Bioengenharia 1

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ 
CENTRO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS 
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS 
ENGENHARIA DE ALIMENTOS 
LABORATÓRIO DE BIOENGENHARIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Curva Padrão de Glicose + Frutose 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Maringá 2017 
Gabriela Cristina Barion 
Marina Martins 
Tayná Camila Cortez Maroldi 
 
 
 
 
 
 
 
Curva Padrão de Glicose + Frutose 
 
 
 
Relatório apresentado à disciplina de 
Bioengenharia. 
 
Professora: 
Profa. Dra. Gisele Cristina dos Santos 
Bazanella. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Maringá 2017 
RESUMO 
A sacarose é o dissacarídeo mais importante e facilmente hidrolisada pela enzima 
invertase, produzindo açúcar invertido, também muito utilizado na indústria alimentícia. 
A sacarose é constituída por uma molécula de glicose e uma de frutose e a dosagem dessas 
moléculas podem ser realizadas pelo método de DNS. O método de DNS (redução do 
ácido 3,5-dinitrosalicílico a ácido 3-amino-nitrosalicílico) foi realizado neste 
experimento para que a curva padrão de glicose + frutose fosse encontrada para dar 
continuidade com as aulas práticas. Ao realizar o experimento e a montagem da curva 
padrão, foi encontrado R² de 0,9938 e equação y=2,1319*x +0,062. 
 
1 INTRODUÇÃO 
 A sacarose é o dissacarídeo que mais se destaca por ser um dos mais importantes 
produtos devido à produção de álcool combustível. A primeira etapa é a hidrólise da 
sacarose, que obtém uma mistura de glicose + frutose, conhecida como açúcar invertido 
e é utilizado para evitar cristalização da sacarose e conferir maior maciez na fabricação 
de doces. Chama-se açúcar invertido pois após a hidrólise o desvio da luz polarizada sofre 
inversão de sentido, sendo inicialmente para a direita e após hidrólise, para a esquerda 
(QUÍMICA NOVA, 2008). A dosagem de glicose e frutose durante a reação de hidrólise 
pode ser feita pelo método de DNS Berkeley - modificado utilizando a técnica de 
espectrofotometria a 600 nm. 
 Com o uso da espectroscopia de absorção, é possível medir a quantidade de luz 
absorvida em função do comprimento de onda. A lei de absorção recebe o nome de Lei 
de Beer-Lambert e de acordo com ela, a absorbância é diretamente proporcional à 
concentração de uma espécie absorvente e ao caminho óptimo do meio absorvente. 
(SKOOG, 2006). 
 O objetivo do experimento é a determinação da curva padrão da glicose + frutose 
a partir do método do DNS. 
 
 
 
 
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 
2.1 ABSORCIOMETRIA 
Um dos principais instrumentos para as análises quantitativas de compostos 
bioquímicos são os métodos ópticos como a colorimetria e a espectrofotometria. Estas 
análises se baseiam na capacidade de algumas soluções absorverem a luz. Considerando 
que a luz é definida como uma radiação eletromagnética composta de é uma gama de 
comprimentos de ondas (nm), as análises colorimétricas se baseiam na absorção da luz 
visível pela substância a ser dosada e na espectrofotometria o princípio é semelhante, 
entretanto, o espectro de luz absorvido apresenta comprimentos de onda entre o 
ultravioleta e o infravermelho. Assim, quanto maior a concentração da molécula 
pesquisada, maior a absorção de luz, sendo relações diretamente proporcionais. Um raio 
de luz monocromática ao atravessar uma solução contendo uma substância, uma parte da 
luz será absorvida (Absorbância) e outra parte será transmitida atravessando a solução 
(Transmitância). A luz pode ser refletida pelo recipiente que contém a solução, entretanto, 
nas análises bioquímicas este fenômeno pode ser desconsiderado já que a natureza das 
cubetas (quartzo ou vidro) onde as soluções são depositadas para a leitura são eliminadas 
por comparação de amostra. A Transmitância é a razão a intensidade da luz emergente (I) 
e a intensidade da luz incidente (I0), isto é: A absorbância (A) é definida como logaritmo 
negativo da transmitância e, experimentalmente, é um parâmetro mais adequado por 
apresentar uma relação linear com a concentração da substância absorvente (SKOOG, 
2006). 
Os fotocolorímetros e espectrofotômetros são aparelhos que se baseiam nestes 
fenômenos físico-químicos para quantificar uma determinada amostra tendo um padrão 
de referência. Para a medida da absorção de luz visível ou invisível, as indústrias 
oferecem vários modelos de aparelhos com o objetivo de viabilizar as análises 
bioquímicas. Para o seu funcionamento, todo fotocolorímetro ou espectrofotômetro 
apresentam uma fonte de luz, que em geral é uma lâmpada de tungstênio para luz visível 
e uma de lâmpada de deutério para ultravioleta. O feixe de luz é direcionado para um 
monocromador, onde um comprimento de onda é selecionado, permitindo então a 
emissão de uma luz monocromática. A luz incide no compartimento onde a cubeta, 
contendo a amostra, é encaixado. A luz transmitida pela amostra alcança um 
fotomultiplicador que converte o estímulo óptico em elétrico que é então convertido em 
valores de absorbância, transmitância ou até mesmo em concentração, dependendo dos 
recursos do aparelho em uso (SKOOG, 2006). 
 
2.2 LEI DE BEER 
A lei de absorção, também conhecida como lei de Beer-Lambert ou somente como 
lei de Beer, nos diz quantitativamente como a grandeza da atenuação depende da 
concentração das moléculas absorventes e da extensão do caminho sobre o qual ocorre a 
absorção. À medida que a luz atravessa um meio contendo um analito que absorve, um 
decréscimo de intensidade ocorre na proporção que o analito é excitado. Para uma solução 
do analito de determinada concentração, quanto mais longo for o comprimento do 
caminho do meio através do qual a luz passa (caminho óptico), mais centros absorventes 
estarão no caminho, e maior será a atenuação. Também, para um dado caminho óptico, 
quanto maior for a concentração de absorventes, mais forte será a atenuação. A figura 1 
representa um esquema de como funciona a lei de Beer (SKOOG, 2006). 
 
Figura 1: Esquema do funcionamento da lei de Beer 
De acordo com a lei de Beer, a absorbância é diretamente proporcional à 
concentração de uma espécie absorvente e ao caminho óptico do meio absorvente, sendo 
esta uma medida adimensional (SKOOG, 2006). 
A lei de Beer pode ser empregada de diversas formas. Podemos calcular as 
absortividades molares das espécies se a concentração for conhecida. Podemos utilizar o 
valor medido de absorbância para obter a concentração se a absortividade e o caminho 
óptico forem conhecidos. As absortividades, no entanto, são funções de variáveis como o 
tipo de solvente, a composição da solução e da temperatura. Por causa da variação da 
absortividade com esses parâmetros, nunca é muito prudente tornar-se dependente de 
valores tabelados na literatura para realizar uma análise quantitativa. Portanto, uma 
solução padrão do analito no mesmo solvente e à temperatura similar é empregada para 
se obter a absortividade no momento da análise. Com mais freqüência, empregamos uma 
série de soluções padrão do analito para construir uma curva de calibração, ou curva de 
trabalho, de absorbância versus concentração ou para obter uma equação linear por 
regressão. Pode ser necessário também que a composição global da solução padrão do 
analito tenha de ser reproduzida de forma a se tornar a mais próxima possível daquela da 
amostra, para compensar os efeitos de matriz. Alternativamente, o método da adição de 
padrão é empregado com o mesmo propósito (SKOOG, 2006). 
2.2.1 Limitações 
Existem poucas exceções para o comportamento linear entre a absorbância e o 
caminho óptico a uma concentraçãofixa. Contudo, frequentemente observamos os 
desvios da proporcionalidade direta entre a absorbância e a concentração, quando o 
caminho óptico é mantido constante. Alguns desses desvios, denominados desvios reais, 
são fundamentais e representam limitações reais da lei de Beer. Outros são resultantes do 
método que empregamos para efetuar as medidas de absorbância (desvios instrumentais) 
ou resultantes de alterações químicas que ocorrem com a variação da concentração 
(desvios químicos) (SKOOG, 2006). 
Limitações reais da lei de Beer: A lei de Beer descreve o comportamento da 
absorção somente para soluções diluídas e nesse sentido é uma lei limite. Para 
concentrações que excedem 0,01 mol/L, a distância média entre os íons ou moléculas da 
espécie absorvente diminui a ponto de que cada partícula afeta a distribuição de carga, e 
assim a extensão da absorção, dos seus vizinhos. Uma vez que a extensão dessa interação 
depende da concentração, a ocorrência desse fenômeno causa desvios da relação linear 
entre a absorbância e a concentração. Um efeito similar ocorre algumas vezes em soluções 
diluídas de absorventes que contêm altas concentrações de outras espécies, 
particularmente eletrólitos. Quando os íons estão muito próximos uns aos outros, a 
absortividade molar do analito pode ser alterada em razão de interações eletrostáticas. 
Isso leva a um afastamento da lei de Beer (SKOOG, 2006). 
Desvios químicos: Os desvios da lei de Beer aparecem também quando a espécie 
absorvente sofre associação, dissociação ou reação com o solvente para gerar produtos 
que absorvem de forma diferente do analito. A extensão desses desvios pode ser prevista 
a partir das absortividades molares das espécies absorventes e das constantes de equilíbrio 
envolvidas. Infelizmente, uma vez que nem sempre estamos cientes de que esses 
processos estão afetando o analito, não há oportunidade de se corrigir a medida de 
absorbância. Os equilíbrios típicos que dão origem a esse efeito incluem o equilíbrio 
monômero-dímero, equilíbrio de complexação de metal quando um ou mais agentes 
complexantes estão presentes, equilíbrio ácido-base e equilíbrio de associação entre o 
solvente e o analito (SKOOG, 2006). 
Desvios Instrumentais - Radiação Policromática: A lei de Beer se aplica 
estritamente somente quando as medidas forem feitas com a radiação monocromática. Na 
prática, as fontes policromáticas que apresentam uma distribuição contínua de 
comprimentos de onda são utilizadas em conjunto com uma rede ou um filtro para isolar 
uma banda bastante simétrica de comprimentos de onda ao redor do comprimento de onda 
a ser empregado. Se a banda de comprimentos de onda selecionada para as medidas 
espectrofotométricas corresponder a uma região do espectro de absorção na qual a 
absortividade molar do analito for essencialmente constante, os desvios da lei de Beer 
serão mínimos (SKOOG, 2006). 
Desvios Instrumentais - Luz Espúria: A radiação espúria, comumente chamada 
luz espúria, é definida como a radiação do instrumento que está fora da banda de 
comprimento de onda nominal escolhida para uma determinação. Essa radiação espúria 
frequentemente resulta do espalhamento e reflexões das superfícies das redes, lentes ou 
espelhos, filtros e janelas. A luz espúria sempre leva a absorbância aparente a ser menor 
que a absorbância verdadeira. Os desvios decorrentes da luz espúria são mais 
significativos para os valores altos de absorbância. Considerando que a radiação espúria 
possa ser tão alta como 0,5% em instrumentos modernos, os níveis de absorbância 
maiores que 2,0 raramente são medidos a menos que as precauções especiais sejam 
tomadas ou sejam empregados instrumentos especiais com níveis de luz espúria 
extremamente baixos. Alguns instrumentos de filtro de baixo custo mostram desvios da 
lei de Beer para os valores de absorbância relativamente baixos como 1,0 por causa dos 
altos níveis de radiação espúria ou pela presença de luz policromática (SKOOG, 2006). 
Células desiguais: Outro desvio da lei de Beer quase trivial, mas importante, é 
causado pelo uso de células desiguais. Se as células que contém o analito e o branco não 
apresentam o mesmo caminho óptico e não são equivalentes em suas características 
ópticas, uma interseção vai ocorrer na curva de calibração. Esse erro pode ser evitado 
utilizando-se células muito parecidas ou empregando-se um procedimento de regressão 
linear para se calcular ambos, a inclinação e o intercepto, da curva de calibração. Em 
muitos casos, esta é a melhor estratégia porque um intercepto pode também ocorrer se a 
solução do branco não compensar totalmente as interferências. Outra forma de se evitar 
o problema das células desiguais com instrumentos de feixe único é empregar a mesma 
célula mantendo-a na mesma posição para as medidas do branco e para as do analito. 
Depois de se obter a leitura para o branco, a célula é esvaziada por aspiração, lavada e 
preenchida com a solução do analito (SKOOG, 2006). 
 
2.3 AÇÚCARES REDUTORES 
Os carboidratos são, predominantemente, poliidroxialdeídos ou poliidroxicetonas 
cíclicos, ou substâncias que liberam esses compostos por hidrólise. Os carboidratos estão 
divididos em três classes principais, de acordo com o seu tamanho: monossacarídeos, 
oligossacarídeos e polissacarídeos. Os monossacarídeos, ou açúcares simples, consistem 
em uma única unidade de poliidroxialdeído ou poliidroxicetona. Os carboidratos 
estudados fazem parte da classe de monossacarídeos (LEHNINGER, 2002). 
A glicose é obtida principalmente pela hidrólise do amido. Pelo seu peso 
molecular menor que a sacarose, suas soluções têm maior pressão osmótica e,portanto, 
penetra mais rapidamente o tecido vegetal. Suas soluções têm baixa viscosidade, mesmo 
em concentrações altas de glicose (BOBBIO, 2001). 
A frutose também é capaz de formar soluções com pressão osmótica maior que a 
sacarose. Além de ser o mais solúvel dos açúcares usualmente encontrados nos alimentos 
é também mais doce que a glicose e a sacarose (BOBBIO, 2001). 
Alguns monossacarídeos, como a glicose e a frutose, podem ser oxidados por 
agentes oxidantes relativamente suaves, tais como os íons férrico e cúprico. O carbono 
do grupo carbonila é oxidado a carboxila. Os açúcares com essa capacidade são chamados 
açúcares redutores (LEHNINGER, 2002). 
2.1 Identificação de açúcares redutores 
Açúcares redutores podem ser investigados pelo método DNS que emprega 
glicose como padrão. O DNS reage com carbonilo livre do açúcar redutor em condições 
alcalinas, formando ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, um composto aromático com 
absorção máxima a 540 nm, permitindo uma medição quantitativa a partir da absorção 
medida em espectrofotômetro (NEGRULESCU et al, 2012). 
 
3 MATERIAIS E MÉTODO 
3.1 MATERIAIS 
 Solução de glicose + frutose 1g/L; 
 Solução de DNS; 
 Água destilada; 
 Pipetas automáticas de 1000 μL e 5000 μL; 
 Tubos de ensaio (com tampas); 
 Recipientes para água fervida e água gelada; 
 Cronômetro; 
 Espectrofotômetro; 
 Cubetas. 
 
 3.2 MÉTODO 
 Para preparar a curva padrão de Glicose + Frutose foi utilizada a metodologia 
indicada na tabela 1, em duplicata. 
Tabela 1 - Concentração da curva padrão de Glicose + Frutose (solução 1gL-1) 
Tubo 
nº 
Volume de solução Glicose 
+ Frutose (mL) 
Volume de 
Água (mL) 
Concentração de Glicose + 
Frutose (mgmL-1) 
1 0 4,0 0 
2 0,4 3,6 0,1 
3 0,8 3,2 0,2 
4 1,2 2,8 0,3 
5 1,6 2,4 0,4 
6 2,0 2,0 0,5 
7 2,4 1,6 0,6 
8 2,8 1,2 0,7 
9 3,2 0,8 0,8 
10 3,6 0,4 0,9 
11 4,0 0 1,0 
De acordo com as proporções entre a solução de glicose + frutose e água contidas 
na tabela 1, as diluições foram preparadasutilizando pipetas automáticas, uma solução de 
glicose + frutose 1g/L previamente preparada, água destilada e tubos de ensaio. 
Com as diluições prontas, foi pipetado 0,5 ml de cada tudo para um tubo vazio, 
sempre trocando as ponteiras da pipeta ao trocar de amostra. 
À cada tubo contendo 0,5 ml das soluções, foi adicionado 2,5 mL da solução de 
DNS previamente preparada, com o auxílio de uma pipeta automática. Os tubos foram 
tampados e agitados. 
Todos os tubos com as diluições e a solução de DNS foram levados para um banho 
de água fervente (entrando em contato com a água todos ao mesmo tempo) por 10 minutos 
(tempo verificado com o cronômetro). Após o banho fervente, os tubos foram colocados 
num banho com água à temperatura ambiente por 3 a 5 minutos para que esfriassem. 
Cada tubo recebeu 3 ml de água destilada, adicionada com a pipeta volumétrica 
e, em seguida, foram agitados. 
A absorbância de cada tubo foi lida em espectrofotômetro a 600 nm, utilizando 
como branco a solução preparada no tubo 1 (tabela 1). Para a leitura de cada tubo usou-
se uma cubeta diferente e limpa e, as cubetas foram lidas em ordem crescente de 
intensidade de cor (tubo 1 ao tubo 11). 
 
 
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES 
Os resultados das leituras da absorbância estão presentes na tabela 2, segundo os 
quais foi calculada a média e os desvios padrões dos valores da duplicata. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabela 2. Resultados das absorbâncias das soluções de glicose + frutose 
Tubo nº Abs. 1 Abs. 2 Abs. (média±desvio padrão) 
1 0 0 0 
2 0,008 0,011 0,0095±0,0021 
3 0,055 0,054 0,0545±0,0007 
4 0,102 0,107 0,1045±0,0035 
5 0,146 0,153 0,1495±0,0049 
6 0,201 0,203 0,2020±0,0014 
7 0,257 0,252 0,2545±0,0035 
8 0,292 0,302 0,2970±0,0071 
9 0,340 0,354 0,3470±0,0099 
10 0,414 0,405 0,4095±0,0064 
11 0,429 0,435 0,4320±0,0042 
 
A partir dos valores de concentração da solução de glicose + frutose e dos valores 
médios da absorbância, construiu-se a curva padrão apresentada no gráfico 1. 
 
 
Gráfico 1. Curva padrão da solução de glicose + frutose 
 
É possível observar que a relação entre a concentração da solução e a absorbância 
é praticamente linear devido ao valor do R² ser muito próximo de 1. O gráfico também 
mostra que a concentração da solução é diretamente proporcional à absorbância. 
Com o estudo realizado e a obtenção da curva padrão, obteve-se também a 
equação da curva do tipo y=ax+b que relaciona perfeitamente a concentração da solução 
com a absorbância. Essa equação permitirá, em estudos futuros, a determinação da 
concentração de soluções semelhantes para avaliar a ação de enzimas como a invertase, 
por exemplo. 
 
 
5 CONCLUSÕES 
Com a realização do experimento foi possível determinar a curva padrão da 
solução de glicose e frutose sendo esta uma relação linear, validando a lei de Beer. Pode-
se considerar o resultado como satisfatório, visto que a duplicata apresentou pouco desvio 
entre as medidas. 
Além disso, o experimento mostra a eficiência do método do DNS para determinar 
a concentração de açúcares redutores, já que se tratou de um processo relativamente 
rápido e muito assertivo. 
 
 
6 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 
BOBBIO, Paulo; BOBBIO, Florinda Orsati. Química do Processamento de alimentos. 
3. ed. São Paulo: Varela, 1992. 143 p. Disponível em: 
<https://www.passeidireto.com/disciplina/ciencia-dos-alimentos-
i?type=6&materialid=3966792>. Acesso em: 6 out. 2017. 
FRANCISCO JUNIOR, Wilmo. Carboidratos: Estrutura, Propriedades e Funções. 
Química Nova na Escola, -, p.8-13, 6 maio 2008. Disponível em: 
<http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc29/03-CCD-2907.pdf>. Acesso em: 6 out. 2017. 
NEGRULUSCU, Anamaria et al. Adapting the Reducing Sugars Method with 
Dinitrosalicylic Acid to Microtiter Plates and Microwave Heating. J. Braz. Chem. 
Soc., Vol. 23, No. 12, p.2177, 2012. Disponível em: 
http://www.scielo.br/pdf/jbchs/v23n12/aop086_12.pdf. Acesso em: 09/10/2017. 
NELSON, D. L.; COX, M. Lehninger – Princípios de Bioquímica. 3ed. São Paulo: 
Sarvier, 2002. 
SANTOS, Ana Paula S Azevedo dos et al. Bioquímica prática: Potocolos para análise 
de biomoléculas e exercícios complementares. -: -, -. 93 p. Disponível em: 
<http://www.repositorio.ufma.br:8080/jspui/bitstream/1/445/1/Livro de Bioquimica 
Pratica.pdf>. Acesso em: 4 out. 2017. 
SKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH, Fundamentos de Química Analítica, Tradução 
da 8ª Edição norte-americana, Editora Thomson, São Paulo-SP, 2006.