Apostila de microbiologia laboratorial

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APOSTILA DE MICROBIOLOGIA LABORATORIAL 
 
 
 
 
 
 
 
Pamela Burigo 
 
Lages, 2018 
Como utilizar o microscópio ótico 
 
Primeiro conhecer o microscópio (Ver Figura). 
 
1. Descer a platina e colocar na objetiva de menor aumento, caso não esteja. 
2. Colocar a lâmina sobre a platina. 
3. Aproximar a lâmina da lente objetiva de 10X com o auxílio do macrométrico até 
focalizar a imagem. 
4. Tome cuidado para que a objetiva não toque a lâmina. 
5. Após a focagem na objetiva de menor aumento, girar o revólver para a próxima 
objetiva (40X). 
6. Ao mudar de objetiva, ajuste novamente a focagem, utilizando o micrométrico. 
7. Definido o campo, colocar uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço e 
observar ao microscópio com a lente objetiva de imersão (100X). 
8. Usar ​óleo de imersão somente ​na objetiva de ​100X​. 
9. Após a utilização limpar a objetiva com papel macio. 
 
 
 
Características gerais das bactérias 
 
As bactérias são organismos muito pequenos, porém maiores que os vírus, mas visíveis 
somente ao microscópio. Apresentam formas variadas e pertencem ao reino Monera, 
sendo, portanto, seres unicelulares – procariontes. 
 
➔ As que têm ​formas arredondadas são chamadas de ​cocos​, como o Streptococcus 
pneumoniae, capaz de causar a pneumonia no homem. 
 
➔ As alongadas são denominadas ​bacilos​, como o Clostridium tetani, responsável pelo 
tétano, 
 
➔ As de ​forma espiralada recebem o nome de ​espirilos​, como a Treponema pallidum, 
que causa a sífilis. 
 
➔ As que se ​parecem com uma vírgula são conhecidas como ​vibriões​, como o Vibrio 
cholerae, causador da cólera. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Prática - Coloração de Gram 
 
 
1. Princípio 
 
A coloração de Gram foi ​desenvolvida em ​1884​, por Hans Christian Gram. É um dos 
procedimentos de coloração mais utilizados dividindo as bactérias em dois grandes grupos: 
as bactérias ​Gram positivas​, ou ​Gram (+)​, e as bactérias ​Gram negativas​, ou​ Gram (-)​. 
 
Nesse procedimento, o esfregaço fixado pelo calor é coberto por um corante básico violeta, 
geralmente, o cristal violeta. O corante confere cor violeta a todas as células e é 
denominado corante primário. Após um curto período de tempo, o corante violeta é 
removido e o esfregaço coberto com lugol (I2+ KI), um mordente que fixa o corante aos 
componentes celulares. Quando o mordente é lavado os dois tipos de bactérias, Gram (+) e 
Gram (-), aparecem com uma cor violeta escura ou roxa. Em seguida, a lâmina é lavada 
com etanol ou com solução etanol-acetona. Esta solução, chamada de solução de 
descoloração, remove a cor violeta de algumas espécies de bactéria, mas não de outras. 
Após a remoção do excesso do álcool, a lâmina é recoberta com um segundo corante 
básico (fucsina com cor rósea). O esfregaço é lavado novamente e, depois de retirado o 
excesso de água com um papel de filtro, observado ao microscópio. Na primeira coloração, 
todas as células coram-se em violeta ou roxo. As ​bactérias que retêm a cor violeta após o 
tratamento ​com álcool ​são classificadas como ​Gram (+) e as bactérias que ​perdem a 
coloração violet​a são classificadas como ​Gram (-)​. Como essas últimas perdem a 
coloração violeta com o tratamento com álcool, elas não poderão ser facilmente 
observadas. Por isso a fucsina (um corante básico) é aplicada ao esfregaço, corando essas 
bactérias com coloração rósea. Surge daí o nome de contracorante para o segundo corante 
(fucsina). Como as ​bactérias Gram + retêm a cor violeta​, elas não são afetadas pela 
coloração rósea da fucsina. Diferenças estruturais na parede celular das bactérias Gram (+) 
e Gram (-) afetam a retenção ou a liberação do complexo cristal Violeta-mordente. Entre 
essas diferenças destaca-se a espessa camada de ​peptídeglicanano, parede celular das 
bactérias Gram (+)​. Ao contrário, ​a parede das bactérias Gram (-) mostra-se delgada e 
inclui a membrana externa rica em lipopolissacarídeos (LPS)​, não encontrado na 
parede das bactérias Gram (+). 
 
 
Soluções: 
 
Violeta de Genciana: ​Cristal violeta (1 g), Ácido Fênico (2g), Álcool Absoluto (10 ml) e 
Água Destilada (100 ml). 
Lugol: ​Iodo (1 g), Iodeto de Potássio (2 g) e Água destilada (300 ml). 
Álcool-acetona:​ Álcool etílico (800 ml) e acetona (200 ml). 
Fucsina Diluída:​ Fucsina (0,25 g em 10 ml álcool etílico) e Água destilada (90 ml) 
Prática 
 
1. Esterilizar a alça de platina na parte mais quente da chama do bico de Bunsen (limite 
da chama azul) até incandescer. 
 
2. Colocar uma gota de salina, pegar colônia colocar sobre a lâmina de vidro com salina, 
misturar gentilmente com o auxílio da alça. Fixar o esfregaço pelo calor flambando 
rapidamente a lâmina no bico de Bunsen. Esperar esfriar a lâmina para não ocorrer a 
cristalização do corante. 
 
Técnica da coloração de Gram 
 
1. Colocar o corante Violeta de Genciana sobre o esfregaço e deixar em repouso por 1 
minuto. 
 
2. Escorrer o corante da lâmina. Não lavar a lâmina com água. Adicionar a solução de lugol 
em quantidade suficiente para cobrir todo o esfregaço. Esperar por 1 minuto. 
 
3. Escorrer o lugol da lâmina e em seguida lavar com água. 
 
4. Descorar o esfregaço gota a gota com álcool-acetona por 30 segundos. 
 
5. Corar o esfregaço com fucsina diluída e esperar por 1 minuto. 
 
6. Lavar a lâmina com água corrente e secar com papel de filtro. Não esfregar a lâmina com 
o papel. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Classificação dos meios de cultivo 
 
● Meios para transporte e conservação 
● Meios para cultivo e isolamento 
● Meios comerciais para provas de identificação 
 
Transporte e conservação 
 
● Cary Blair 
● Salina Tamponada 
● Meio Stuart 
● Agar nutriente 
 
Cary Blair 
 
● Microrganismos intestinais patogênicos e outros coliformes fecais sobrevivem bem 
neste meio. 
● A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação 
dos microrganismos e a composição nutritiva garante a sobrevivência deles. 
● Utilizado para transporte de material fecal e consequente conservação dos 
microrganismos. 
 
Salina Tamponada 
 
● Meio líquido tamponado que mantém a bactéria viável. 
● Usado como meio de transporte de amostras biológicas. 
● Contém NaCl, fosfato dipotássico anidro, Glicerina bidestilada e água destilada. 
 
Meio Stuart 
 
● A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação de 
microrganismos e a composição nutritiva garante a sobrevivência deles. 
● Usado para transporte de diversos materiais e consequente conservação dos 
microrganismos. 
● Conservação de microorganismos patogênicos como: Haemophilus spp., 
Pneumococcus, Salmonella spp., Shigella spp. entre outros. 
 
Agar Nutriente 
 
● É um meio relativamente simples, de fácil preparação e barato, muito usado nos 
procedimentos do laboratório de Microbiologia. 
● Usos: 
● Análise de água, alimentos e leite 
● Meio para cultivo preliminar das amostras submetidas a exames bacteriológicos 
● Isolamento de organismos para culturas puras. 
● Observar esporulação de espécies de bacilos Gram positivos. 
● O uso mais frequente - conservação de culturas em temperatura ambiente, para os 
laboratóriosque não dispõem de crioconservação (freezer à - 70ºC). 
 
Cultivo e Isolamento 
 
● Ágar TSA 
● Ágar Chocolate 
● Ágar MacConkey 
● Ágar Sangue 
● Ágar CLED 
● Ágar Salmonella-Shigella 
● Ágar Manitol (MSA) 
● Ágar EMB 
● Ágar Mycosel 
● Ágar Sabouraud 
● Ágar Verde Brilhante (BGA) 
● Caldo Tioglicolato com indicador 
● Caldo Tioglicolato sem indicador 
 
Tryptic Soy Agar (TSA) 
 
● Caldo Triptona de Soja com 0,1% Agar 
● Também chamado de CASO Agar (Casein-peptone soymeal-peptone agar) 
● É recomendado para o cultivo de bactérias não fastidiosas – uso geral. 
 
Caldo BHI 
 
● Brain Heart Infusion – meio enriquecido 
● É um meio derivado de nutrientes de cérebro e coração, peptona e dextrose. 
● Fornece fontes de nitrogênio, carbono, enxofre e vitaminas. 
● Meio para cultivo de estreptococcos, pneumococos, meningococos, enterobactérias, 
não fermentadores, leveduras e fungos. 
● Pode ser utilizado na preparação do inóculo para teste de susceptibilidade aos 
antimicrobianos 
● Realização de teste de coagulase em tubo 
● Teste de crescimento bacteriano a 42 e 44°C 
● Teste de motilidade em lâmina. 
 
Agar Sangue 
 
● Meio enriquecido e diferencial 
● Compra-se a base comercial, depois de autoclavada e resfriada, adiciona-se 
sangue. 
● A conservação dos eritrócitos íntegros favorecem a formação de halos de hemólise 
nítidos. 
● Diferenciação de Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. 
Agar Chocolate 
 
● Meio de cultura enriquecido 
● À base do meio, é adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura 
alta, o que faz com que as hemácias lisem, liberando hemina e hematina, compostos 
fundamentais para o crescimento dos microrganismos exigentes. 
● Utilizado no cultivo de organismos fastidiosos (Ex.: Neisseria, Haemophilus) 
● Alguns organismos que não crescem em meios comuns são capazes de crescer 
neste meio 
 
Agar Thayer-Martin 
 
● Thayer-Martin Chocolate é um meio rico seletivo 
● É superior a outros meios de cultivo destinados para o isolamento de Neisseria 
gonorrhoeae e Neisseria meningitidis 
● Contém em sua fórmula antibióticos que inibem o crescimento de Neisserias 
saprófitas e outras bactérias, evitando contaminações. 
 
Agar Salmonella-Shigella (SS) 
 
● Seletivo e diferencial 
● Possui componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de sódio) que inibem 
microrganismos Gram positivos. 
● O meio possui lactose, que permite diferenciar bactérias lactose positivas e 
negativas 
Lactose positivas - produzem ácido que na presença do indicador vermelho - formação de 
colônias de cor rosa 
Lactose negativas - formam colônias transparentes. 
● Permite a detecção de H2S - formação de colônias de cor negra no centro. 
 
Agar MacConkey 
 
● Seletivo e diferencial 
● O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos. 
● A concentração de sais de bile é relativamente baixa, por isso não é tão seletivo 
para Gram negativos como, por exemplo, o ágar SS. 
● Usado para isolar bacilos Gram negativos (enterobactérias e não fermentadores) e 
verificar a fermentação ou não da lactose. 
 
Meio Hektoen 
 
● É um meio seletivo e diferencial 
● Utilizado para detectar a fermentação de lactose e produção de H2S 
● Possui a capacidade de inibir o crescimento de bactérias não-entéricas 
● Fermentados de lactose - amarelo ou salmão 
● Não fermentadores - sem cor 
● Produção de H2S - precipitado preto 
 
Agar Sal Manitol 
 
● Meio seletivo e diferencial 
● Utilizado para selecionar Staphylococci, que crescem em altas concentrações de sal 
● Diferencia Staphylococcus aureus de outros Staphylococci 
● Após o crescimento, Staphylococcus aureus é amarelo (fermenta o manitol), outros 
Staphylococci são brancos 
 
Agar CLED 
 
● Cystine Lactose Eletrolyte Deficient – Seletivo e diferencial 
● A deficiência de eletrólitos inibe o véu de cepas de Proteus. 
● Usado para isolamento e quantificação de microrganismos presentes em amostras 
urina. 
● Eficiente para isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e 
leveduras. 
● Colônias lactose positivas: cor amarela/ negativas: cor azul. 
 
Agar verde brilhante (BGA) 
 
● É um meio altamente seletivo, usado para o isolamento de outras salmonelas que 
não a S. Typhi, existentes nas fezes e em outros materiais. 
● A presença de extrato de levedura e duas peptonas fornecem os nutrientes 
● A lactose e a sacarose, juntamente com o vermelho de fenol, fornecem um sistema 
de diferenciação de fermentadores da lactose e/ou sacarose (ex: E. Coli). 
● Salmonelas não produzem ácido a partir destes açúcares. 
● O verde brilhante é o agente seletivo que inibe a flora de acompanhamento. 
 
Agar Eosina Azul de Metileno 
 
● Agar EMB é um meio para diferenciação ligeiramente seletivo 
● Utilizado para o isolamento e diferenciação de bacilos entéricos gram-negativos 
(Enterobacteriaceae e outros bastonetes gram-negativos). 
● Corantes Eosina Y e azul-de-metileno inibem as bactérias gram-positivas num 
determinado grau - diferenciar os fermentadores 
● Coliformes produzem colónias pretas-azuladas 
● Salmonella e Shigella são incolores ou têm uma cor âmbar transparente, não 
fermentam lactose 
● Escherichia coli poderão apresentar um reflexo verde metalizado característico, 
devido à rápida fermentação da lactose 
 
 
 
 
Meio Löwenstein Jensen 
 
● A base do meio é constituída por ovos integrais, o que permite amplo crescimento 
das micobactérias 
● O crescimento é satisfatório para o teste de niacina (que é positivo para 
Mycobacterium tuberculosis) 
● Utilizado para isolamento primário das micobactérias 
● Crescimento bom a excelente (colônias amarelas) - Mycobacterium tuberculosis e 
Mycobacterium avium 
● Incubação por 60 dias 
 
Agar Mycosel 
 
● A Cicloheximida, um dos componentes do meio, serve para selecionar dermatófitos. 
● O cloranfenicol inibe o crescimento de bactérias e alguns fungos filamentosos. 
● Usado para isolamento de fungos patogênicos, principalmente dermatófitos, a partir 
de material de investigação contaminado. 
● Crescimento bom a excelente: Trichophyton verrucosum, Candida albicans 
● Crescimento inibido: Aspergillus niger , Candida tropicalis, Penicillium spp. 
 
Agar Sabouraud 
 
● Meio com nutrientes que favorece o crescimento de diversos fungos leveduriformes 
e filamentosos. 
● Cultivo e crescimento de espécies de Candidas e fungos filamentosos, 
particularmente associados a infecções superficiais. 
● Caracterização macroscópica do fungo filamentoso (colônia gigante). 
 
Meios para identificação 
 
● Ágar TSI 
● CaldoTSB 
● Meio SIM 
● Ágar Citrato Simmons 
● Ágar Fenilalanina 
● Ágar base uréia 
● Caldo Triptona 
● Caldo Nitrato 
● Caldo Malonato 
● Ágar Bílis-Esculina 
● Ágar Sangue 
● Caldo base de Moelle 
 
 
 
 
Quanto ao estado físico 
 
Meios líquidos – são aqueles em que os nutrientes estão dissolvidos em uma solução 
aquosa. O crescimento bacteriano, nesse meio, muda seu aspecto, ou seja, o meio sofre 
uma turvação. 
 
Meios semissólidos – são aqueles que possuem, na sua composição, além dos nutrientes, 
uma pequena porcentagem de ágar, polissacarídeo proveniente de algas marinhas. São 
geralmente utilizados em tubos e, a partir desse tipo de cultura, é possível observar a 
motilidade bacteriana. 
 
Meios sólidos – são aqueles que possuem uma porcentagem maior de ágar (2%), além dosnutrientes. Podem ser dispostos em tubos ou em Placas de Petri, dependendo da 
finalidade. Através do meio sólido em placas de Petri, é possível, utilizando-se a técnica do 
esgotamento, conseguir o isolamento de colônias bacterianas. É o meio ideal para que seja 
feito o estudo da morfologia colonial. Já a cultura em ágar ​inclinado, fornece somente o 
crescimento bacteriano com a obtenção de uma biomassa de microrganismos. 
Quanto à função 
 
Meios simples – possuem os componentes essenciais para o crescimento de 
microrganismos pouco exigentes. Ex.: caldo simples. 
 
Meios complexos – são adicionadas ao meio simples substâncias enriquecedoras como 
sangue, soro, ovo, extrato de leveduras, etc. Ex.: Ágar sangue. 
 
Meios seletivos – são aqueles que favorecem o desenvolvimento de determinados 
microrganismos em detrimento de outros, geralmente pela adição de substâncias inibidoras. 
Ex.: Ágar Salmonella-Shigella. 
 
Meios diferenciais – permite o desenvolvimento de grupos de microrganismos com 
características relativamente definidas, o que permite diferenciar um grupo ou uma espécie 
de microrganismo. Ex.: Ágar MacConkey 
 
Meios sintéticos - são meios de composição química conhecida. São utilizados para estudo 
de necessidades nutricionais de determinadas bactérias. Ex.: Meio para micobactérias. 
 
Meios naturais: lagos, oceanos e solo. 
 
 
 
 
 
É estabelecida uma classificação funcional para os diferentes meios de cultura, que 
podem ser para: 
Pré-enriquecimento: para amostras que sofreram algum processo físico ou químico (Ex.: 
caldo lactosado); 
Enriquecimento​: desenvolvimento de bactérias gerais (Ex.: Caldo Tetrationato); 
Seletivo​: inibem o crescimento de alguns microrganismos e propiciam o desenvolvimento 
de outros ( Ex.: Manitol e MacConkey); 
Diferencial: ​permite a diferenciação de microrganismos parecidos (Ex.: Ágar sangue e 
MacConkey); 
Triagem​: avalia as atividades metabólicas, permitindo a identificação de vários 
microrganismos. (Ex.: Tríplice açúcar e ferro); 
Identificação: para realização de provas bioquímicas e funções fisiológicas do organismo a 
ser identificado (Ex.: Ágar citrato, Caldo nitrato); 
Dosagem: ​determinações de aminoácidos, vitaminas e antibióticos; 
Contagem: determinação quantitativa da população microbiana (Ex.: Ágar de Contagem 
em Placas, Ágar Baird-Parker) 
Manutenção​: conserva os microrganismos em laboratório (Ex.: Ágar Sabouraud). 
 
Segue mais exemplos de meios de cultura utilizados: 
Ágar MacConkey – favorece o crescimento de bactérias gram-negativas (enterobactérias e 
não fermentadoras). 
Ágar Manitol ​– favorece o crescimento de bactérias estafilococos, sendo muito utilizado 
para isolamento de Staphylococcus aureus. 
Ágar Thayer​- Martin Chocolate – isolamento de Neisseria gonorrhoeae e N. meningitidis. 
Ágar Selenito – inibe coliformes e outras espécies da flora intestinal, como estreptococos; 
favorece crescimento da Salmonella spp e Shigella spp. 
Ágar Sangue – favorece o crescimento da maioria dos microrganismos, sendo utilizado 
para identificação presuntiva de Haemophilus spp 
Ágar Löwestein Jensen​ – isolamento primário das micobactérias. 
 
Exemplos de meios específicos 
Agar Batata – Leveduras 
Agar Bismuto Sulfito – Salmonella spp (centro negro, borda clara e brilho metálico) 
Ágar Cled – Gram Positivo e Gram Negativo 
EMB (Eosina Azul de Metileno) – Seletivo para Gran Negativo 
Agar Loeffler – isolamento de Corynebacterium diphtheriae 
Exemplos de meios específicos 
Agar Lowestein Jensen – Micobactérias 
Agar Sal Manitol – Staphylococcus spp 
Agar Verde Brilhante – Salmonella spp, exceto S. typhi 
Agar Sabouraud Dextrosado – Fungos e Leveduras 
Agar Infusão Cérebro Coração – Fastidiosos como pneumococo e meningococo, muito 
utilizado em hemoculturas 
 
 
Meios de cultura: GRAM NEGATIVO 
 
● Nutrientes 
● Seletividade 
● AMOSTRA (1º fator) 
 
 
 AMBU MEIOS HOSPITAL MEIOS 
AMOSTRAS Urina MC + Cled Sondas MC/AS 
 Fezes MC/SS/XLD Materiais médicos MC/AS 
 Secreção MC/AS Locais (UTI, neonato, CC, CCIH AS 
 Esperma AC/AS 
 Ferida AS/MC/AC 
 
Legenda: MC - MacConkey AS - Ágar sangue 
 SS - Salmonella/Shigella AC - Ágar chocolate 
 XLD - ​Xilose Lisina Deoxicolato Cled 
 
➔ Quanto mais (+) enriquecido o meio, mais (+) exigente a bactéria 
➔ Ágar Chocolate​: Bactérias exigentes, fastidiosas e anaeróbias 
 
★ Precisa ter um meio seletivo e não seletivo 
 
INÓCULO:​ Quantitativo: contar 
 Qualitativo: (+) isolados (esgotamento) 
 
 
Analizar primeiro: macromorfologia (da colônia, não do meio) 
 aspecto - opaco, brilhante 
 tamanho - grande, média, pequena 
 forma - regular, irregular, cônica, convexa, etc. 
 
Gram em segundo: Se NÃO crescer no MC (cresceu é gram negativo) 
Lactose em terceiro: positivo colônias ​rosa​ - MC/ urina 
 positivo colônias ​amarela​ - CLED 
 negativo colônias incolores 
 
Lactose - açúcar: bactéria precisa 1º fermentar açúcar = lac + 
 2º oxidar 
 
★ Se NÃO fermenta lactose oxida 
 
Fermentadores: ​ENTEROBACTÉRIAS (kit 5 tubinhos) 
Oxidar:​ ENTERO, FASTIDIOSO, ENTRE OUTROS (kit 10 tubos) 
 
 
1º Macromorfologia Forma 
2º Via energética Lactose + ou + 
3º Classificação Fermentadora ou não fermentadora 
4º Reação Meios de cultura 
5º Leitura Qual bactéria 
6º Liberação Laudo 
 
 
 
Semeadura de cultura bacteriana 
 
Normas: Toda vez que se fizer uma semeadura os seguintes procedimentos deverão ser 
observados: 
 
1. As alças de vidro (Drigalsky) e de platina deverão ser flambadas antes e depois de 
qualquer operação de semeadura. A alça de Drigalsky deverá ser esterilizada 
mergulhando a mesma em uma placa de Petri ou Becker com álcool e, em seguida, 
levada rapidamente à chama do bico de Bunsen por tempo suficiente para iniciar a 
combustão do álcool. Cuidado! Não manter a alça sobre o fogo para que não se quebre. 
2. A alça de platina, por sua vez, deverá permanecer na chama do bico de Bunsen, 
formando um ângulo de 450 C, até incandescer. 
3. A alça de platina deverá ser esfriada na parede interna do tubo ou, se for o caso, no meio 
da placa de Petri ainda não inoculada. A alça de Drigalsky deve ser esfriada na face 
interna da tampa da placa de Petri antes de entrar em contato com a amostra. 
4. Toda a vez que se fizer uma semeadura em tubos de ensaio, deve-se flambar a boca 
dos mesmos, imediatamente após a retirada das tampas ou do algodão. A tampa deverá 
ser retirada com o dedo mínimo da mão que estiver segurando a alça de platina ou a 
pipeta. Após a retirada da amostra com as células, flambar novamente a boca do tubo, 
antes de recolocar a tampa. 
5. Não esquecer de identificar as culturas com o número do grupo de trabalho, seja no 
fundo da placa ou nas paredes dos tubos. Não marcar as tampas, pois elas podem ser 
trocadas acidentalmente, o que dificultará a posterior identificação do material. 
6. As placas de Petri e os tubos de ensaio deverão ser abertos e semeados próximo ao 
bico de Bunsen, para evitar contaminações com microrganismos presentes no ar. Emseguida, colocar o material na estufa a 370 C com a parte semeada voltada para baixo 
(no caso de placas), para evitar que a água que irá se condensar na tampa caia sobre as 
colônias. 
 
Método da estria em placa ou esgotamento 
 
O método da ​estria é rápido, porém ​apenas qualitativo​, uma vez que não permite a 
quantificação do número de bactérias presente na cultura em análise. Trata-se de um 
método de diluição que envolve o espalhamento por meio de estrias, a partir de um inóculo 
da cultura numa placa contendo meio de cultura sólido. 
 
Material: 
Placa contendo meio LB ou YT 
Cultura de bactéria crescida por uma noite a 370C 
Alça de platina 
Bico de Bunsen 
 
 
Procedimento 
 
Mergulhar a alça de platina, depois de devidamente flambada e resfriada, no meio de 
cultura com as bactérias. Note-se que dentro da alça fica uma leve camada de líquido 
(contendo bactérias). Levar esta alça até a placa de Petri contendo o meio de cultura e fazer 
uma estria da amostra bem junto à borda da placa. Fazer um pequeno traço na parte 
superior da placa. Flambar a alça e esfriá-la, para iniciar uma nova estria a partir do canto 
da primeira estria. Flambar novamente a alça, esfriá-la e ir fazendo esgotamentos 
sucessivos até o centro da placa. Incubar as placas a 37C por 24 h, para poder observar as 
colônias isoladas. 
 
A seguir tem uma figura que ilustra de forma simplificada o processo de estria em placa 
para obtenção de colônias isoladas (imagem tirada do livro Microbiologia de Brock). 
 
 
 
 
Meios de Cultura 
 
Os meios de cultura são preparações nas quais, ao longo de suas formulações, contêm 
nutrientes necessários para proporcionar o crescimento de microorganismos; 
 
Os mesmos podem ser sólidos, líquidos ou semi-sólidos; 
 
Em sua composição, há a necessidade em haver nutrientes considerados essenciais, e em 
concentrações relevantes, para que não ocorra uma situação inibitória de crescimento; 
 
A esterilização deve ser realizada após a preparação de cada meio de cultura. O objetivo 
desta etapa é eliminar qualquer organismo vivo classificado como contaminante. 
 
Após finalização da preparação, o meio de cultura deve ser mantido em local livre de 
contaminação, para que no momento de sua utilização, o mesmo esteja em perfeitas 
condições. 
 
Classificação 
 
Os meios de cultura são classificados em alguns tipos, que seguem abaixo: 
 
• Seletivo; 
• Diferencial; 
• Enriquecimento; 
• Transporte; 
 
Classificação - Seletivo 
 
Os meios classificados como seletivos, são aqueles que suprimem o desenvolvimento (ato 
de crescimento) de determinados microorganismos em benefício de outros. De uma 
maneira bem “básica e popular”, eles “inibem o microorganismo na qual o usuário não 
deseja, e deixa prevalecer somente o que o mesmo deseja focar” 
 
Exemplo: Ágar MacConkey 
 
Esse ágar é considerado seletivo, pois pelo fato de conter em sua composição sais biliares 
e cristal de violeta, inibem as bactérias GRAM +, separando as que são GRAM -; 
 
Obs: ele é ​considerado um meio diferencial também​, pois permite saber se a bactéria em 
questão fermenta ou não a lactose. 
 
Indicador de pH. 
Em situações onde a bactéria fermenta lactose, o pH do meio torna-se ácido, obtendo 
coloração vermelha. Quando não há fermentação da lactose, significa que o meio possui 
caráter básico, obtendo cor amarela. 
 
 
 
 
Classificação - Diferencial 
 
Os meios classificados como diferencial, entre diversos grupos de microorganismos 
baseando-se na capacidade de metabolização de componentes específicos do meio de 
cultura ou morfologia das colônias, permitem a distinção. 
 
Exemplo: Ágar Sangue 
 
O mesmo é considerado diferencial pois permite verificar se a bactéria ocasiona hemólise 
ou não. A hemólise é notada quando há a presença de um halo ao redor da colônia. Há 
uma interpretação com respeito a hemólise também, ou seja: 
 
β hemólise: hemólise total; 
α hemólise: hemólise parcial; 
γ hemólise: sem hemólise 
 
Obs: ele não é considerado um meio seletivo, pois permite o crescimento tanto de bactérias 
GRAM + quanto GRAM -. 
 
 
 
 
Classificação - Enriquecimento 
 
Os meios de enriquecimento proporcionam nutrientes favoráveis ao crescimento de 
microorganismos presentes geralmente sob baixos números ou de crescimento lento. 
 
Exemplo: Ágar Chocolate 
 
O mesmo possui sangue em sua composição. Durante a preparação, pelo fato do meio 
estar sob altas temperaturas, as hemácias presentes neste sangue são hemolisadas, 
exteriorizando todo o seu conteúdo, “enriquecendo” o meio, consequentemente. 
Obs: O ágar chocolate não é considerado diferencial, pois não há hemólise da hemácia pela 
bactéria. A hemácia já foi hemolisada quando o meio foi preparado. 
 
 
 
 
 
 
Semeadura da amostra em superfície 
 
 
Técnica I – Meio líquido 
 
Primeiro, mergulha-se a alça de platina esterilizada na cultura bacteriana. Em seguida, a 
alça carregada de bactérias deve ser mergulhada no tubo com o meio de cultivo e agita-se 
a alça (Figura 8.1). 
 
O objetivo dessa técnica é observar a respiração das bactérias. 
 
 
Técnica II – Meio semissólido 
 
Primeiro, mergulha-se a agulha de níquel-cromo esterilizada na cultura bacteriana. Em 
seguida, é feita uma “injeção” com a agulha carregada de bactérias no meio de cultivo 
semissólido (Figura 8.2). 
 
O objetivo dessa técnica é observar a motilidade das bactérias 
 
 
 
Técnica III – Meio sólido (ágar inclinado) 
 
Primeiro, mergulha-se a alça de platina esterilizada na cultura bacteriana; depois, 
encosta-se levemente a alça no tubo com o meio de cultura na parte mais baixa do plano 
inclinado e eleva-se, fazendo estrias na superfície do ágar (Figura 8.3). 
 
O objetivo dessa técnica é obter uma concentração de massa bacteriana. 
 
Técnica IV – Meio sólido (placa de Petri – técnica do esgotamento) 
 
Divide-se a placa de Petri em três partes, fazendo linhas com a caneta retro projetor na 
parte de baixo da placa. 
 
Mergulha-se a alça de platina esterilizada na cultura bacteriana. 
 
Devem ser feitas estrias em cada divisão, respeitando as linhas e utilizando da melhor 
forma possível toda a superfície da placa (Figura 8.4). 
 
O objetivo dessa técnica é obter (isolar) culturas puras de amostras que contenham 
microbiota mista, sendo igualmente útil para o estudo da morfologia colonial. 
 
 
 
 
 
 
Provas bioquímicas - Prova de catalase 
 
A catalase é uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio (H2O2) em água e 
oxigênio. É produzida por muitos microrganismos, e usualmente empregada para 
diferenciar Staphylococcus​, ​catalase positivos​, de ​Streptococcus, catalase negativos 
 
Utilidade: Para Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Listeria, Corynebacterium, 
Micrococcus, Bacillus, Moraxella catarrhalis. 
 
Inoculação 
 
1. Colocar uma gota de peróxido de hidrogênio (água oxigenada) 3% sobre uma lâmina em 
um tubo; 
 
2. Com auxílio de fio bacteriológico, agregar a colônia em estudo na gota de peróxido de 
hidrogênio. 
 
Positivo​: Presença imediata de bolhas - a produção de efervescência indica a conversão 
do H2O2 em água e oxigênio gasoso. 
Negativo​: Ausência de bolhas ou efervescência. 
 
Catalase Positivos​: Staphylococcus,Micrococcus (Micrococcus, Kocuria e Kytococcus, 
Alloiococcus) - 
 
Catalase Negativos​: Streptococcus, Enterococcus 
 
 
Provas bioquímicas - Prova Coagulase 
 
Verificar a capacidade de microrganismos reagirem com o plasma e formarem um coágulo, 
uma vez que a coagulase é uma proteína com atividade similar à protombrina, capaz de 
converter o fibrinogênio em fibrina, que resulta na formação de um coágulo visível. ƒPode 
ser encontrada em duas formas que possuem diferentes propriedades: coagulase 
conjugada e coagulase livre. 
A ​coagulase conjugada (prova em lâmina)​, é também conhecida como fator de 
aglutinação, encontra-se unida à parede celular bacteriana e não está presente em filtrados 
de cultivos. Quando as células bacterianas são suspensas em plasma (fibrinogênio), 
formam-se cordões de fibrina entre elas, o que causa agrupamento sob a forma de grumos 
visíveis. 
 
A ​coagulase livre (prova em tubo)​, é uma substância similar à trombina e está presente 
em filtrados de cultivos. É secretada extracelularmente e reage com uma substância 
presente no plasma denominado Fator de Reação com a Coagulase – CRF, para formar um 
complexo que, por sua vez, reage com fibrinogênio, formando fibrina (coágulos). Quando 
uma suspensão em plasma do microrganismo produtor de coagulase é preparada em tubo 
de ensaio, forma-se um coágulo visível após o período de incubação. 
Utilidade: Separar as espécies de ​Staphylococcus de importância clínica, ​S. aureus – 
coagulase positiva, das demais espécies – coagulase negativa. 
 
Coagulase livre: 
1. Com auxílio do fio bacteriológico, suspender colônias em estudo em caldo BHI ​e colocar 
em estufa à 37ºC até que turve; 
2. Se necessário, acertar a turbidez até 0,5 da escala de MacFarland; 
3. Em um tubo de ensaio estéril, colocar 0,5 ml de plasma de coelho, nunca humano, 
reconstituído e 0,5 ml do caldo BHI com crescimento bacteriano recém turvado; 
4. Incubar em estufa à 35ºC 4 horas; 
5. Verificar se há presença de coágulo; 
6. Se não houver presença de coágulo, incubar o tubo em temperatura ambiente e repetir 
as leituras com 18 e 24 horas de incubação. 
Coagulase livre: 
Positiva​: presença de qualquer grau de coágulo. 
Negativa​: ausência de coágulo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Prática - Identificação de bactérias através de testes bioquímicos 
 
Objetivo: ​Analisar distintas reações bioquímicas e sua utilização como método diagnóstico 
para enterobactérias 
 
Introdução: ​Bactérias pertencentes à mesma família, mas gêneros distintos, podem ser 
eventualmente identificadas baseando-se em características bioquímicas como a 
capacidade de utilização de diferentes fontes de carbono, expressão de enzimas 
específicas (urease, deaminases e etc). Testes bioquímicos são uma das bases para a 
identificação de bactérias patogênicas em laboratórios de análises clínicas, juntamente com 
outras provas complementares (sorologia, PCR e etc.). Na aula de hoje serão utilizadas 
provas bioquímicas para a identificação de bactérias da família Enterobacteriaceae 
particularmente para os gêneros Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Shigella, 
Salmonella e Proteus. 
 
Procedimento 
 
Dia 1 - Cada grupo receberá uma placa de meio TSA com uma cultura pura identificada 
apenas por um número. 
 
Em seguida os alunos deverão: 
 
1. Com a alça bacteriológica, tocar em uma colônia e inoculá-la na placa MacConkey 
(estriar para isolar colônias). Com uma agulha tocar em uma colônia e perfurar o meio MILI 
não encostando no fundo do tubo. Após flambar a alça, repetir o mesmo procedimento para 
o meio EPM estriando também a amostra na superfície do tubo. Estriar uma colônia na 
superfície inclinada do meio contendo CITRATO. 
 
2. Incubar por 24 h a 37°C 
 
Dia 2 ​- Leitura da série bioquímica dos resultados e identificação dos gêneros bacterianos. 
 
Leitura 
1)​ ​Agar MacConkey​ - Indicador de bactérias fermentadoras de Lactose. 
 
Colônias lactose ​positiva​: ​coloração vermelha​ (produz ácido) 
Colônias lactose​ negativa​: ​incolores​ (produz amônia) 
 
Princípio: ​O ágar MacConkey é composto por peptona de caseína, peptona de carne, sais 
biliares, lactose, cloreto de sódio, vermelho neutro, cristal violeta, ágar bacteriológico e água 
destilada. Somente bactérias adaptadas à sobrevivência em ambientes com concentrações 
de sais biliares equivalentes à do ágar MacConkey conseguirão proliferar neste meio de 
cultura. Para estas, será imposta a condição de lactose como único carboidrato disponível. 
As bactérias capazes de metabolizar a lactose liberarão ácido no meio de cultura, o que 
diminuirá o pH e fará com que o indicador vermelho neutro mantenha sua coloração 
avermelhada, mantendo o meio e as colônias destas bactérias também avermelhadas. No 
entanto, se as bactérias não forem capazes de utilizar a lactose como fonte primária de 
energia, os aminoácidos presentes nas peptonas fornecerão energia após serem 
metabolizados. Neste metabolismo, o produto será amônia, que liberada no meio, provocará 
o aumento do pH, fazendo com que o indicador mude a coloração do ágar MacConkey para 
amarelo e as colônias ficarão incolores. 
 
2) meio EPM ​- Os testes de produção de CO2, H2S e urease são verificados na base. O 
teste para a enzima L-triptofanodesaminase é observado na superfície do meio Obs: todas 
as enterobactérias fermentam glicose. 
 
Leitura das Provas 
 
Glicose - A fermentação da glicose pode ser observada pela presença de bolhas de gás 
C6H12O6→ Etanol + CO2(g) 
 
Prova ​positiva​: base ​amarela​ ​com presença de bolhas de ar 
Prova ​negativa​: base ​amarela​ ​sem bolhas de ar 
 
H2S ​- Na2SO3→ H2S (reage com Fe dando coloração preta) 
 
Prova​ positiva​: base​ preta 
Prova ​negativa​: base ​amarela​ ou ​inalterada 
 
Urease - ​As bactérias que sintetizam urease convertem a uréia em amônia e gás carbônico. 
A amônia alcaliniza o meio, alterando a cor do indicador de pH azul de bromotimol de 
amarelo para azul. 
 
Prova​ positiva​: base ​azul 
Prova ​negativa​: base ​amarela​ ou​ inalterada 
 
Triptofanodesaminase - ​A desaminação oxidativa do L-triptofano catalisada pela 
L-triptofano desaminase resulta na formação de cetoácido que, em presença de ferro, 
alcaliniza o meio, alterando a cor do indicador de pH azul de bromotimol na superfície para 
verde escuro. 
 
Prova ​positiva​: superfície​ verde escuro 
Prova ​negativa​: superfície​ ​azulada​,​ amarelada​ ou ​inalterada 
 
3) Meio de Mili (Motilidade, Indol e Lisina decarboxilase) - O teste de motilidade e lisina 
decarboxilase são verificados na base e o teste de indol é feito adicionando-se algumas 
gotas de​ reativo de Kovac​ (dimetilaminobenzaldeído) na superfície do meio. 
 
Motilidade 
 
Prova ​positiva​: meio ​turvo 
Prova ​negativa​: meio​ límpido​ ou ​crescimento só no local do inóculo 
 
Indol - ​Indol é um componente do aminoácido triptofano. Algumas bactérias conseguem 
utilizar triptofano como nutriente com a ajuda da enzima triptofanase que catalisa a 
conversão de triptofano em indol. Quando o triptofano é degradado, a presença de indol 
pode ser detectada através de sua reação com ​reagente de Kovac​,que é amarelo, dando 
origem a uma coloração avermelhada na superfície do tubo. 
 
Prova​ positiva​: coloração ​vermelha 
Prova​ negativa​: coloração ​amarela 
 
L-lisina descarboxilase - A descarboxilação da lisina elimina a parte ácida do aminoácido 
produzindo aminas alcalinas, que elevam o pH do meio e ​transformam a cor ​amarela ​do 
indicador de pH (bromocresol) ​em roxa​. 
 
4) Agar Citrato de Simmons - Este meio de cultura possui citrato como única fonte de 
carbono. Bactérias que podem utilizar citrato como fonte de carbono crescem em Ágar 
citrato e provocam alcalinização do meio devido à liberação de CO2 ao final da reação. O 
indicador de pH (azul de bromotimol) passa de verde a azul (pH>7.5). 
Observe que quando não ocorre utilização do citrato, não há crescimento bacteriano, pois 
citrato é a única fonte de carbono do meio. 
 
Prova ​positiva​: coloração ​azul 
Prova ​negativa​: coloração do ​meio inalterada 
 
 
 
 
 
 
Prática - Antibiograma (Teste de sensibilidade dos microrganismos aos 
agentes antimicrobianos) 
 
Agentes quimioterápicos são agentes químicos utilizados no tratamento de doenças 
infecciosas. Seus modos de ação implicam na interferência com o metabolismo microbiano 
sem causar efeito lesivo à célula hospedeira. 
 
Antibióticos - São sintetizados e secretados por certas bactérias, actinomicetes e fungos 
que matam ou inibem o crescimento de outros microrganismos. Atualmente, alguns 
antibióticos são sintetizados ou modificados em laboratórios, contudo, originam-se dos 
organismos vivos. 
 
Exemplos: 
 
Ampicilina: Impede a incorporação do ácido murâmico no componente mucocomplexo da 
parede da célula, inibindo assim, a síntese da parede celular. 
 
Estreptomicina: ​Tem afinidade pelos ribossomos bacterianos, causando erros de leitura no 
códon do mRNA, interferindo assim, na síntese proteica. 
 
Cloranfenicol: Tem afinidade pelos ribossomos bacterianos, impedindo a formação da 
ligação peptídica entre os aminoácidos durante a síntese proteica. 
 
Tetraciclina: Tem afinidade pelos ribossomos bacterianos, impedindo a ligação de 
hidrogênio entre o anticódon no complexo aminoácido-tRNA e o códon no mRNA durante a 
síntese proteica. Agentes ou drogas sintéticas são agentes químioterápicos sintetizadas em 
laboratório. 
 
Exemplos: 
 
Sulfadiazina (sulfanamida)​: tem o efeito de inibição competitiva. Isto é, o componente ativo 
da droga, age como um antimetabólico que compete com um metabólito essencial, o ácido 
p-aminobenzóico (PABA), durante a síntese do ácido fólico na célula bacteriana. O ácido 
fólico é uma coenzima celular essencial para a síntese de aminoácidos e purinas. 
 
Antibiograma 
 
Método de Difusão em ÁGAR (Método de Kirby-Bauer) O antibiograma é um teste que 
permite a verificação “in vivo” da sensibilidade de uma bactéria aos antibióticos. Esta 
sensibilidade é demonstrada pela zona ou halo de inibição de crescimento que se forma em 
volta do disco de antibiótico. De acordo com o DIÂMETRO do halo de inibição diz-se que a 
bactéria é sensível (<16mm) ou resistente (>16mm) ao antimicrobiano testado. 
 
Material: 
Cultura bacteriana crescida por 18 horas (105 células por mL); 
Placas com meio de cultura Müller-Hinton; 
Discos de antibióticos; 
Cotonetes e pinças esterilizados. 
 
Procedimento: 
 
1. Agitar bem a cultura bacteriana (Escherichia coli ou Staphylococcus aureus); 
 
2. Umedecer o cotonete na suspensão bacteriana, retirando o excesso ao apertar o 
cotonete contra a parede interna do tubo; 
 
3. Espalhar a suspensão bacteriana em toda a superfície do meio de cultura, de modo 
homogêneo, inclusive nas bordas; 
 
4. Colocar os discos de antibióticos com auxílio da pinça sobre a superfície do meio e de 
modo equidistante; 
 
5. Incubar as placas a 370 C por 18 horas. 
 
6. Utilizando um “Swab” aplicar por toda a superfície da placa de Petri a cultura bacteriana 
crescida; 
 
 7. Aplicar os discos de antibióticos na superfície da placa utilizando a pinça. 
 
Resultados 
 
Leitura e interpretação: Verificar a presença ou ausência de halo de inibição ao redor dos 
discos. Medir o DIÂMETRO dos halos, vide figura a seguir, e verificar se o microorganismo 
é resistente, parcialmente resistente ou sensível. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMO 
 
Faz o gram para saber se é + ou - 
 
Faz a prova da catalase 
Catalase (+): Staphylococcus, novobiocina 
Catalase (-): biliesculina 
 
Faz a prova da coagulase 
Produção de coagulase (ex. o S. epidermis é coagulase negativo, enquanto que o S. aureus 
é coagulase positivo) 
coagulase negativos resistencia à novobiocina (para identificar o S. saprophyticus) 
ex. S. epidermis vs. S. saprophyticus 
 
alfa: hemólise parcial 
beta:hemólise total 
gama: sem hemólise