Detecção de Proteínas e Enzimas

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Detecção de proteínas 
Proteínas são heteropolímeros de aminoácidos unidos por 
ligações peptídicas 
 
 
 
 
A detecção e quantificação de uma proteína através de 
espectrofotometria se baseia nas propriedades de absorção 
de luz: 1) da ligação peptídica; 2) de grupos presentes nas 
cadeias laterais dos aminoácidos que a constituem; 3) de 
produtos coloridos resultantes de reações entre a proteína e 
compostos químicos específicos. 
Referência: Zaia et al., 1998. Química Nova 21(6), 787 - 793 
Método “princípio” interferentes observação 
Biureto 
Complexo entre Cu+2 e ligação 
peptídica absorve em 540nm 
Sulfato de amônio, lipídeos, amido, 
lactose, aminoácidos livres (His, Ser, 
Thr) 
Baixa sensibilidade (mg) 
Bradford 
Complexo entre o corante 
Comassie Blue G-250 e cadeias 
laterais de Lys, Arg, Tyr, e Trp 
absorve em 595 nm 
Uréia (> 45g/L), detergentes (Triton 
X-100 e SDS) e lipídeos 
“Boa” sensibilidade (µg) 
Rápida execução (min) 
Absorbância UV 
Cadeias laterais de Trp, Phe e Tyr 
aborvem em 280nm 
Aminoácidos livres (Trp, Phe e Tyr) 
“Boa” sensibilidade (µg) 
Rápida execução (min) 
É preciso conhecer a composição de aminoácidos da proteína para calcular ε 
(coeficiente de extinção molar) 
Ideal para proteínas purificadas 
Comassie Blue G-250 
Complexo Cu+2-ligação peptídica 
Estratégia para dosagem de proteínas no lisado das 
células de levedura 
Proteínas + 
Corante (CBG) Complexo Colorido 
Como correlacionar a “cor formada” com a 
quantidade de proteína presente? 
log I/I0 = -α c l 
 
log I/I0 = - absorbância 
 
absorbância = α c l absorbância = cte. c 
 y = inclinação . c 
Abs. 
concentração 
massas 
mols 
Abs. 
concentração 
massas 
mols 
Experimentalmente 
Abs. 
concentração 
massas 
mols 
Experimentalmente 
Abs. 
concentração 
massas 
mols 
Equação da reta (y = ax + b; neste caso Abs = inc. massa +b) 
Limites inferior e superior de absorbância – possibilidade de 
“fuga” da linearidade 
Curva padrão para dosagem de proteínas com 
Reagente de Bradford (Comassie Blue G) 
Diferentes massas de proteína 
 
Corante 
 
Absorbância (595 nm) 
Abs 595nm 
massa de proteína (mg) 
Tabela 1 
tubos albumina 0,2 g/L (µL) 
água 
(µL) 
reagente de 
Bradford (mL) 
branco 0 100 1,0 
1 10 90 1,0 
2 20 80 1,0 
3 30 70 1,0 
4 40 60 1,0 
5 50 50 1,0 
6 60 40 1,0 
7 70 30 1,0 
8 80 20 1,0 
 
tubos A595 
A1 
A2 
A3 
A4 
 
Tabela 3 
tubos L100X (µL) 
H2O 
(µL) 
reagente de 
Bradford (mL) 
branco - 100 1,0 
A1 100 - 1,0 
A2 50 50 1,0 
A3 30 70 1,0 
A4 20 80 1,0 
[proteína] (mg/mL) 
Enzimas são catalisadores biológicos. 
-especificidade em relação aos produtos e reagentes 
 
 
E + S E + P 
 
A presença de uma enzima específica pode ser 
detectada através da ocorrência da reação (formação 
do produto) 
k 
E + S E + P 
k 
Como quantificar a enzima? 
v = k [E] [S] 
Assim, a velocidade é diretamente proporcional a 
concentração de enzima e de substrato 
[P] 
tempo 
v = k [E] [S] v 
[P] 
tempo 
inclinação = v = ∆[P]/∆t v 
Qual v usar? 
v = k [E] [S] 
Assim, se [S] ~ constante (igual à inicial), a velocidade é 
diretamente proporcional a concentração de enzima 
[P] 
tempo 
Se menos de 10 % for 
consumido, podemos 
assumir v ~ constante. 
(v inicial; v0). 
Medida de velocidade inicial 
Se a velocidade inicial é constante, então para determiná-la é preciso construir 
uma curva de [P] x tempo e verificar se é linear. 
[P] 
tempo 
vários tempos 
A velocidade inicial (v0) é proporcional à 
concentração de enzima 
[P] 
tempo 
 - “esgotamento” do substrato 
 
- inativação da enzima 
v = k [E] [S] 
Medida de velocidade inicial 
 
[P] 
tempo 
vários tempos x 1 único tempo 
Medida de velocidade inicial 
 
[P] 
tempo 
vários tempos x 1 único tempo 
Medida de velocidade inicial 
 
[P] 
tempo 
vários tempos x 1 único tempo 
1 U de atividade = quantidade de E em uma 
reação com velocidade de formação de 
 1 µmol de Produto / min 
 
 
1 U = 1 µmol P / min 
[P] 
tempo 
O 
CH2OH 
O 
O 
CH2OH 
O 
CH2OH 
O 
CH2OH 
α-glicosidase 
ou maltase 
maltose 
H2O 
O 
CH2OH 
O NO2 
p-nitrofenil-α-glucosídeo 
maltose 
O 
CH2OH 
O 
O 
CH2OH 
O 
CH2OH 
α-glicosidase 
pH 7,0 
p-nitrofenil α−glucosídeo 
+ 
NO2 HO 
O NO2 
O 
CH2OH 
O 
CH2OH 
α-glicosidase 
pH 7,0 
p-nitrofenil α−glucosídeo 
+ 
NO2 HO 
H+ + -O 
(p-nitrofenolato; amarelo) 
O NO2 
O 
CH2OH 
pH 11,0 
Preparar este conjunto de tubos para as três diluições do lisado 
(10x, 50x e 500x) 
controle 
controle 
controle 
controle 
1 U = 1 µmol P / min 
[P] 
tempo 
Concentração de atividade enzimática  U/mL 
 
 
Concentração de proteína total  mg/mL 
 
 
Atividade específica  U/mg 
	Número do slide 1
	Número do slide 2
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