RELATÓRIO DE COLIFORMES

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAIBA 
CENTRO DE TECNOLOGIA 
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS II 
PROFESSORA: JANEEYRE FERREIRA 
 
 
 
Relatório de aula prática 
Coliformes totais e termotolerantes 
 
 
 
 
Amana Magalhães Sitônio 
 
 
 
 
 
 
 
 
João Pessoa/PB 
2010 
 
1. Introdução 
 
Microrganismos indicadores são grupos ou espécies de microrganismos que, quando 
presentes em um alimento, podem fornecer informações, como ocorrência de contaminação de 
origem fecal, provável presença de patógenos, indicadores de condições sanitárias inadequadas. Sua 
presença ou ausência proporciona uma evidência indireta referente a uma característica particular do 
histórico da amostra. 
O leite é um excelente substrato para crescimento de microrganismos aeróbios devido à suas 
características intrínsecas, como o potencial de oxido-redução, elevada atividade de água, pH 
próximo a neutralidade e os teores de proteínas, carboidratos, minerais e vitaminas. Pode vir 
contaminado da cabra ou vaca doente ou na coleta pelos manipuladores ou até pelos recipientes que 
são coletados e armazenados. 
Coliformes são bactérias gram-negativas, anaeróbias facultativas em forma de bastonete. Este 
grupo é composto por bactérias da família Enterobacteriacie, são capazes de fermentar a lactose com 
produção de gás, em 24 a 48 horas a 35°C. O grupo de coliformes termotolerantes é um subgrupo 
dos coliformes totais, restrito aos membros capazes de fermentar a lactose em 24 horas a 44,5 – 
45,5°C, com produção de gás. 
O método de contagem de microrganismos em placas é um método geral e versátil que pode 
ser utilizado tanto para a contagem de grandes grupos microbianos como os aeróbios mesófilos como 
também para a contagem de gêneros e espécies em particular, como Staphylococcus aureus e 
Bacillus cereus, por exemplo. 
Como as células microbianas ocorrem muitas vezes em agrupamentos (pares, tétrades, 
cachos), não é possível estabelecer uma relação direta entre o número de colônias e o número de 
células. Assim, a relação é feita entre o número de colônias e o número de “unidades formadoras de 
colônias” (UFC), que podem ser tanto células individuais como agrupamentos característicos de 
certos microrganismos. 
 O método do número mais provável (NMP) permite calcular o número de um microorganismo 
específico numa amostra, utilizando tabelas de probabilidade. Diluições decimais da amostra são 
inoculadas em séries de tubos contendo meio líquido seletivo. Os tubos são positivos quando têm 
crescimento e/ou produção de gás de fermentação. A densidade bacteriana é determinada pela 
combinação de resultados positivos e negativos numa tabela designada por tabela do NMP. 
 
 
 
 
 
 
2. Objetivos 
 Método de contagem de microrganismos em placas (pour plate) – Estabelecer procedimento para 
a contagem de coliformes totais e termotolerantes no leite pasteurizado; 
 Método de contagem de microrganismos em tubos (Número mais provável – NMP) – Estabelecer 
procedimento para a determinação do Número Mais Provável de coliformes totais e 
termotolerantes no leite pasteurizado. 
 
3. Procedimento 
Esses procedimentos são comuns nas duas análises que serão feitas posteriormente: 
 As mãos foram higienizadas com água e detergente neutro e depois com álcool 70°; 
 Limpou-se a bancada a ser usada com detergente e álcool 70° e depois secou-se com uma folha 
de papel; 
 As amostras foram preparadas para a análise fazendo sua higienização com detergente e álcool 
70°; 
 Após a desinfecção da embalagem do leite, realizou-se a homogeneização do mesmo agitando-o 
em forma de arco para quebrar as unidades de microrganismos; 
 Com o auxílio do Bico de Bunsen, fez-se a esterilização de uma tesoura limpa anteriormente com 
álcool 70° para o rompimento da embalagem; 
 Fez-se a identificação dos tubos de ensaio e das placas de petri, tendo o cuidado de não se afastar 
da chama do bico de Bunsen para que não ocorresse uma maior contaminação das vidrarias; 
 Com o auxílio de pipetas graduadas de 2 ml, pipetou-se 1 ml de leite puro, diluição 100, (no caso, 
usou-se o leite cariri que apresenta ausência de CT e o CPP (10
2
 UFC/ml)) e foi colocado em 
tubos de ensaio que já continham o tubo de Duhran invertido (diluição 10
0
); 
 Pipetou-se 25 ml de leite puro que foi diluído em 225 ml de água peptonada (diluição 10-1); 
 Retirou-se 1 ml do frasco que continha o leite com diluição 10-1 e foi colocado em tubos de ensaio 
com 9 ml de água peptonada (diluição 10
-2
); 
 
3.1 Método de contagem em placas – pour plate 
 
 Retirou-se o PCA da geladeira e colocou-o no microondas, a temperatura de aproximadamente 
45°C, para deixá-lo homogêneo (até obter uma coloração amarelada); 
 Após o aquecimento, colocou-se o PCA em água corrente para diminuir sua temperatura; 
 Transferiu-se 1 ml de cada diluição para as placas de Petri. Foram utilizadas seis placas, duas para 
cada diluição (10
0
, 10
-1
, 10
-2
); 
 Adicionou-se o PCA nas placas e homogeneizou-as em forma de oito sobre a bancada; 
 Esperou-se sua solidificação e as placas foram invertidas; 
 Incubaram-se as placas na estufa numa temperatura de 35°C por 48 horas; 
 Realizou-se a contagem. 
 
OBS.: Essa análise foi feita em duplicata para garantir uma maior confiabilidade dos resultados nos 
métodos estatísticos. 
 
3.2 Método de contagem em tubos – Número mais provável (NMP) 
 
O método do NMP consiste nas seguintes etapas: 
 Teste presuntivo – leitura dos resultados obtidos na série de tubos múltiplos (teste qualitativo); 
 Teste confirmativo – sub-cultura dos tubos positivos do teste presuntivo em caldo de maior ou 
em Agar seletivo-diferencial para o microrganismo desejado). 
 
3.2.1 Teste presuntivo 
 
 Em tubos de ensaio contendo 10 ml do caldo LST, preparado anteriormente, adicionou-se 1 ml 
do leite em exame com o auxílio de uma pipeta. 
 Os tubos foram transferidos, na estante, para uma estufa a 35°C; 
 Verificou-se se houve formação de gás após 48 horas; 
 As diluições que deram positivo foram separadas (produção de gás); 
 
3.2.2 Teste Confirmativo 
 
 Após separadas as diluições que deram positivas, separou-se os meios (EC e VB) que serão 
utilizados e identificou-os; 
 Com o auxílio de uma alça flambada no bico de Bunsen, inoculou-se os meios (primeiro o EC e 
depois o VB) com uma amostra de leite; 
 Colocou-se em banho-maria, com temperatura ajustada; 
 Fez-se o descarte do resto das diluições em autoclave; 
 Esperou-se 24 horas para observar quais das diluições deram positivo no EC; 
 Com os tubos contendo o meio VB, já inoculado, colou-se em estufa (temperatura 44,5 - 45,5° C) 
e esperou-se 48 horas para confirmar quais das diluições deram positivas; 
 Descartaram-se as diluições e fez-se a contagem de coliformes totais. 
 
OBS.: Essa análise foi feita em triplicata para garantir uma maior confiabilidade dos resultados nos 
métodos estatísticos. 
4. Discussões 
 
 Observa-se que a higienização tanto pessoal quanto do ambiente que se vai trabalhar é muito 
importante para se ter uma análise com um resultado preciso, por mais que saibamos que nenhum 
método na microbiologia é 100% confiável; 
 A homogeneização também é uma questão importante, pois sendo bem feita não irá causa uma 
falsa resposta já que analisamos alíquotas da amostra; 
 A certa regularização da temperatura da estufa quanto do banho-maria é de muita valia para as 
análises de coliformes, pois a microrganismos que só são identificados em certos intervalos de 
temperatura; 
 Fazer as análises com repetições garante uma confiança no resultado final, pois se tem opção de 
comparar os resultados. 
 
 
5. Resultado 
 
Não foi possível realizar a contagem, devido à grande quantidade de colônias. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6. Referências bibliográficas 
 http://recife.ifpe.edu.br/recife/metodos_NMP.pdf 
 acessoem 06/04/2010 as 14:30 
 http://dgta.fca.unesp.br/carnes/Alunos%20PG/Veterin%C3%A1ria/roca202.pdf 
acesso em 06/04/2010 as 22:00 
 www.microbiologia.ufba.br 
acesso em 06/04/2010 as 22:00