Aula 2 - Meios de cultura, Gram e Identificação de Sthaphylococcus

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MEIOS DE CULTURA 
COLORAÇÃO DE GRAM
IDENTIFICAÇÃO DE STAPHYLOCOCCUS
Cristina Maria Meireles
Coloração de Gram
 Em 1884, Hans Cristian 
Joaquim Gram observou que 
ao tratar bactérias com 
diferentes corantes, elas 
adquiriam cores distintas. Isso 
permitiu classificá-las em dois 
grupos: as que se coravam de 
roxas, então denominadas de 
Gram-positivas, e as que se 
coravam de rosa ou 
vermelhas, chamadas de 
Gram-negativas. 
Coloração de Gram
 Essa classificação se refere às diferenças da 
composição da parede celular. As bactérias Gram-
negativas possuem uma fina camada de 
peptideoglicano e uma membrana externa composta 
por bicamada lipídica, adquirindo a coloração rosa ou 
vermelho do corante secundário, safranina ou fucsina. 
 Já as bactérias Gram-positivas possuem uma 
espessa camada de peptideoglicano e grandes 
quantidades de ácido teicóico, adquirem a coloração 
violeta ou roxa pela capacidade em reter o corante 
primário.
Coloração de Gram
Metodologia
Confecção do esfregaço (colocar uma gota de salina sobre a lâmina, tocar 
com alça bacteriológica a colônia isolada e espalhar na salina com 
movimentos ovais. Fixar com calor, passando a lâmina sobre chama de bico 
de Bunsen de 2 a 3 vezes até completa secagem do esfregaço);
Cobrir com cristal violeta por 1 minuto.
Lavar com água corrente;
Cobrir com Lugol 1% por 1 minuto;
Lavar com água corrente;
Aplicar o agente diferenciador álcool-acetona 95% por 10 a 20 segundos;
Lavar com água corrente;
Cobrir com Fucsina ou Safranina (0,1 a 0,2%) por 30 segundos;
Lavar com água corrente e secar com papel-filtro;
Observar ao microscópio óptico com objetiva de imersão (100X).
Coloração de Gram
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Meios de Cultura
Microbiologia Clínica
Meios de Cultura Conjunto de substâncias,
formuladas de maneira adequada, capazes
de promover o crescimento bacteriano, em
condições de laboratório.
A maioria das bactérias podem ser
cultivadas em laboratório, utilizando-se
meios nutrientes;
Diferentes espécies de bactérias, variam
extensivamente quanto as exigências
mínimas de substâncias nutrientes;
Características Básicas dos 
Meios de Cultura:
- Fonte de Carbono e Nitrogênio; 
- Fonte de Energia; 
- Sais Minerais; 
- Fatores de Crescimento; 
- Condições Físicas; 
- Esterilização.
Meios de cultura
 Desenvolvimento dos 
microorganismos
◼Nutrientes
◼ pH
◼ Pressão osmótica
◼Umidade
◼ Temperatura
◼Atmosfera 
◼ esterilidade
Estado físico
Sólidos – agentes solidificantes, 
principalmente ágar (1 a 2%)
Semi-sólidos –ágar (0,075 a 0,5%)
Líquidos - caldo
Composição química
Naturais ou complexos : composição 
química não definida
Artificiais, sintéticos ou quimicamente 
definidos
Semi-sintéticos: meios naturais aos 
quais se adiciona um substância 
conhecida
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Composição química
Básicos : caldo ou ágar simples
Enriquecidos: ágar sangue, ágar 
chocolate, meio de Tarozzi, Baird-
Parker e outros
Seletivos: alterações nos fatores físico-
químicos ou adição de fator seletivo 
(antibiótico)
Seletivos - os que contém substâncias que inibem o desenvolvimento de 
determinados grupos de microrganismos, permitindo o crescimento de 
outros. Exemplo: meios complexos suplementados com sais que inibem o 
crescimento de bacterias gram positivas – usado na separação de 
coliformes.
Diferenciais - quando contém substâncias que permitem estabelecer
diferenças entre microrganismos muito parecidos, tais como meio de
Teague ou Eosina Azul de Metileno (diferencial para coliformes), Ágar
MacConkey para a diferenciação de enterobactérias, Ágar sangue, agar
Baird-Parker para isolamento e diferenciação de cocos Gram positivos
(sólidos).
Tipos de Meio de cultura
Identificação - prestam-se para a realização de provas bioquímicas e
verificação de funções fisiológicas de organismos submetidos a
identificação (meios Oxidação/Fermentação, Ágar Citrato, Caldo nitrato,
meio semi-sólido, caldo triptofano, meio de Sulfito Indol Motilidade, etc.;
Meios de pré-enriquecimento - são aqueles que permitem a
dessensibilização de microrganismos injuriados. Ex. Água peptonada,
caldo lactosado (isolamento de salmonelas de leite em pó).
Meios de Enriquecimento - quando proporcionam nutrientes adequados 
ao crescimento de microrganismos presentes usualmente em baixos 
números ou de crescimento lento.
Tipos de Meio de cultura
Tipos de Meio de cultura
Contagem - empregados para a determinação quantitativa da população
microbiana (Agar de Contagem em Placas, TSC, Agar Batata Dextrose,
Ágar Baird-Parker, etc.);
Estocagem ou manutenção - utilizados para conservação de 
microrganismos no laboratório, i.e. garantem a viabilidade de 
microrganismos (Ágar Sabouraud, Meios com leite, Ágar suco de tomate, 
Ágar sangue, Ágar Simples, meio semi-sólido, etc.).
PREPARO DE MEIOS DE 
CULTURA
O preparo de um meio de cultura para 
bactérias requer os seguintes materiais:
 Ágar
 Copos descartáveis
 Frascos de meio de cultura
 Água destilada
 Balança
 Placas de Petri
PREPARO DE MEIOS DE 
CULTURA
Para seu preparo, deve seguir os seguintes passos:
A) Coloque a quantidade indicada de ágar em uma vidraria.
B) Adicione água destilada para dissolver o ágar na quantia indicada.
C) Para dissolvê-lo totalmente, esquente a solução e em seguida agite-a.
D) Realize uma esterilização na amostra através de uma autoclave.
E) Distribua os meios de cultura em Placas de Petri e coloque-as em temperatura 
ambiente para solidificação.
F) Agora está tudo pronto! Insira alguns micro-organismos e crie colônias.
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http://www.bioscan.com.br/produto.php?cat_id=67&pro_id=145
http://www.palotina.ufpr.br/lacoma/TSI_LIA.jpg
http://www.bioscan.com.br/imagens/produtos/73_mini.jpg
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PREPARO DE MEIOS DE 
CULTURA 
Caldo Simples - formulação:
Extrato de carne ............ 0,3 g
Peptona ......................... 1,0 g
Cloreto de sódio ............ 0,5 g
Água destilada .............. 100,0 ml
O ágar simples é obtido adicionando-se 1,0 a 
2% de ágar-ágar ao meio de caldo simples
Exemplos de meios específicos
• Agar Batata – Leveduras 
• Agar Bismuto Sulfito – Salmonella spp
(centro negro, borda clara e brilho 
metálico) 
• Ágar Cled – Gran Positivo e Gran
Negativo 
• EMB (Eosina Azul de Metileno) –
Seletivo para Gran Negativo 
• Agar Loeffler – isolamento de 
Corynebacterium diphtheriae.
Exemplosde meios específicos
• Agar Lowestein Jensen – Micobactérias
• Agar Sal Manitol – Staphylococcus spp
• Agar Verde Brilhante – Salmonella 
spp, exceto S. typhi
• Agar Sabouraud Dextrosado – Fungos 
e Leveduras 
• Agar Infusão Cérebro Coração –
Fastidiosos como pneumococo e 
meningococo, muito utilizado em 
hemoculturas.
Técnicas de Semeadura
Em estrias: Objetivo - Obter o crescimento 
do micro-organismo no meio de cultura 
afim de: 
Estocar a bactéria; Estudar seu 
metabolismo em uma prova “bioquímica”; 
Avaliar sua capacidade de crescimento ou 
não no meio de cultura; Procedimento –
Assepticamente, semear o micro-
organismo com auxílio de alça ou agulha 
de níquel cromo, fazendo estrias.
Técnica de Semeadura em 
Picada:
Objetivo - Verificar a motilidade do 
micro-organismo no Agar Semissólido. 
Procedimento - Semear o micro-
organismo com auxílio de uma agulha 
de níquel cromo, fazendo uma picada 
no centro do meio de cultura 
penetrando até a metade da sua altura, 
do meio como apresentado na figura ao 
lado. 
Após o período de incubação interpretar 
o resultado: 
Bactéria móvel: crescimento por todo 
meio de cultura. Bactéria imóvel: 
crescimento somente no local da picada
Técnica em Semeadura em 
Esgotamento:
Objetivo - Obter colônias isoladas, o que permite distinguir 
os diferentes micro-organismos em um material ou cultura 
polimicrobiana através da sua morfologia colonial.
Procedimento - Semear o material ou a cultura microbiana 
com auxílio de uma alça de níquel cromo, fazendo 
sequências de estrias na superfície do meio de cultura da 
placa de Petri.
Inicie transferindo o material para o meio (“Esgotamento” 
Inicial). Fazer sequências de estrias de modo a obter o 
esgotamento do inoculo da alça (estrias do bordo para o 
centro da placa) e consequentemente permitir que os 
microorganismos se desenvolvam formando colônias 
isoladas. 
A flambagem da alça entre cada sequência de estrias 
aumenta a probabilidade de obtenção de colônias isoladas.
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Morfologia Colonial
MICROBIOLOGIA CLÍNICA
ESTAFILOCOCOS
➢ Família: Micrococcaceae Gênero: 
Staphylococcus
➢ Definição do Gênero:
➢ Estafilococos (gr. staphyle, uva) são 
cocos Gram-positivos, imóveis, 
agrupados em massas irregulares ou 
em cachos de uva. 
➢ Aeróbios ou anaeróbios facultativos, 
catalase positivos. 
➢ Fermentam a glicose com produção de 
ácido, tanto em aerobiose, como em 
anaerobiose, e nisso se diferenciam 
dos microrganismos do gênero 
Micrococcus, que só fermentam em 
aerobiose.
MICROBIOLOGIA CLÍNICA
ESTAFILOCOCOS
➢ Morfologia
➢ Células esféricas de 
cerca de 1um de 
diâmetro para os 
estafilococos 
patogênicos, maiores e 
desiguais em se 
tratando de 
estafilococos ou 
micrococos saprófitas, 
consideram-se os 
estafilococos como 
acapsulados.
ESTAFILOCOCOS
➢ Cultura:
➢ Crescem bem nos meios de culturas mais comuns,
como o caldo simples ou ágar simples, pH 7, à
temperatura ótima de 37 C.
➢ Em placa de ágar simples, após 24 horas na estufa a
37 C, produzem colônias de cerca de 1-3mm de
diâmetro, convexas, da superfície livre e bordos
circulares, opacas e brilhantes.
➢ Deixando a placas um ou dois dias à temperatura
ambiente, as culturas de estafilococo patogênicos,
recém isoladas, geralmente desenvolvem um
pigmento amarelo, ao passo que os estafilococos
saprófitas formam colônias brancas.
Principais Espécies de 
Estafilococos
➢ Atualmente o gênero Staphylococcus é composto por
cerca de 27 espécies sendo algumas freqüentemente
associadas a uma ampla variedade de infecções de
caráter oportunista, em seres humanos e animais.
➢ As principais espécies de estafilococos encontrados
em seres humanos são os Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus
saprophyticus.
➢ O S. epidermidis é encontrado primariamente como
residente da pele, tendo um baixo potencial
patogênico, assim como o S. saprophyticus, que faz
parte da microbiota normal da região periuretral do
homem e da mulher e da pele.
➢ Ao contrário, o S. aureus é um patógeno em potencial
e pode ser encontrado na região da nasofaringe e
também nas fossas nasais.
Sthaphylococcus aureus
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Staphylococcus aureus –
Características Principais
 O Staphylococcus aureus é o agente mais comum em
infecções piogênicas (de pele).
 Estas infecções podem se localizar na pele ou em
regiões mais profundas. Quando na pele recebem
diferentes designações, tais como foliculite,
furunculose, carbúnculo e impetigo, de acordo com a
localização e outras características.
 Em indivíduos debilitados por doenças crônicas,
traumas físicos, queimaduras ou imunossupressão,
esse microrganismo pode causar infecções de caráter
mais grave. Entre as infecções profundas destacam-se
a osteomielite, a bacteremia.
Staphylococcus aureus –
Características Principais
Diagnóstico Laboratorial
➢ O diagnóstico das infecções estafilocócicas é feito pelo
isolamento e caracterização.
➢ O isolamento é realizado nos meios de culturas comuns,
como por exemplo, o ágar sangue e por meios seletivos,
como o ágar manitol salgado.
➢ A caracterização pode ser feita através de testes
bioquímicos como o da catalase e coagulase entre outros.
➢ O diagnóstico da intoxicação alimentar é realizado pela
pesquisa das enterotoxinas nos alimentos ingeridos e no
vômito do paciente, sendo encontrado em grande
quantidade (10 bacterias/g) no alimento que contém as
enterotoxinas responsáveis pelas manifestações clínicas.
Provas de Identificação
• Coagulase positiva: formação de coágulo, identifica Staphylococcus 
aureus.
• Coagulase negativa: não há coágulo, identifica outras espécies 
de Staphylococcus.
Provas de Identificação
•Crescimento em 
ágar de manitol
• Manitol positivo: 
formação de 
halo amarelo.
• Manitol negativo: 
não há 
formação de 
halo, meio 
incolor.
Provas de Identificação
 Prova da coagulase: esse 
teste verifica se o 
microrganismo expressa a 
enzima coagulase.
 Prova da DNAse: esse 
teste verifica se a bactéria 
tem a capacidade de 
degradar DNA.
 Teste de resistência à 
novobiocina: esse teste é 
realizado para diferenciar as 
espécies S. epidermidis e S. 
saprophyticus. A espécie S. 
saprophyticus é resistente a 
novobiocina, enquanto o S. 
epidermidis sensível.
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Epidemiologia
 A transmissão do S. aureus ocorre por
contato direto e por contato indireto.
 As infecções estafilocócicas superficiais,
podem ser consideradas graves se
acometerem recém-nascidos, pacientes
cirúrgicos e portadores de doenças
debilitantes como o câncer e a diabete.
 Esta é uma das razões pelas quais as
infecções estafilocócicas severas são mais
freqüentemente adquiridas em hospitais.
Outros Estafilococos:
 Staphylococcus epidermidis – habitante
normal da pele e mucosas, sendo
considerado a espécie de estafilococos
coagulase negativos de maior prevalência e
persistência na pele humana, podendo
causar infecções de pele.
 Staphylococcus saprophyticus –Vários
estudos mostram que esse estafilococo
pode ser um patógeno oportunista em
infecções do trato urinário, especialmente
em mulheres jovens, sexualmente ativas.
Caso Clínico
Paciente com 78 anos em REG é admitido em um Serviço de 
Emergência com história de tosse e febre há 3 dias. 
Tinha aumento de PCR e hemograma compatível com 
infecção bacteriana. 
Corroborando com o exame físico, a CT de torax evidenciou 
compatível com quadro de pneumonia. 
Foi introduzido ceftriaxone.
Devido a não evolução favorável, paciente foi submetido a 
broncoscopia com coleta de lavado broncoalveolar. 
Na cultura do LBA houve crescimento de cocos Gram 
positivosagrupados em cacho cujo teste da coagulase era 
positivo.
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