Contagem aerobios mesofilos psicrotroficos

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Contagem total de Aeróbios Mesófilos e
Psicrotróficos em Placas
Significado da contagem total de aeróbios mesófilos
A contagem Total de Aeróbios Mesófilos em placas, (Aerobic Plate Count), também
denominada Contagem Padrão em Placas, é o método mais utilizado como indicador geral
de populações bacterianas em alimentos. Não diferencia tipos de bactéria, sendo utilizado
para se obter informações gerais sobre a qualidade de produtos, práticas de manufatura,
matérias primas utilizadas, condições de processamento, manipulação e vida de prateleira.
Não é um indicador de segurança, pois não está diretamente relacionado à presença de
patógenos ou toxinas. Dependendo da situação, pode ser útil na avaliação da qualidade,
porque populações altas de bactérias podem indicar deficiências na sanitização ou falha no
controle do processo ou dos ingredientes. Os produtos fermentados, ao contrário,
apresentam populações naturalmente altas de mesófilos, sem qualquer relação com a
qualidade.
A utilização da contagem total de aeróbios mesófilos como indicador de qualidade deve ser
criteriosa. Por exemplo, aplicada à ingredientes, deve levar em conta a diluição e o efeito
no produto final. Aplicada a alimentos desidratados, pode indicar se o controle da umidade
está sendo corretamente aplicado ao processo de secagem.
Definição de psicrotróficos
Microrganismos que crescem em alimentos sob refrigeração (0-7 C) são chamados de
psicrotróficos ou psicrotrófilos. São definidos como microrganismos capazes de produzir
crescimento visível a 7±1 C no prazo de 7 a 10 dias, independente de sua temperatura
ótima. Na classificação tradicional dos microrganismos em função da temperatura –
termófilos, mesófilos e psicrófilos - os psicrotróficos são um subgrupo dos mesófilos, não
dos psicrófilos, porque esses últimos geralmente morrem à temperatura ambiente. Os
psicrotróficos, ao contrário, se multiplicam em alimentos refrigerados, mas crescem
melhor nas temperaturas da faixa mesófila.
As principais bactérias psicrotróficas estão distribuídas em vários gêneros, incluindo, cocos
e bastonetes, esporogênicos e não esporogênicos, aeróbios e anaeróbios. As mais comuns
em alimentos (produtos lácteos, cárneos, aves, peixes e frutos do mar) são espécies dos
gêneros Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Brochothrix,
Carnobacterium, Chromobacterium, Citrobacter, Clostridium, Corynebacterium,
Enterobacter, Escherichia, Flavobacterium, Klebsiella, Lactobacillus, Leuconostoc, Listeria,
Microbacterium, Micrococcus, Moraxella, Pseudomonas, Psychrobacter, Serratia,
Shewanella, Streptococcus e Weissella.
Espécies de Alteromonas, Photobacterium e Vibrio são importantes deteriorantes de
pescados.
Espécies de Bacillus, Clostridium, Enterobacter, Flavobacterium, Pseudomonas e Yersinia
causam amolecimento e deterioração em vegetais refrigerados.
Brochothrix, Lactobacillus, Leuconostoc e membros da família Enterobacteriaceae são
deteriorantes de alimentos embalados sob vácuo ou atmosferas modificadas, bem como
Carnobacterium e Weissella viridescens, em menor extensão.
Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes, Acinetobacter, Klebsiella, Bacillus e
Lactobacillus são deteriorantes de produtos lácteos, Pseudomonas sendo a mais frequente.
Algumas bactérias patogênicas também são psicrotróficas, incluindo Listeria
monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Aeromonas hydrophila, Vibrio cholerae, algumas
cepas de E. coli enteropatogênica, algumas cepas de Bacillus cereus, algumas cepas de
Clostridium botulinum tipo E e tipos B e F não proteolíticos.
Métodos de análise
O método clássico de contagem total de aeróbios mesófilos ou psicrotróficos em alimentos
é a contagem padrão em placas (plaqueamento em profundidade, superfície ou filtração
em membrana). O meio de cultivo recomendado para a maioria dos ensaios é o Ágar
Padrão para Contagem (PCA), incubado a 35±1 C/48±2h, com as seguinte exceção: Na
análise de leite e produtos lácteos o Capítulo 6 do Standard Methods for the Examination
of Dairy Products recomenda incubar o PCA a 32±1 C/48±2h, prolongando a incubação até
72±3h no caso de produtos lácteos desidratados.
MÉTODO DE CONTAGEM TOTAL DE AERÓBIOS MESÓFILOS EM PLACAS
Método da American Public Health Association (APHA) para a análise de alimentos, descrito
no Capítulo 7 da 4ª Edição do Compendium of Methods for the Microbiological Examination
of Foods. Incluídas também as recomendações específicas do Capítulo 6 do Standard
Methods for the Examination of Dairy Products específicas para a análise de produtos
lácteos, e as da Seção 9215 do Standard Methods for the Examination of Water and
Wastewater, para a análise de água. Aplicação: análise de água e de todos os alimentos.
A contagem pode ser feita utilizando-se os métodos de plaqueamento em profundidade
(pour plate), superfície (spread plate) e filtração em membrana. O procedimento descrito
abaixo não apresenta esses detalhes, pressupondo que sejam conhecidos pelo analista.
MATERIAL REQUERIDO PARA A ANÁLISE
Preparação da amostra e diluições seriadas
• Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
• Tubos de diluição com 9ml de Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou Tampão Fosfato pH
7,2 (PB)
• Pipetas de 1 ou 2ml
Inoculação por plaqueamento em profundidade
• Placas de Petri de 20 x 100mm estéreis vazias
• Ágar Padrão para Contagem (PCA)
Inoculação por plaqueamento em superfície
• Placas com Ágar Padrão para Contagem (PCA)
• Alça de espalhamento (alça de Drigalski) mergulhada em etanol 70%
Incubação
• Estufa incubadora regulada a 35±1 o C com termômetro calibrado (para alimentos
em geral)
• Estufa incubadora regulada a 32±1 C com termômetro calibrado (para leite e
produtos lácteos).
Procedimento
O esquema geral de análise para contagem total de microrganismos aeróbios mesófilos
em placas encontra-se descrito na Figura abaixo.
PLAQUEAMENTO EM PROFUNDIDADE
a) Preparação das amostras e diluições seriadas. Seguir os procedimentos descritos
conforme slides anteriores.
b) Inoculação. Selecionar três diluições adequadas da amostra e inocular 1ml de
cada diluição em placas de Petri separadas, estéreis e vazias.
c) Adição do meio de cultura. Verter nas placas inoculadas, 12 a 15ml de Ágar Padrão
para Contagem (PCA), previamente fundido e resfriado a 44-46 C. Misturar o
inóculo com o meio de cultura movimentando suavemente as placas, numa
superfície plana, em movimentos na forma de oito ou em movimentos circulares,
oito a dez vezes no sentido horário e oito a dez vezes no sentido anti-horário.
Distribuir as placas numa bancada fria, sem empilhar, para solidificação do meio.
Para amostras em que seja comum a ocorrência de colônias grandes e espalhadas
(leite em pó, por exemplo), aguardar a completa solidificação do Ágar e adicionar
uma sobrecamada do mesmo meio.
d) Incubação. Inverter e incubar as placas nas seguintes condições:
 PCA-35±1 C/48±2h para alimentos em geral
 PCA-32±1 C/48±2h para produtos lácteos
 PCA-32±1 C/72±3h para produtos lácteos desidratados
e) Contagem das colônias e cálculo dos resultados. Selecionar as placas com 25 a 250
colônias e contar as colônias com o auxílio de uma lupa, em um contador de
colônias. Calcular o número de unidades formadoras de colônias (UFC) por grama
ou mililitro da amostra multiplicando o número de colônias pelo inverso da diluição
inoculada. Caso tenham sido utilizadas duas placas por diluição (duplicata),
considerar como número de colônias a média aritmética da contagem obtida em
cada uma das placas da duplicata. Usar notação exponencial e apenas uma casa
decimal depois da vírgula, na apresentação dos resultados.
Limite de detecção do procedimento padrão (1ml/diluição): 1 UFC/ml de amostras
líquidas ou 10 UFC/g de amostras sólidas.
PLAQUEAMENTO EM SUPERFÍCIE
a) Preparação das amostras e diluições seriadas. Seguir os procedimentos descritos
nos slides anteriores.
b) Preparação das placas. Preparar previamente placas de Ágar Padrão para
Contagem (PCA) e, antes do uso, secar em capela defluxo laminar (30 a 60 minutos,
com as tampas parcialmente abertas) ou em estufa (50 C/18-24h).
c) Inoculação. Selecionar três diluições adequadas da amostra e inocular 0,1ml de
cada diluição na superfície das placas previamente preparadas. Usando uma alça de
Drigalski, espalhar o inóculo por toda a superfície do meio, até que o excesso de
líquido seja absorvido. Se o nível de contaminação esperado da amostra for baixo,
inocular um volume maior da primeira diluição, distribuindo esse volume por
quatro placas (três placas com 0,3ml e uma placa com 0,1ml).
d) Incubação. Inverter e incubar as placas nas seguintes condições:
• PCA-35±1 C/48±2h para alimentos em geral
• PCA-32±1 C/48±2h para produtos lácteos
• PCA-32±1 C/72±3h para produtos lácteos desidratados
e) Contagem das colônias e cálculo dos resultados. Seguir as mesmas orientações
descritas para o plaqueamento em profundidade, porém, multiplicar o resultado
por dez, para levar em conta o volume dez vezes menor inoculado. Se foi feita a
distribuição de 1ml da primeira diluição em quatro placas, o número de colônias
dessa diluição é a soma das quatro placas. Se o cálculo do resultado for feito com a
contagem dessa diluição, então não é necessário multiplicar por dez.
Limite de detecção do procedimento padrão (0,1ml/diluição): 10 UFC/ml de amostras
líquidas ou 100 UFC/g de amostras sólidas.
MÉTODO DE CONTAGEM DE AERÓBIOS PSICROTRÓFICOS
Método da American Public Health Association (APHA), descrito no Capítulo 13 da 4ª Edição
do Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods e no Capítulo 8
da 17 Edição do Standard Methods for the Examination of Dairy Products. Aplica-se à
análise de todos os alimentos.
O Compendium recomenda que as amostras destinadas à contagem de aeróbios
psicrotróficos sejam analisadas no intervalo de seis horas, a partir da coleta. A estocagem
refrigerada permite sua multiplicação e o tempo de geração de vários desses
microrganismos encontra-se dentro desse intervalo. O congelamento não é indicado para
essas amostras, porque pode provocar injúria ou morte de vários microrganismos. Se o
congelamento for indispensável, considerar na avaliação dos resultados que parte da
microbiota pode ter sido perdida.
MATERIAL REQUERIDO PARA A ANÁLISE
Preparação da amostra e diluições seriadas
 Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
 Tubos de diluição com 9ml de Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou o Tampão Fosfato
pH 7,2 (PB)
 Pipetas de 1ml
Inoculação por plaqueamento em superfície
 Meio de cultura: placas com Ágar Padrão para Contagem (PCA), que pode ser
substituído pelo Ágar Tripticase de Soja (TSA) ou pelo Petrifilm Contagem Total (3M
Company)
 Alça de espalhamento (alça de Drigalski) mergulhada em etanol 70%
 Estufa incubadora regulada a 7±1 C com termômetro calibrado
 Estufa incubadora regulada a 17±1 C com termômetro calibrado (opcional)
PROCEDIMENTO
O esquema geral de análise para contagem total de microrganismos aeróbios psicrotróficos
em placas encontra-se descrito na Figura abaixo. Segue o mesmo procedimento da
contagem total de aeróbios mesófilos, alterando a condição de incubação. O Capítulo 13
do Compendium recomenda plaqueamento em Petrifilm ou plaqueamento em superfície,
usando Ágar Padrão para Contagem (PCA) ou Ágar Tripticase de Soja (TSA) como meios de
cultivo. Não recomenda o plaqueamento em profundidade porque as bactérias são
sensíveis ao calor e podem ser afetadas pelo meio de cultura quente. A incubação pode ser
feita a 7±1 C por 10 dias ou 17±1 C por 16 horas, seguido de mais 3 dias a 7±1 C. O
Standard Methods for the Examination of Dairy Products recomenda, para leite e produtos
lácteos, plaqueamento em profundidade, usando PCA resfriado a 45±1 C, antes da adição
sobre o inóculo. Incubação a 7±1 C por 10 dias.