Aula Sourthern- Northern- Western Bloting e FISH- Profra Glaucia Vilar (1)

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Southern, Northern, FISH e
Western blotting
Profra Glaucia Vilar
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1. Técnicas de hibridização
2. Southern blot
3. Northern blot
4. FISH 
5. Western blot
6. Comparação entre todas as técnicas
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O QUE É
HIBRIDAÇÃO/HIBRIDIZAÇÃO?
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HIBRIDIZAÇÃO
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 Técnica biológica molecular na qual uma sonda de DNA ou RNA de fita simples é
utilizada para localizar um gene ou molécula em uma célula ou tecido por
complementaridade.
 Quando as duas cadeias simples, que se associam, são de proveniência diferente, forma-
se uma cadeia híbrida e daí o nome hibridação.
 Detecção de sequências de nucleotídeos específicas.
 Determina o grau de semelhança genética entre combinações de sequências
de DNA. Esta técnica geralmente é usada para determinar a distância genética
entre duas espécies.
 Hibridização é fundamental em várias técnicas de biologia molecular como PCR,
Southern blot e outras.
Distância genética é uma medida da diferença de 
material genético entre diferentes espécies ou 
indivíduos da mesma espécie ou não.
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Charles Sibley e Jon Ahlquist foram os
pioneiros na utilização da técnica de
hibridização do DNA para investigar relações
evolutivas
TÉCNICAS DE HIBRIDIZAÇÃO
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TÉCNICAS DE 
HIBRIDIZAÇÃO
Southern 
blot
Northern
blot
FISH
Western 
blot
Usado para 
detectar DNA
Usado para 
detectar RNA
Usado para 
detectar proteína
Usado para 
detectar 
sequências de 
DNA em 
cromossomos
O QUE É BLOT/BLOTTING?
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Blotting 
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 Transferência de macromoléculas tais como ácidos nucleicos e proteínas para uma fase
sólida - uma membrana.
 Membranas de nylon ou nitrocelulose (pequenos fragmentos de ác. nucleicos ou
proteínas); PVDF- Fluoreto de polivinilideno (WB proteínas maiores)
"borramento" (blotting em inglês)
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O QUE SÃO SONDAS DE ÁCIDOS 
NUCLÉICOS?
Sondas de ácidos nucleicos
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HIBRIDIZAÇÃO
Sondas de ácidos nucleicos
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O que é o Southern Blot?
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Southern blot DNA
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 O Southern blot é uma técnica de biologia molecular utilizada para conferir se uma
determinada sequência de DNA se encontra ou não presente em uma amostra de DNA
analisada.
 A técnica recebeu esse nome em homenagem ao seu criador, o biólogo britânico Edwin
Southern da Universidade de Oxford.
 Existem outras técnicas de blotting em que os nomes são trocadilhos ao nome de
Southern (que significa "do sul", em português), como é o caso de Western blot
("ocidente") e Northern blot ("norte").
Southern blot DNA
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 Resumidamente, o Southern blot é uma técnica de hibridização DNA-DNA
 A metodologia consiste na fragmentação do DNA em pedaços menores, através de uma
eletroforese, seguindo-se a transferência para uma membrana e a detecção do fragmento
de DNA de interesse por hibridação com uma sonda específica.
Digestão do DNA com endonucleases de restrição
Eletroforese para separação dos fragmentos
Blotting dos fragmentos em uma membrana
Hibridização com sonda
Autoradiografia
Southern blot DNA
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Digestão do DNA com endonucleases de restrição
A primeira etapa é a fragmentação ou digestão do DNA, onde as longas sequências de
nucleotídeos devem ser divididas em fragmentos menores com a ajudas das
endonucleases ou enzimas de restrição. Cada enzima reconhece uma ou mais
sequências alvo e corta o DNA nestas sequências ou perto delas.
Enzimas de restrição
“tesouras moleculares”
Southern blot DNA
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Eletroforese para separação dos fragmentos
O DNA fragmentado é submetido a eletroforese em gel de agarose para separar os 
fragmentos de acordo com peso molecular à medida que passam por uma corrente 
elétrica.
Através do uso da eletroforese, podemos ver quantos diferentes fragmentos de DNA estão 
presentes em uma amostra, e o quão grande eles são em relação aos outros. 
Southern blot DNA
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Blotting dos fragmentos em uma membrana
Para transferência do DNA separado no gel para uma membrana de nitrocelulose ou de nylon, é
necessário colocar a membrana sobre o gel e aplicar pressão uniformemente distribuída sobre o gel,
levando à ligação do DNA à membrana.
Seguidamente, a membrana é aquecida (no caso da utilização de uma membrana de nitrocelulose) ou
exposta a radiação UV (no caso da utilização de uma membrana de nylon) para fixar permanentemente o
DNA à membrana.
Southern blot DNA
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Hibridização com sonda
A membrana é tratada com uma sonda hidridizadora, sendo
esta uma molécula de DNA isolada de sequência conhecida e
é idêntica, ou então complementar, àquela sequência a qual
se quer determinar a presença ou não na amostra.
A sonda de DNA é marcada de um modo que possibilite sua
detecção, sendo normalmente realizada por meio da
incorporação de átomos radioativos ou ligando-se a elas
corantes fluorescentes ou cromogênicos.
Essa sonda irá parear com qualquer sequência de DNA que
for complementar a ela. Deste modo, caso a sequência
buscada não estiver presente na amostra em questão, não
ocorrerá o pareamento.
Em seguida, todo excesso de sonda é lavado da membrana,
removendo toda a sonda não hibridizada presente nela.
Southern blot DNA
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Autorradiografia
A presença ou não da sonda na membrana (e as posições onde ela está presente) é
revelada por uma autorradiografia em um filme de raio-x, ou pelo aparecimento de
uma cor caso um marcador cromogênico tenha sido usado.
Southern blot DNA
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Southern blot DNA
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 Testes de paternidade
 Identificação criminal
 Identificar gene de interesse
 Identificar mutação ou rearranjo
de gene
 Usado em diagnóstico de
doenças genéticas
 Usado para identificar agentes
infecciosos
APLICAÇÕES:
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 In vitro susceptibility assay of drug-resistant HBV
(Kim, J. H., Park, Y. K., Park, E. S. and Kim, K. H. (2014). Molecular diagnosis and treatment of drug-resistant hepatitis B virus. 
World J Gastroenterol 20(19): 5708-5720.)
Southern blot DNA
O que é o Northern Blot?
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 O Northern blot é uma técnica de biologia molecular utilizada para estudar
a expressão gênica, ou seja, verificar se um determinado gene de um
genoma é ou não transcrito em RNA e quantificar.
 Tendo sido descrita por James Alwine, David Kemp, and George Stark, em
1977 na Universidade de Stanford, essa técnica é assim denominada
devido à similaridade do seu procedimento com o Southern blot (com a
diferença de que, em vez de DNA, a substância analisada por eletroforese
com uma sonda de hibridização é RNA).
Northern blot RNA 
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Desnaturar o RNA em fita simples
Eletroforese para separação dos fragmentos
Blotting dos fragmentos em uma membrana
Hibridização com sonda
Autorradiografia
Northern blot RNA 
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Northern blot RNA 
Desnaturação das moléculas de RNA para se 
tornarem moléculas de estrutura primária
Northern blot RNA
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APLICAÇÕES:
•Úteis em estudo de expressão gênica (verificar se um determinado gene de um 
genoma é ou não transcrito em RNA)
•Estudo de diferentes tecidos
•Estudo do padrão temporal de expressão de genes durante o crescimento do 
indivíduo
O QUE É HIBRIDIZAÇÃO 
FLUORESCENTE IN SITU (FISH)?
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FISH
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 A hibridização fluorescente in situ, conhecida como FISH (Fluorescence in situ
hybridization), é um técnica Citogenética usada para detectar e localizar determinadas
sequências de DNA em cromossomos detectando anomalias cromossômicas
 A técnica foi desenvolvida na década de 1980 e utiliza sondas fluorescentes que se ligam
somente às partes do cromossomo que apresentem um elevado grau de
complementaridade com a sequência sendo visualizadas por microscopia de
fluorescência.
Citogenética é um ramoda genética que
estuda a estrutura e função da célula,
especialmente os cromossomos.
FISH
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 A observação microscópica de cromossomos normais e anormais permitiram a
construção de mapas citogenéticos do genoma de muitas espécies.
 Estes mapas mostram a localização relativa de características morfológicas dos
cromossomos (ex: centrômeros, marcadores citogenéticos ou bandas) e lesões
cromossômicas visíveis.
 Esta técnica permite identificar a presença, ausência, quantidade ou localização de
segmentos cromossômicos específicos, através de sondas de DNA (segmentos
cromossômicos de sequência conhecida) marcadas com fluorocromos.
Por meio da técnica de FISH é possível investigar tecidos preservados, tecidos fixados
em formol, preparações para citogenética convencional, amostras de sangue
periférico, medula óssea e as amostras pré-natais como vilosidade coriônica, líquido
aminiótico, sangue fetal e material de abortamento.
FISH
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Fixar e permeabilizar as células
In situ hybridization
Lavagem de sonda em excesso
Análise ao microscópio de fluorescência
FISH
• Sondas que hibridam com sequências únicas 
ou loco-específicas;
• Sondas que hibridam com estruturas 
cromossômicas específicas (sondas 
centroméricas, teloméricas);
• Sondas que hibridam com sequências 
múltiplas de um mesmo cromossomo, 
também chamadas de “bibliotecas”, que 
“pintam” um cromossomo inteiro. 
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TIPOS DE SONDAS QUE PODEM SER UTILIZADAS
Sondas para locus único:
- genes, regiões satélites, centrômeros, telômeros ...
FISH
• Sondas que hibridam com sequências únicas 
ou loco-específicas-permitem identificar 
micro-deleções, alterações envolvendo genes 
específicos e oncogenes.
• Sondas que hibridam com estruturas 
cromossômicas específicas (sondas 
centroméricas, teloméricas);
• Sondas que hibridam com sequências 
múltiplas de um mesmo cromossomo, 
também chamadas de “bibliotecas”, que 
“pintam” um cromossomo inteiro. 
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TIPOS DE SONDAS QUE PODEM SER UTILIZADAS
Sondas para cromossomo total
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FISH
APLICAÇÕES
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 Análise de danos cromossomais
 Mapeamento genético
 Genômica comparativa
 Diagnóstico de doenças
(Expression Profiling of Rectal Tumors Defines Response to Neoadjuvant Treatment Related Genes. Palma et al, 2014)
Biopsias de pacientes com cancer colorretal. Usaram 2 sondas (verde e vermelha), cada sonda ligando-se a partes diferentes do gene
c-Myc. Numa célula normal, dois sinais vermelhos e dois verdes em separado são visiveis enquanto que em células com padrão
alterado de c-Myc há dois sinais sobrepostos (sinais amarelos).
(http://www.cancergeneticsitalia.com/dna-fish-probe/fhact/ Acessado em 31/10/2018)
FISH
O QUE É O WESTERN BLOT?
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 O western blot (ou immunoblotting) é uma técnica de biologia molecular e bioquímica
utilizada para identificar uma proteína de interesse em uma mistura de proteínas. Criada
em 1979 por Harry Towbin e seus colegas no Instituto Friedrich Miescher em Basel,
Suíca.
 Nesta técnica é utilizado um anticorpo marcado contra a proteína de interesse.
 Como consequência da interação do antígeno com o anticorpo, a proteína-alvo (o
antígeno), quando imobilizada no papel, pode ser identificada.
 Esta técnica permite detectar, caracterizar e quantificar múltiplas proteínas
principalmente aquelas que estão em baixas quantidades em determinada amostra.
Westhern blot Proteína
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Westhern blot Proteína
Extração de proteínas
Dosagem das proteínas
Eletroforese em gel
Blotting das proteínas em uma membrana
Bloqueio de ligações inespecíficas
Incubação com o anticorpo primário (específicos)
Incubação com o anticorpo secundário (peoxidase ou fluoróforo)
Tratamento com o substrato específico para revelação
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Extração de proteínas
Westhern blot Proteína
Após a coleta e armazenamento adequado da
amostra, esta deve ser homogeneizada, até que
nenhuma partícula de tecido seja visualizada.
Os métodos de homogeneização usados podem ser
divididos em cinco categorias: por homogeneização
mecânica, ultrassônica, por pressão, por
descongelamento e osmótica ou lise por detergentes.
O lisado deve ser centrifugado, a fim de permitir a
remoção de ácidos nucléicos, substâncias insolúveis e
proteínas abundantes, porque normalmente proteínas
pouco abundantes possuem valiosas informações
diagnósticas e são responsáveis por processos
importantes na célula.
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Extração de proteínas
Westhern blot Proteína
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Westhern blot Proteína
Dosagem das proteínas
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Eletroforese em gel
Westhern blot Proteína
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Westhern blot Proteína
Blotting das proteínas em uma membrana
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Westhern blot Proteína
Blotting das proteínas em uma membrana
As principais vantagens do Electroblotting são a velocidade e a transferência completa 
quando comparada à difusão simples e à transferência a vácuo.
O eletroblotting pode ser realizado por imersão completa de um sanduíche gel-
membrana em uma solução tampão.
Após a transferência, as membranas podem 
ser guardadas em geladeira em TBS para se 
proceder a imunodeteccção no dia seguinte.
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Westhern blot Proteína
Bloqueio de ligações inespecíficas
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Westhern blot Proteína
Incubação com o anticorpo 
primário (específicos)
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Westhern blot Proteína
Incubação com o anticorpo secundário 
(peroxidase ou fluoróforo)
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Westhern blot Proteína
Tratamento com o substrato específico 
para revelação
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Westhern blot Proteína
Tratamento com o substrato específico para 
revelação
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(https://www.creative-diagnostics.com/Sample-Gel-Preparation.htm
Acessado em 31.10.18)
Westhern blot Proteína
COMPARAÇÃO DAS TÉCNICAS
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Southern blotting Northern blotting Western blotting
Molécula 
detectada
DNA (ds) mRNA (ss) Proteína
Tipo de gel 
usado na 
eletroforese
Agarose Agarose com formaldeído Gel de poliacrilamida
Método 
blotting
Transferência por 
capilaridade
Trasnferência por 
capilaridade
Trasnferência elétrica
Sistema de 
detecção
Autoradiografia
Quimioluminescência
Colorimetria
Autoradiografia
Quimioluminescência
Colorimetria
Quimioluminescência
Colorimetria
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