar e anotar os diferentes tipos de colônias desenvolvidas no meio de cultura e 
suas características; 
a) tamanho relativo das colônias; 
b) cor das colônias; 
c) forma das colônias; 
d) brilho das colônias; 
e) cor do meio de cultura (verificação se houve “viragem” do meio de cultura) 
modificação da cor, de vermelho para amarelo. A modificação na cor do meio se deve 
a alteração no pH do meio pela fermentação do manitol 
• fermentação positiva = pH ácido = amarelo 
• fermentação negativa = pH neutro ou básico = vermelho 
 
2. Coloração de Gram 
Caracterização morfológica: o simples crescimento em meio seletivo indicador não 
permite tirar qualquer conclusão quanto à morfologia bacteriana, havendo a 
necessidade imediata de se comprovar a forma bacteriana do microrganismo bem 
como o tipo de agrupamento da células (cocos dispostos em cachos). Isto é feito 
através da coloração de Gram. 
 
18 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
Aula Prática Nº 05 
 
CONTROLE DA POPULAÇÃO MICROBIANA III 
I. OBJETIVOS: 
 
1. Realizar a coleta e a semeadura do espécime da garganta de um estudante a fim de 
obter colônias isoladas; 
2. Estabelecer portadores de microrganismos na garganta; 
 
II. MATERIAL 
1. Bateria de Gram; 
2. Lâminas de microscopia; 
3. Alça de platina; 
4. Tubo com soro fisiológico estéril (cloreto de sódio a 0,85%); 
5. Placa de Petri estéril; 
6. Cultura bacteriana a ser analisada; 
 
III. EXECUÇÃO 
 
A PARTIR DE SALIVA 
1. Preparo do esfregaço 
1.1. Colher saliva em placa de Petri estéril; 
1.2. Marcar a lâmina, delimitando a área do esfregaço; 
1.3. Fazer o esfregaço: com a alça de platina flambada e resfriada, retirar pequena 
porção de saliva, colocá-la sobre a lâmina, distribuí-la em movimentos circulares, a fim 
de se obter uma camada delgada bem dispersa na área delimitada; 
1.4. Secá-lo próximo à chama do bico de Bunsen; 
1.5. Fixá-lo passando a lâmina na chama (3 vezes); 
1.6. Corar pelo método de Gram 
 
A PARTIR DE CULTURAS PURAS 
 
2. Exame das culturas presentes nas placas sobre a bancada; 
2.1. Observar e anotar os diferentes tipos de colônias (caso obtivermos) desenvolvidas 
no meio de cultura e suas características; 
2.2. Marcar uma lâmina; 
2.3. Fazer o esfregaço: com a alça de platina flambada e resfriada, colocando uma 
pequena porção (uma gota) de soro fisiológico no setor delimitado. Escolher uma 
colônia e tocá-la com a alça. O material removido será distribuído e misturado ao soro 
fisiológico em movimentos circulares, a fim de se obter uma camada bem dispersa na 
área delimitada; 
2.4. Secá-lo próximo à chama do bico de Bunsen; 
2.5. Fixá-lo passando a lâmina na chama (3 vezes); 
2.6 Realizar a coloração pelo método de Gram. 
 
19 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
V. RESULTADOS 
 Verificar os tipos de células e agrupamentos presentes na saliva e nas colônias 
das placas de Petri. Comparar a diferença dos tipos de microrganismos presentes nas 
placas e na saliva do estudante. 
 
PLACAS DE PETRI SALIVA 
 
 
 
 
VI. COMENTÁRIOS 
 
 A primeira caracterização que se deve fazer de uma célula bacteriana é quanto 
à sua forma e ou seu comportamento frente ao Gram. Sendo uma informação 
primordial, é necessário que o método de coloração seja bem executado, com agentes 
testados e de boa qualidade e a metodologia empregada de forma rigorosa, afim de 
que os resultados encontrados sejam fidedignos. 
 A coloração deve ser feita com células jovens obtidas no “habitat natural” ou 
cultivadas em meios de cultura, observando-se sistematicamente, o tempo de atuação 
de cada reagente, como condição essencial ao mérito e finalidade da técnica. Células 
Gram-positivas (+), em cultura velha, podem apresentar-se como Gram–negativas (-), 
devido à perda de certas particularidades físico-químicas, que determinam seu 
comportamento anormal, sendo, por isso, seu uso desaconselhado. Uma 
descoloração muito rápida ou intensa pode alterar também a informação. A adição do 
bicarbonato de sódio ou oxalato de amônio e descoloração pela mistura éter-acetona 
são modificações do método original que visam corrigir o fenômeno da Gram-
labilidade, ou seja, uma célula normalmente Gram-positiva (+) se comportar como 
Gram-negativa (-). 
As bactérias Gram-positivas (+), devido à sua constituição química estrutural, 
principalmente da parede, retêm o complexo iodo-pararosalina, não se descorando 
pela ação solvente (éter-acetona), permanecendo roxas. As bactérias Gram-negativas 
não retêm o complexo quando submetidas à ação do solvente orgânico, sendo 
descoradas e novamente corados pelo corante de fundo (safranina ou fucsina). 
 Entre os métodos de coloração, o de Hans Christiam Gram (1884) é o mais 
usado pelos bacteriologistas porque cora a maioria das células bacterianas, dando 
informações diretas e conclusivas. Além disto, podemos enumerar como exemplos, as 
seguintes aplicações para a coloração de Gram: 
1. Na morfologia bacteriana, estabelecendo os grupos e tipos morfológicos 
fundamentais; 
2. Na taxonomia, dividindo as bactérias em dois grandes grupos: Gram-positivas (+)e 
Gram-negativas (-); 
3. No diagnóstico bacteriológico, qualificando os tipos de microbiota normal ou 
patogênica de diferentes áreas ou espécimes biológicos. Na elucidação de 
determinados quadros clínicos, é indispensável para uma primeira indicação de um 
surto de toxinfecções alimentares ou de alguma de alguma doença clínica 
20 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
Aula Prática nº 06 
 
 
CONTAGEM TOTAL DE MICRORGANISMOS AERÓBIOS MESÓFILOS E 
PSICROTRÓFILOS EM PLACAS 
 
 
1. Material requerido para a análise 
 
1.1 Preparação da amostra e diluições seriadas 
- Diluente: 225mL de solução salina peptonada; 
- Tubos de diluição: 2 tubos com 9,0mL de solução salina peptonada/tubo; 
- Pipetas: 3 pipetas com capacidade de 1,0mL. 
 
1.2 Contagem total de microrganismos aeróbios mesófilos em profundidade 
- Meio de cultura: 3 Placas de Petri esterilizadas; 
- Ágar Padrão para Contagem (PCA); 
- Estufa incubadora: 1 estufa regulada à 35ºC. 
 
1.3 Contagem total de microrganismos aeróbios psicrotrófilos em superfície 
- Meio de cultura: 3 Placas de Petri com Ágar Padrão para Contagem (PCA); 
- Alça de espalhamento: 1 alça de Drigalsky mergulhada em álcool; 
- Estufa incubadora: 1 estufa regulada à 7ºC. 
 
2. Procedimento (Figura 2): 
 
2.1 Preparação das amostras e diluições seriadas 
 
2.2 Contagem pelo método de plaqueamento em profundidade 
 
• Selecionar três diluições adequadas da amostra e inocular 1,0mL de 
cada diluição em Placas de Petri separadas, estéreis e vazias, abrindo as 
placas apenas o suficiente para inserir a pipeta, próximo ao Bico de 
Bunsen; 
• Adicionar o meio de cultura: verter nas placas inoculadas, 15 a 20mL de 
Ágar Padrão para Contagem (PCA), previamente fundido e resfriado a 
45ºC. Misturar o inóculo com o meio de cultura movimentando suavemente 
as placas, numa superfície plana. Os movimentos podem ser na forma de 
oito ou movimentos circulares, 8 a 10 vezes no sentido horário e 8 a 10 
vezes no sentido anti-horário; 
• Incubação: aguardar a completa solidificação do meio de cultura, inverter 
as placas e incubar a 35º por 48 horas; 
• Contagem das colônias e cálculo dos resultados: selecionar as placas com 
25 a 250 colônias e contá-las com auxílio de uma lupa ou contador de 
colônias. Calcular onúmero de unidades formadoras de colônia (UFC) 
por grama ou mL da amostra multiplicando o número de colônias pelo 
inverso da diluição inoculada. Expressar o resultado em UFC/mL ou 
UFC/g. 
 
2.3 Contagem pelo método de plaqueamento em superfície 
 
21 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
• Preparação das placas: para o plaqueamento em superfície, as placas devem 
ser previamente preparadas, com 15 a 20mL do meio adequado ao grupo de 
microrganismos que se objetiva determinar; 
• Inoculação: selecionar três diluições adequadas da amostra e inocular 0,1mL 
de cada diluição na superfície das placas previamente preparadas e, usando 
uma alça de Drigalsky, espalhar o inóculo por toda a superfície do meio, até 
que todo o excesso de líquido seja absorvido; 
• Incubação: aguardar que as placas sequem (15 minutos), inverter e incubar 
o 7ºC/10 dias, 17ºC/16 horas seguidas de 7ºC/3 
dias; 
• Contagem das colônias e cálculo dos resultados: seguir as recomendações 
anteriores, porém, multiplicar o resultado por 10, para levar em conta o 
volume dez vezes menor inoculado. Expressar o resultado em UFC/mL ou 
UFC/g. 
 
 
 
 
 
Obs.: Caso tenha sido utilizada mais de uma placa diluição, considerar como 
número de colônias a média aritmética da contagem obtida em cada uma da placas. 
 
 
 
Figura 2. Esquema geral da análise para contagem total de microrganismos 
aeróbios mesófilos em placas. 
 
22 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
3. Informações relativas à amostra 
 
- Tipo de amostra e processo utilizado na fabricação: 
 
- Fabricante, data de fabricação, código do lote: 
 
- Solicitante da análise: 
 
- Data e local de coleta da amostra: 
 
- Razão da análise: 
 
 
4. Resultados 
 
4.1 Contagem pelo método de plaqueamento em profundidade: 
 
4.2 Contagem pelo método de plaqueamento em superfície: 
 
 
5. Conclusão 
Obs: Utilizar as regras para cálculo dos resultados na contagem de microrganismo 
por plaqueamento – Anexo 4). 
23 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
Aula Prática nº 07 
 
 
CONTAGEM TOTAL DE BOLORES E LEVEDURAS EM PLACAS 
 
 
1. Material requerido para análise 
 
1.1 Preparação da amostra e diluições seriadas 
- Diluente: 225mL de solução salina peptonada; 
- Tubos de diluição: 2 tubos com 9,0mL de solução salina peptonada/tubo; 
- Pipetas: 3 pipetas com capacidade de 1,0mL. 
 
1.2 Contagem de bolores e leveduras em superfície 
- Meio de cultura: 3 Placas de Petri com Ágar Padrão para Contagem suplementado 
com 100mg de cloranfenicol para 1000mL de meio de cultura (PCA-cloranfenicol). 
- Alça de espalhamento: 1 alça de Drigalsky mergulhada em álcool; 
- Estufa incubadora: 1 estufa regulada a 25ºC. 
 
 Obs: Outros meios que podem ser usados: 
Ágar Dicloran Glicerol 18 (DG18) – alimentos com atividade de água baixa; 
Ágar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC) – demais alimentos; 
Ágar Batata Dextrose Acidificado (PDA – acidificado) 
Ágar Batata Dextrose com antibióticos (PDA – antibióticos); 
 
2. Procedimento (Figura 3): 
 
2.1 Preparação da amostra e diluições seriadas 
 
2.2 Contagem pelo método de plaqueamento em superfície 
 
• Preparação das placas: para o plaqueamento em superfície, as placas devem 
ser previamente preparadas, com 15 a 20mL do meio adequado ao grupo de 
microrganismos que se objetiva contar; 
• Inoculação: selecionar três diluições adequadas da amostra e inocular 0,1mL 
de cada diluição na superfície das placas previamente preparadas e, usando 
uma alça de Drigalsky, espalhar o inóculo por toda a superfície do meio, até 
que todo o excesso de líquido seja absorvido; 
• Incubação: aguardar que as placas sequem (15 minutos), inverter e incubar a 
25ºC/5 dias, placas não invertidas (observar as placas aos 3 dias de 
incubação e, caso haja crescimento de bolores com colônias espalhadas, 
efetuar a contagem, para prevenir a perda das placas por espalhamento total 
dessas colônias. Caso não seja observado risco de espalhamento, reincubar as 
placas e contar com 5 dias de incubação). 
• Contagem das colônias e cálculo dos resultados: contar placas com 10 a 150 
colônias. Multiplicar o resultado por 10, para levar em conta o volume dez 
vezes menor inoculado. UFC/g ou mL = nº colônias X 10/diluição. 
 
Obs.: Caso tenha sido utilizada mais de uma placa diluição, considerar como 
número de colônias a média aritmética da contagem obtida em cada uma das 
placas. 
24 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
 
 
 
Figura 3. Esquema geral da análise para contagem de bolores e leveduras em placas. 
DRBC (Agar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol), DG18 (Agar Dicloran Glicerol 
18). 
3. Informações relativas à amostra 
 
- Tipo de amostra e processo utilizado na fabricação: 
- Fabricante, data de fabricação, código do lote: 
- Solicitante da análise 
 Data e local de coleta da amostra: 
- Razão da análise: 
 
4. Resultados 
Obs: Utilizar as regras para cálculo dos resultados na contagem de microrganismo 
por plaqueamento – Anexo 4). 
 
5. Conclusão 
25 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
 
26 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
Aula Prática nº 08 
 
 
ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA POTÁVEL 
 
1. Definições 
 
Água potável é a água para consumo humano cujos parâmetros 
microbiológicos (Tabela 1 – Anexo 5), físicos, químicos e radioativos atendam ao 
padrão de potabilidade e que não ofereça riscos à saúde. 
 
 
- Coliformes totais (bactérias do grupo coliforme): bacilos gram-negativos, 
aeróbios ou anaeróbios facultativos, não formadores de esporos, capazes de 
desenvolver na presença de sais biliares ou agentes tensoativos, fermentam a 
lactose com produção de ácido e gás a 35,0 ± 0,5ºC em 24-48 horas, e que 
podem apresentar atividade da enzima ß-galactosidase. A maioria das bactérias 
do grupo coliforme pertence aos gêneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella e 
Enterobacter, embora vários outros gêneros e espécies pertençam ao grupo; 
 
- Coliformes termotolerantes: subgrupo das bactérias do grupo coliforme que 
fermentam a lactose a 44,5 ± 0,2ºC em 24 horas, tendo como principal 
representante a Escherichia coli, de origem exclusivamente fecal; 
 
- Escherichia coli: bactéria do grupo coliforme que fermenta a lactose e manitol, 
com produção de ácido e gás a 44,5 ± 0,2ºC em 24 horas, produz indol a partir do 
triptofano, apresenta atividade das enzimas ß-galactosidase e ß-glucoronidase, 
sendo considerada o mais específico indicador de contaminação fecal recente e de 
eventual presença de organismos patogênicos. 
 
 
2. Amostragem 
 
Para a análise microbiológica, as amostras devem ser tomadas do ponto 
representativo do sistema de distribuição ou do reservatório a ser examinado. 
Quantidade > 100mL. 
 
 
3. Determinação 
 
 
 
2.1 Teste de presença e ausência 
 
2.2 Técnica da membrana filtrante 
 
2.3 Técnica dos tubos múltiplos 
 
A. Material requerido para análise 
 
- 1 Frasco esterilizado para coleta de água; 
 
- 1 Pipeta com capacidade de no máximo 10 mL; 
 
- 10 tubos com 10 mL de Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST); 
 
- 1 Alça de níquel-cromo; 
 
- 10 Tubos com 10 mL de Caldo E coli (EC); 
- 10 Tubos com 10 mL de Caldo Verde Brilhante Bile (VB); 
 
- 1 Alçade Drigalsky; 
 
27 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
- Placas com Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB). 
 
B. Procedimento (Figura 4): 
 
b.1 Preparação da amostra: Homogeneizar a amostra por agitação. 
 
 
b.2 Teste presuntivo: Com uma pipeta de 10mL ou 25mL, adicionar 10 porções de 
10mL em tubos contendo 10mL do meio Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) com 
tubos de Durhan. Incubar os tubos a 35ºC/24 horas e observar se há crescimento 
com produção de gás. Em caso positivo passar aos ítens subseqüentes. Em caso 
negativo, reincubar até completar 48 horas e repetir a leitura. Se continuar negativo 
indica ausência de coliformes (totais, termotolerantes e E. coli) nos 100mL da 
amostra. 
 
b.3 Teste confirmativo - Coliformes totais: A partir de cada tubo positivo da etapa 
anterior, transferir uma alçada bem carregada da cultura para tubos com Caldo 
Verde Brilhante Bile (VB). Incubar os tubos a 35ºC por 24-48 horas e observar se há 
crescimento com produção de gás, confirmativo para coliformes totais. Anotar o 
número de tubos VB com gás e determinar o Número Mais Provável de coliformes 
totais/100mL (Tabela 2 – Anexo 5). A não ocorrência de gás após 48 horas de 
incubação indica ausência de coliformes totais na amostra. 
 
b.4 Teste confirmativo - Coliformes termotolerantes: A partir de cada tubo 
positivo da letra b.2, transferir uma alçada carregada da cultura para tubos de Caldo 
E. coli (EC). Incubar os tubos a 44,5ºC por 24 horas e observar se há crescimento 
com produção de gás, confirmativo de coliformes termotolerantes. Anotar o número 
de tubos de EC com gás e determinar o Número Mais Provável (NMP) de coliformes 
termotolerantes/100mL (Tabela 2– Anexo 3). A não ocorrência de gás após 24 horas 
de incubação indica ausência de coliformes termotolerantes na amostra. 
 
b.5 Confirmação de E. coli: Tomar uma alçada de cada cultura obtida em cada 
tubo de EC com produção de gás e estriar em placas de Ágar Eosina Azul de 
Metileno (EMB). Incubar as placas a 35ºC/24 horas e observar se há 
desenvolvimento de colônias típicas de E. coli (nucledas com centro preto, com ou 
sem brilho metálico). Havendo colônias típicas, transferir duas delas bem isoladas 
para tubos com Ágar Nutriente (NA) inclinado e incubar os tubos a 35ºC/24 horas. A 
partir das culturas puras em NA, fazer coloração Gram e inocular os meios testes 
para realização das provas bioquímicas. 
 
b.6 Provas bioquímicas 
 
- Produção de Indol (+ ou -) 
 
- Prova vermelho de Metila (VM) (+) 
 
- Prova de Voges-Proskauer (VP) (-) 
 
- Utilização de citrato (-) 
 
C. Informações relativas à amostra 
 
 
- Tipo de amostra e processo utilizado na fabricação: 
 
- Fabricante, data de fabricação, código do lote: 
 
- Solicitante da análise: 
 
- Data e local de coleta da amostra 
28 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
 
- Razão da análise: 
 
 
D. Resultados 
 
 
d.1 Coliformes totais: 
 
d.2 Coliformes termotolerantes: 
 
d.3 Confirmação de E. coli: 
 
 
D. Conclusão 
 
 
 
Figura 4. Esquema de análise de coliformes totais, termotolerantes e E. 
coli em água pelo método do NMP (Hunt e Rice, 2005 apud Silva et al., 2007). 
29 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
 
Aula Prática nº 09 
 
ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE FRUTAS E HORTALIÇAS 
 
 
1. Padrão microbiológico para frutas, produtos de frutas e similares 
 
Obs: Consultar o regulamento técnico sobre padrões microbiológicos para alimentos 
(Anexo 6). 
 
 
2. Material requerido para análise 
 
� 1 Frasco/recipiente estéril; 
� Diluente: 225 mL de solução salina peptonada; 
� 3 Pipetas com capacidade de 1 mL; 
� Tubos de diluição: 2 tubos com 9,0 mL de solução salina peptonada/tubo; 
 
� 9 Tubos com 10 mL de caldo Lauril Sulfato Triptose (LST); 
� 1 Alça de níquel-cromo; 
� 9 Tubos com 10 mL de caldo Verde Brilhante Bile (VB); 
 
� 9 Tubos com 10 mL de caldo E. coli (EC); 
� 1 Alça de Drigalsky; 
� Placas com Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB); 
 
� 1 Tubo com 10 mL de caldo Rappaport Vassilidis (RV); 
 
� 1 Pipeta com capacidade de 2 mL; 
 
� 1 Tubo com 10 mL de caldo Tetrationato (TT); 
� 2 Placas com Entérico de Hectoen (HE); 
� 2 Placas com Ágar Bismuto Sulfito (BS); 
 
� 2 Placas com Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD). 
 
 
3. Procedimento 
 
3.1 Determinação de Coliformes totais, Coliformes termotolerantes e E. coli 
 
- Técnica dos tubos múltiplos (Figura 5): 
 
a. Preparação da amostra: Observar os cuidados na abertura de embalagens 
se houver, e na retirada da unidade analítica (quantidade e cuidados 
assépticos). 
 
b. Homogeneização e preparo da diluição seriada: a homogeneização é 
precedida de uma diluição inicial de 1:10 (10-1), adicionando-se às 25g da 
amostra, 225mL de um diluente adequado (água peptonada 0,1% ou solução 
salina peptonada, são os mais comuns). Para a preparação da segunda diluição 
(10-2), transferir assepticamente 1,0 mL da diluição 10-1 para 9,0 mL de diluente, 
sendo as diluições subseqüentes obtidas da mesma maneira. 
30 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
 
c. Teste presuntivo: Selecionar três diluições adequadas da amostra e, com 
uma pipeta de, no máximo 10 mL, inocular uma série de três tubos de Caldo 
Lauril Sulfato Triptose (LST) por diluição, adicionando-se 1,0 mL da diluição por 
tubo com 10 mL de Caldo. 
 
d. Incubação: Incubar os tubos de LST a 35ºC por 24 horas e observar se há 
crescimento com produção de gás. Em caso positivo, passar para os itens 
subsequentes. Em caso negativo, reincubar até completar 48 horas e repetir a 
leitura. 
 
 
4. Teste confirmativo 
 
4.1 Coliformes totais: A partir de cada tubo positivo da letra d) transferir uma 
alçada bem carregada da cultura para tubos com Caldo Verde Brilhante Bile (VB). 
Incubar os tubos a 35ºC por 24-48 horas e observar se há crescimento com 
produção de gás. Anotar o número de tubos VB com gás e determinar o Número 
Mais Provável de coliformes totais NMP/g ou mL na em tabela apropriada às 
diluições inoculadas (Tabela 1 – Anexo 7). 
 
4.2 Coliformes termotolerantes: A partir de cada tubo positivo da letra d) 
transferir uma alçada carregada da cultura para tubos de Caldo E. coli (EC). 
Incubar os tubos a 44,5ºC (maioria dos alimentos) por 24 horas e observar se há 
crescimento com produção de gás, confirmativo de coliformes termotolerantes. 
Anotar o número de tubos de EC com gás e determinar o Número Mais Provável 
NMP/g ou mL na em tabela apropriada às diluições inoculadas (Tabela 1 – 
Anexo7). 
 
5. Contagem de E. coli: Tomar uma alçada de cada cultura obtida em cada tubo 
de EC com produção de gás e estriar em placas de Ágar Eosina Azul de Metileno 
(EMB). Incubar as placas a 35ºC/24 horas e observar se há desenvolvimento de 
colônias típicas de E. coli (nucledas com centro preto, com ou sem brilho 
metálico). Havendo colônias típicas, transferir duas delas bem isoladas para 
tubos com Ágar Nutriente (NA), inclinados e incubar os tubos a 35ºC/24 horas. A 
partir das culturas puras em NA, fazer coloração Gram e inocular os meios para 
realização de provas bioquímicas de indol (+ ou -), VM (+), VP (-) e citrato (-) 
(IMVC). 
 
 
6. Pesquisa de Salmonela (Figura 6): 
 
a. Pré-enriquecimento: Objetiva a recuperação de células injuriadas, conseguida 
incubando-se a amostra em condições não seletivas, por pelo menos 18 horas. 
Os meios disponíveissão variados, porém existe o mais utilizado é a água 
peptonada tamponada, recomendado pela International Commission on 
Microbiological Specifications for Food (ICMSF), International Organization for 
Standardization (ISO) e Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT). Esta 
etapa consiste em retirar 25g ou 25mL de unidade analítica e transferir para um 
frasco de homogeneização, previamente esterilizado e tarado. Adicionar 225mL 
de caldo de pré-enriquecimento e homogeneizar a amostra. Incubar os frascos a 
35º/18-24 horas, com as tampas ligeiramente afrouxadas. 
 
31 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
b. Enriquecimento seletivo: Objetiva inibir a multiplicação da microbiota 
acompanhante e promover a elevação preferencial do número de células de 
Salmonella sp., incubando a amostra pré-enriquecida em caldo seletivo, por 18 a 
24 horas. É recomendado o uso de dois diferentes meios de enriquecimento, 
porque a resistência de Salmonela aos agentes seletivos varia de cepa para 
cepa. Nesta etapa agitar delicadamente o frasco com caldo de pré- 
enriquecimento e transferir 1,0 mL para 10 mL de Caldo Tetrationato (TT) e 1,0 
mL para 10 mL de Caldo Selenito Cistina (SC) ou Caldo Rappaport Vassilidis 
(RV). Incubar ambos os caldos a 35ºC por 24 horas. 
 
c. Plaqueamento diferencial: Objetiva promover o desenvolvimento preferencial 
de colônias de Salmonela, com características típicas que as diferencie dos 
competidores, para posterior confirmação sorológica e bioquímica. Nesta etapa, 
agitar os tubos de enriquecimento seletivo em agitador tipo “vortex” e estriar uma 
alçada do caldo TT em placa de Ágar Entérico de Hectoen (HE), Ágar Bismuto 
Sulfito (BS) e Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD). Repetir este procedimento 
com caldo SC ou RV. Incubar as placas invertidas a 35ºC por 24 horas e verificar 
se há desenvolvimento de colônias típicas de Salmonela. 
 
d. Confirmação: Objetiva verificar se as colônias típicas obtidas nas placas são 
realmente colônias de Salmonela através de provas bioquímicas. As colônias 
podem ser submetidas a seguinte seqüência de testes: crescimento em Ágar 
Tríplice Açúcar Ferro (TSI), crescimento em Ágar Lisina Ferro (LIA), teste da 
urease (-), teste de lisina descarboxilase (+), teste de Voges-Proskauer (-), teste 
de indol (-) e teste de �-galactosidase (-). É importante ressaltar que existem 
outras seqüências de provas bioquímicas além da citada. Além das provas 
bioquímicas, também é utilizado o teste sorológico. 
 
 
7. Informações relativas à amostra 
 
- Tipo de amostra e processo utilizado na fabricação: 
- Fabricante, data de fabricação, código do lote: 
- Solicitante da análise: 
- Data e local de coleta da amostra: 
- Razão da análise: 
 
8. Resultados 
 
8.1 Determinação de Coliformes totais, Coliformes termotolerantes, E. coli: 
 
a. Coliformes totais: 
b. Coliformes termotolerantes: 
c. Confirmação de E. coli: 
 
 
8.2 Detecção de Salmonela: 
 
 
 
 
9. Conclusão 
 
 
 
 
32 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
 
 
 
 
Figura 5. Esquema de análise para determinação de coliformes 
totais/termotolerantes e E.coli pelo método do número mais provável (NMP). 
33 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Esquema geral de análise para pesquisa de Salmonela em alimentos.
 
34 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
 
Aula Prática nº 10 
 
 
 
ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE PRODUTOS CÁRNEOS 
 
 
 
 
1. Padrão microbiológico para carnes e produtos cárneos. 
 
Obs: Consultar o regulamento técnico sobre padrões microbiológicos para alimentos 
(Anexo 6). 
 
1. Material requerido para análise 
 
 
� 1 Frasco/recipiente estéril; 
� Diluente: 225 mL de solução salina peptonada; 
 
� 3 Pipetas com capacidade de 1 mL; 
� Tubos de diluição: 2 tubos com 9,0 mL de solução salina peptonada/tubo; 
� 9 Tubos com 10 mL de caldo Lauril Sulfato Triptose (LST); 
� 1 Alça de níquel-cromo; 
 
� 9 Tubos com 10 mL de caldo Verde Brilhante Bile (VB); 
� 9 Tubos com 10 mL de caldo E. coli (EC); 
� 1 Alça de Drigalsky; 
 
� Placas com Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB); 
 
� 1 Tubo com 10 mL de caldo Rappaport Vassilidis (RV); 
 
� 1 Pipeta com capacidade de 2 mL; 
� 1 Tubo com 10 mL de caldo Tetrationato (TT); 
� 2 Placas com Entérico de Hectoen (HE); 
 
� 2 Placas com Ágar Bismuto Sulfito (BS); 
� 2 Placas com Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD); 
� 3 Placas com Àgar Sal Manitol ou Ágar Baird Parker (BP); 
 
� 3 Placas de Petri esterilizadas; 
� 1 Erlenmeyer com 60mL de Ágar Triptose Sulfito Cicloserina (TSC) fundido; 
� 1 Jarra de anaerobiose; 
 
� 1 Gerador/indicador de anaerobiose. 
 
 
2. Procedimento 
 
3.1 Determinação de Coliformes totais, Coliformes termotolerantes e E. coli 
- Técnica dos tubos múltiplos. 
 
3.2 Detecção de Salmonela 
3.3 
35 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
 
3.3 Contagem de Estafilococos coagulase positivo (Figura 7) 
 
a. Preparação da amostra 
 
b. Homogeneização e preparo das diluições seriadas 
 
c. Inoculação: selecionar três diluições adequadas da amostra. Inocular 0,1mL 
de cada diluição na superfície de placas de Ágar Baird-Parker (BP) ou Ágar Sal 
Manitol, previamente preparadas e secadas. Espalhar o inóculo com uma alça de 
Drigalsky, até que todo excesso de líquido seja absorvido; 
 
d. Incubação: Aguardar que as placas sequem completamente e incubar 
invertidas, a 35ºC por 48 horas; 
 
e. Contagem de colônias presuntivas: selecionar placas com 20 a 200 colônias 
e contar as colônias típicas de S. aureus. No meio de cultura Ágar Baird-Parker 
(BP): colônias circulares, pretas, pequenas (máximo 1,5mm em diâmetro), lisas, 
convexas, com bordas perfeitas, massa de células esbranquiçada nas bordas, 
rodeadas por uma zona opaca e/ou um halo transparente se estendendo para 
além da zona opaca. No meio de cultura Sal Manitol: amarela, com o halo 
amarelo, lisas e pequenas. 
 
f. Confirmação das colônias típicas: Teste de coagulase (+), teste de 
termonuclease (+) e teste de catalase (+). 
 
g. Cálculo dos resultados: UFC/g ou mL em função do número de colônias 
típicas, diluição inoculada e percentagem de colônias confirmadas. Exemplo: 
diluição 10-1, com 30 colônias típicas, 10 submetidas à confirmação, 2 
confirmadas (20%). UFC/g ou mL = 30x101x0,2x10 = 6,0 x 102 UFC/g ou mL. 
 
 
 
3.4 Contagem de Clostrídios Sulfito Redutores 
a. Preparação da amostra. 
b. Homogeneização e preparo das diluições seriadas. 
 
c. Inoculação: selecionar três diluições adequadas da amostra e inocular em 
placas de Ágar Triptose Sulfito Cicloserina (TSC), plaqueamento em superfície ou 
em profundidade. Quando em superfície fazer uma sobrecamada após o 
espalhamento do inoculo. 
 
d. Incubação: Aguardar completa solidificação da sobrecamada e incubar as 
placas sem inverter, a 46ºC por 18 a 24 horas, em atmosfera anaeróbia (sistema 
gerador e indicador de anaerobiose); 
 
e. Contagem de colônias presuntivas de clostrídios sulfito-redutores: 
selecionar placas com 20 a 200 colônias e contar apenas as colôniaspretas, 
típicas de clostrídios sulfito-redutores em Ágar TSC. 
 
 
36 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
 
f. Confirmação de colônias típicas de clostrídios sulfito-redutores: Selecionar 
várias colônias típicas e transferir para tubos de Caldo Infusão Cérebro Coração 
(BHI), previamente desaerado. Incubar os tubos inoculados a 35ºC/24 horas, 
preparar um esfregaço da cultura para coloração de Gram e utilizar o caldo 
remanescente para teste de catalase (adição de peróxido de hidrogênio 3% 
observando a formação de bolhas). Os clostrídios sulfito-redutores são bastonetes 
Gram positivos catalase negativos. 
 
g. Cálculo dos resultados: UFC/g ou mL em função do número de colônias 
típicas, diluição inoculada e percentagem de colônias confirmadas. Exemplo: 
diluição 10-2, com 25 colônias típicas, 10 submetidas à confirmação, 8 
confirmadas (80%). UFC/g ou mL = 25x102x0,8 = 2 x 103 UFC/g ou mL. Obs: 
Multiplicar o resultado por 10 caso seja realizado plaqueamento em superfície. 
 
3. Informações relativas a amostra 
 
- Tipo de amostra e processo utilizado na fabricação: 
 
- Fabricante, data de fabricação, código do lote: 
 
- Solicitante da análise: 
 
- Data e local de coleta da amostra: 
 
- Razão da análise: 
 
 
5. Resultados 
 
5.1 Determinação de Coliformes totais, Coliformes termotolerantes, E. coli: 
 
a. Coliformes totais: 
b. Coliformes termotolerantes: 
c. Confirmação de E. coli: 
 
5.2 Detecção de Salmonela: 
 
5.3 Contagem de Estafilococos coagulase positivo 
 
5.4 Contagem de Clostrídios Sulfito Redutores 
 
 
7. Conclusão 
37 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
 
Figura 7. Esquema geral de análise para enumeração de Estafilococos coagulase 
positivo em alimentos. 
 
38 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
Aula Prática nº 11 
 
 
 
ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE PRODUTOS LÁCTEOS 
 
 
 
1. Padrão microbiológico para leite e derivados. 
 
Obs: Consultar o regulamento técnico sobre padrões microbiológicos para alimentos 
(Anexo 6). 
 
2. Material requerido para análise 
 
 
� 1 Frasco/recipiente estéril; 
� Diluente: 225 mL de solução salina peptonada; 
 
� 3 Pipetas com capacidade de 1 mL; 
� Tubos de diluição: 2 tubos com 9,0 mL de solução salina peptonada/tubo; 
� 9 Tubos com 10 mL de caldo Lauril Sulfato Triptose (LST); 
� 1 Alça de níquel-cromo; 
 
� 9 Tubos com 10 mL de caldo Verde Brilhante Bile (VB); 
� 9 Tubos com 10 mL de caldo E. coli (EC); 
� 1 Alça de Drigalsky; 
 
� Placas com Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB); 
 
� 1 Tubo com 10 mL de caldo Rappaport Vassilidis (RV); 
 
� 1 Pipeta com capacidade de 2 mL; 
� 1 Tubo com 10 mL de caldo Tetrationato (TT); 
� 2 Placas com Entérico de Hectoen (HE); 
 
� 2 Placas com Ágar Bismuto Sulfito (BS); 
� 2 Placas com Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD); 
� 3 Placas com Àgar Sal Manitol ou Ágar Baird Parker (BP); 
 
 
3. Procedimento 
 
3.1 Determinação de Coliformes totais, Coliformes termotolerantes e E. coli 
 
- Técnica dos tubos múltiplos; 
 
3.2 Detecção de Salmonela 
 
3.3 Contagem de Estafilococos coagulase positivo 
 
- Contagem direta em placas
39 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
4. Informações relativas à amostra: 
 
4. Tipo de amostra e processo utilizado na fabricação_ 
 
5. Fabricante, data de fabricação, código do lote: 
 
6. Solicitante da análise: 
 
7. Data e local de coleta da amostra: 
 
8. Razão da análise: 
 
 
5. Resultados: 
 
5.1 Determinação de Coliformes totais, Coliformes termotolerantes, E. coli: 
 
a. Coliformes totais: 
b. Coliformes termotolerantes: 
c. Confirmação de E. coli: 
 
5.2 Detecção de Salmonela: 
 
5.3 Contagem de Estafilococos coagulase positivo 
 
6. Conclusão: 
 
 
 
 
 
 
 
 
40 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos –UFT 
 
Anexo 1 
 
Planos de amostragem 
 
- Planos variáveis: fornecedor e matéria-prima conhecidos e dentro de padrões; 
- Planos por atributo: planos de 2 classes e de 3 classes. 
 
 
Condições presumíveis de manipulação e consumo após a 
amostragem 
Tipo de risco à saúde Condições reduzem o 
risco 
Condições mantém o 
risco inalterado 
Condições aumentam 
o risco 
Sem risco direto à 
saúde 
categoria 1 
3 classes 
n = 5 c = 3 
categoria 2 
3 classes 
n = 5 c = 2 
categoria 3 
3 classes 
n = 5 c = 1 
Risco baixo e indireto categoria 4 
3 classes 
n = 5 c = 3 
categoria 5 
3 classes 
n = 5 c = 2 
categoria 6 
3 classes 
n = 5 c = 1 
Risco moderado, 
direto e difusão 
restrita 
categoria 7 
3 classes 
n = 5 c = 2 
categoria 8 
3 classes 
n = 5 c = 1 
categoria 9 
3 classes 
n = 10 c = 1 
Risco moderado, 
direto e difusão 
extensa 
categoria 10 
2 classes 
n = 5 c = 0 
categoria 11 
2 classes 
n = 10 c = 0 
categoria 12 
2 classes 
n = 20 c = 0 
Risco direto, grave categoria 13 
2 classes 
n = 15 c = 0 
categoria 14 
2 classes 
n = 20 c = 0 
categoria 15 
2 classes 
n = 60 c = 0 
n = número de unidades submetidas à análise; c = número de unidade fora do padrão tolerado 
Fonte: ICMSF (1978) 
 
� Plano de duas classes: 
n = número de unidades submetidas à análise; 
c = número máximo aceitável de unidades que podem exceder o valor de m; 
m = número máximo de microrganismos/g tolerado. 
 
Exemplo: 
n = 5; c = 0; m = 0 (ausência). 
 
� Plano de três classes: 
n = número de unidades submetidas à análise; 
c = número máximo aceitável de unidades que podem exceder o valor de m; 
m = limite inferior do número de microrganismos/g tolerado; 
M = limite superior do número de microrganismos/g tolerado. 
 
 
Obs: uma unidade é considerada aceitável se o resultado for inferior a m e 
inaceitável se for superior a M. resultados entre m e M conferem ao produto uma 
qualidade chamada marginal 
 
Exemplo: 
n = 5; c = 2; m = 10; M = 102 
 
Interpretação: 
- Se X > M = Inaceitável; 
- 2 unidades entre 5 podem conter entre 10 e 102 UFC/g; 
- Se 3 unidades entre 5 tem contagem entre 10 e 102 UFC/g, o lote é rejeitado.
41 
 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos – UFT 
 
 
� Definição dos microrganismos que devem ser 
estudados: 
 
a) Microrganismos sem risco direto à saúde: importância limitada quanto a 
capacidade de causar alterações nos alimentos, sem serem patogênicos. Ex: Fungos 
e bactérias aeróbias mesófilas; 
 
b) Microrganismos que oferecem um risco indireto à saúde do consumidor: 
indicadores de condições higiênico-sanitárias do produto, sem serem 
patogênicos, mas que podem indicar a possível presença de patógenos. A 
maioria é causadora de alterações nas características originais dos alimentos; 
 
c) Microrganismos que oferecem risco direto à saúde do consumidor: 
patógenos de interesse em alimentos. Dependendo da gravidade da patologia que 
provocam e do tamanho dos surtos que são capazes de causar. São classificados 
em três grupos: 
 
- Risco direto, moderado e difusão limitada: mic. potencialmente 
patogênicos que causam doenças relativamente brandas. Ex: S. aureus, C. 
perfringens tipo A, Coxiella burnetti, Yersinia enterocolitica, Campylobacter 
jejuni e o nematóide Trichinella spiralis; 
 
- Risco direto, moderado e difusão extensa: mic.potencialmente 
patogênicos que causam doenças mais graves que as do grupo anterior, 
e em doses infectantes mais baixas. Ex: Salmonella Typhimurium, E. coli 
patogênica, Shigella, Vibrio parahaemolyticus e estreptococos beta-
hemolíticos;holeras 
 
- Risco direto e grave: mic. altamente patogênicos, que não devem estar 
presentes em nenhum alimento. Ex: C. botulinum, Salmonella Typhi, 
Salmonella Paratyphi A e B, Salmonella Cholerasuis, Shigella dysenteriae 
tipo I, Vibrio cholerae, Brucella melitensis, Clostridium perfringens tipo C e 
vírus da hepatite infecciosa. 
 
42 
 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos – UFT 
 
 
Anexo 2 
 
 
Soluções diluentes 
 
Solução salina-peptonada: 
 
Cloreto de sódio 8,5g 
Peptona 1,0g 
Água destilada 1000mL 
Dissolver os componentes em água destilada; Distribuir em frascos em volumes 
apropriados; Esterilizar em autoclave a 121ºC/15min. 
 
Solução citrato de sódio: 
 
Citrato de sódio 1,25g 
Água destilada 100mL Dissolver o citrato de sódio em água destilada; 
Distribuir em frascos em volumes apropriados; Esterilizar em autoclave a 
121ºC/15min. 
 
Solução salina a 0,85%: 
 
Cloreto de sódio 0,85g 
Água destilada 100mL 
Dissolver o cloreto de sódio em água destilada; Distribuir em frascos em volumes 
apropriados; Esterilizar em autoclave a 121ºC/15min. 
 
43 
 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos – UFT 
 
 
 
Anexo 3 
 
Soluções desinfetantes 
 
 
Solução hipoclorito de sódio: 
 
Hipoclorito de sódio 100mg 
Água 1000mL 
Dissolver o hipoclorito em água. Concentração 100ppm. 
 
 
Solução de álcool iodado: 
 
Iodo 2,0g 
Álcool etílico a 70% 100mL 
Dissolver o iodo em álcool etílico 70%. 
 
Preparo do álcool 70%: 
 
- Álcool comercial 96ºGL = 92,8 INPM (Instituto Nacional de Pesos e Medidas – 
peso/volume) 
 
 
1000mL de álcool ---- 92,8% 
X -------------------------- 70% 
X = 745,31mL de álcool 
 
 
1000mL – 745,31mL = 245, 69mL 
 
 
- Para simplificar esta preparação sem perda significativa do poder bactericida 
do álcool 70%, adicionar 250mL de água a 750mL de álcool 92,8 INPM.
44 
 
Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos – UFT 
 
 
 
Anexo 4 
 
Regras para cálculo dos resultados na contagem de microrganismos por 
plaqueamento 
 
Obs: As regras abaixo estão exemplificadas considerando o cálculo dos resultados 
na contagem de microrganismos por plaqueamento em profundidade. 
 
Regra 1 – Se a contagem for feita numa placa inoculada com a amostra sem 
diluição, sem duplicata, o número de unidades formadoras de colônias (UFC) é igual 
ao número de colônias (Exemplos 1 e 2 – Quadro 1). Se foi feita em duplicata, o 
número de UFC é igual à média aritimédica da contagem obtida em cada uma das 
placas da duplicata (Exemplos 3 e 4 do Quadro 1). 
 
Quadro 1. 
Exemplo N° de colônias na(s) placa(s) da diluição Contagem UFC/ml 
Sem diluição 
(100) 
10 -1 10-2 
Sem duplicata 
1 199* 8 0 199 = 2,0 x 102 
2 245* 22 2 245 = 2,5 x 102 
Com duplicata 
3 62* - 57* 6 – 5 
 
(62+57)/2 = 59,2 = 6,0 x 101 
4 123* - 136* 12 – 10 0 - 0 (123+136)/2 = 129,5 = 1,3 x 102 
*Contagens efetivamente utilizadas no cálculo do resultado. 
 
Regra 2 – Se a contagem foi feita numa placa inoculada com a diluição 10 -1 
ou maior, sem duplicata, calcular o número de UFC/g ou ml multiplicando o número 
de colônias pelo inverso da diluição inoculada. O inverso da diluição 10 -1 é 10 1 , 
o inverso da 10 -2 é 10 2 e assim por diante (Exemplos 5 e 6 do Quadro 2). Se 
foi feita duplicata, considerar como número de colônias a média aritmética da 
contagem obtida em cada uma das placas da duplicata e multiplicar pelo inverso da 
diluição (Exemplos 7 e 8 do Quadro 2). 
 
Quadro 2. 
Exemplo N° de colônias na(s) placa(s) da diluição Contagem UFC/ml 
10 -1 10-2 10-3 
Sem duplicata 
5 199* 8 2 199 x 101 = 2,0 x 103 
6 Inc 245* 22 245 x 102 = 2,5 x 104 
Com duplicata 
7 Inc – Inc 62* - 57* 6 - 5 [(62+57)/2] x 102 = 59,2 x 102 = 6,0 
x 103 
8 Inc – Inc Inc – Inc 239*-242* [(239+242)/2] x 103 = 240,5 x 103 = 
2,4 x 105 
*Contagens efetivamente utilizadas no cálculo do resultado. Inc = Incontável 
 
 
 
 
 
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Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos – UFT 
 
 
Exemplo N° de colônias na(s) placa(s) da diluição 
(volume inoculado) 
Contagem UFC/ml 
10 -1 (2ml) 10-2 (1ml) 10-3 (1ml) 
Sem duplicata 
9 199* 18 2 (199/2) x 101 = 1,0 x 103 
10 123* 2 0 (123/2) x 101 = 6,2 x 102 
Com duplicata 
11 62* - 57* 6 - 5 0 - 0 [(62+57)/2]/2 x 101 = 29,75 x 101 = 
 
 
 
 
Regra 3 – Se o volume inoculado da primeira diluição (ou da amostra sem 
diluição) foi diferente de 1 ml e a contagem foi feita na placa inoculada com 
esse volume, valem as regras anteriores mas o número de colônias deve ser 
dividido pelo volume inoculado, para calcular o resultado (exemplos 9, 10, 11 e 
12 do Quadro 3). 
 
Quadro 3. 
 
 
 
 
 
 
 
 
3,0 x 102 
12 27* - 35* 3 – 3 0 - 0 [(27+35)/2]/2 x 101 = 15,5 x 101 = 
1,6 x 102 
*Contagens efetivamente utilizadas no cálculo do 
resultado. 
 
Regra 4 – Se a diluição não for decimal (1:20, 1:50, 1:200, etc.), valem as 
regras 2 e 3 mas é necessário inserir nos cálculos a diluição inicial aplicada. 
Considerando uma unidade analítica de m gramas ou mililitros, diluída em v 
mililitros de diluente, a diluição inicial é igual a m/(m+v), ou seja, unidade analítica 
dividida pelo volume total (diluente + unidade analítica). As diluições decimais 
subsequentes são a inicial multiplicada por 10-1(1° decimal), a inicial multiplicada 
por 10 -2(2° decimal) e assim por diante. Por exemplo, para uma unidade analítica 
de 50g preparada com 950ml de diluente, a diluição inicial é de 50/(50+950) = 
50/1000 = 1:20. A 1° decimal é 10 -1/20, a 2° decimal é de 10 -2/20 e assim por 
diante. O cálculo dos resultados ainda é feito multiplicando-se o número de 
colônias pelo inverso da diluição mas, nesse caso, o inverso da diluição é a 
fração invertida: inverso da diluição 1/20 = 20/1, inverso da 10 -1/20 = 20 x 10-1, 
inverso da 10 -2/20 = 20 x 102 e assim por diante (exemplos 13, 14, 15, 16, 17 e 18 
do Quadro 4). 
 
Quadro 4. 
Exemplo Unidade 
analítica 
Volume 
diluente 
Diluição 
inicial 
N° de colônias na(s) 
placa(s) da diluição 
UFC/g ou ml amostra 
Inicial 1° 
decimal 
2° 
decimal 
Sem duplicata 
13 10g 490ml 10/500=1/50 199* 18 2 199x50=1,0x104 
14 25g 350ml 25/375=1/15 280 30* 2 30x15x101 = 
4,5 x103 
15 25g 975ml 25/1000=1/40 Inc Inc 133* 133x40x102= 5,3 x 105 
Com duplicata 
16 25g 475ml 25/500=1/20 273*- 
229* 
21 – 20 2 – 1 [(237+229)/2]x20=4,7x103 
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Coelho, A.F.S.; Silva, J. F. M. Apostila de aula prática de microbiologia de alimentos – UFT 
 
 
17 10g 490ml 10/500=1/50 Inc - 
Inc 
62* - 
57* 
6 – 5 [(62+57)/2]x50x101=3,0x104 
18 10g 290ml 10/300=1/30 Inc - 
Inc 
Inc - 
Inc 
239*- 
242* 
[(239+242)/2]/2x30x102= 
7,2x105 
*Contagens efetivamente utilizadas no cálculo do resultado. Inc = 
Incontável 
 
Os exemplos acima são os de cálculos em condições ideais, com número de colônias na 
faixa de 25 a 250, em placas da mesma diluição, sem espalhamento. Mas são bastante 
frequentes as situações em que as placas não se apresentam em condições tão ideais, 
sendo aplicadas algumas regras básicas para o cálculo dos resultados. Essas regras são 
apresentadas a seguir, com exemplos no Quadro 4. 
 
Regra 5 – Uma placa da duplicata com contagem acima ou abaixo