Aula 9 - Determinação de proteinas - Método Kjeldahl - Turma A

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PROTEÍNAS
INTRODUÇÃO
As proteínas são moléculas complexas constituídas por aminoácidos unidos entre si através da chamada ligação peptídica.
As proteínas estão presentes em vários alimentos importantes da dieta humana, como pães, massas.
	Alimento	Proteína total (%)
	Pão branco	8,4
	Arroz	2,6
	Massa	3,6
	Ovo	12,5
	Carne	20,3
	Lentilha	24,3
	Chocolate puro	4,7
	Batata frita 	5,6
INTRODUÇÃO
Os aminoácidos são ácidos carboxílicos que possuem um grupo amino ligado ao carbono alfa à carbonila. 
INTRODUÇÃO
Ainda, a este mesmo carbono está ligada também uma cadeia R, que pode ser desde um hidrogênio (H) no aminoácido mais simples (glicina), cadeias alquílicas de vários tamanhos contendo ou não grupos funcionais específicos (álcoois, ácidos, amino), até estruturas cíclicas como o anel aromático (fenilalanina). 
Devido à variedade de cadeias R disponíveis, existem, no total, 20 aminoácidos. Além dos dois já citados, também compõem as proteínas os seguintes aminoácidos: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, tirosina, triptofano, lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, serina, treonina, cisteína, metionina, asparagina e glutamina.
AMINOÁCIDOS ESSENCIAIS
Ainda que nosso organismo seja composto por cerca de 250 mil proteínas diferentes, estas são formadas por apenas 20 aminoácidos - e nosso corpo é capaz de fabricar só 11 deles.
Os outros nove - histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano e valina - são os chamados aminoácidos essenciais. Como não podem ser sintetizados pelo corpo humano, temos de consegui-los por meio dos alimentos.
Estes por sua vez podem ser obtidos tanto por alimentos de origem animal ou vegetal.
ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS
Quando dois aminoácidos se ligam, dizemos que se forma um dipeptídio; se forem três ligados, é um tripeptídio; vários aminoácidos ligados são polipeptídios.
Estes polipeptídios podem ser formados por inúmeras combinações de aminoácidos. A principal diferença entre uma proteína e outra está justamente na sequência de aminoácidos que apresentam. Esta sequência, exclusiva de cada proteína, é chamada de estrutura primária.
A estrutura primária é a principal responsável pelas características da proteína, uma vez que a forma espacial das proteínas depende dessa sequência. A alteração de apenas um aminoácido pode alterar todas as propriedades da proteína. 
A proteína adquire uma estrutura tridimensional ao se dobrar sobre si mesma. Para isso, a molécula se enrola sobre si mesma e faz ligações de ponte de hidrogênio, formando uma espécie de hélice. Este enrolamento da cadeia polipeptídica é chamado de estrutura secundária.
ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS
Na maior parte das proteínas, essa hélice se enrola mais uma vez, dobrando-se várias vezes sobre si mesma. Com esse novo dobramento, a molécula adquire uma estrutura terciária. 
Algumas proteínas podem ainda serem formadas pela associação de várias cadeias polipeptídicas enoveladas, esta estrutura é classificada como estrutura quaternária.
A LIGAÇÃO PEPTIDICA
Os aminoácidos unem-se através da ligação peptídica entre o grupo carbonila do primeiro aminoácido e o grupo amino do segundo aminoácido para formar a proteína. 
O número total de aminoácidos nas proteínas pode variar de algumas dezenas até vários milhares.
Além dos aminoácidos, as proteínas podem ser também formadas por outros componentes, como minerais (ferro, cobre, fósforo e outros) e grupos químicos específicos.
DESNATURAÇÃO DE UMA PROTEÍNA
A estrutura espacial de uma proteína é mantida por vários tipos de ligações, em especial as pontes de hidrogênio. O calor, variações de pH e algumas substâncias químicas podem romper estas ligações e desestruturar as proteínas. Assim, elas perdem suas propriedades características.
Quando isto ocorre, dizemos que ocorreu uma desnaturação. Um exemplo de desnaturação que realizamos comumente é o alisamento de cabelos com calor – a famosa “chapinha”. O calor quebra as ligações, desnaturando os fios e alisando o cabelo. Desnaturações leves como esta podem ser revertidas, fazendo com que a proteína volte às suas características originais.
PROPRIEDADES FUNCIONAIS DAS PROTEÍNAS
As propriedades funcionais das proteínas podem influenciar drasticamente as características sensoriais dos alimentos e nas propriedades dos demais componentes do alimento.
As características das proteínas como tamanho, composição de aa, conformação e outras determinam as propriedades funcionais manifestadas pelas proteínas que vão também depender do meio em que estão dispostas, por parâmetros como pH, temperatura e da presença de outros componentes no alimento como sais e açúcares, que também influenciarão a característica funcional final das proteínas.
Isto posto, as principais propriedades funcionais das proteínas nos alimentos são: hidratação, solubilidade, viscosidade, geleificação, formação de massas (gluten), propriedade emulsificante e propriedade espumante
MÉTODO DE KJELDAHL
A determinação de proteínas baseia-se na determinação de nitrogênio total, geralmente feita pelo processo de digestão Kjeldahl. 
Este método, idealizado em 1883, tem sofrido numerosas modificações e adaptações, porém sempre se baseia em três etapas: digestão, destilação e titulação. 
A matéria orgânica é decomposta e o nitrogênio existente e finalmente transformado em amônia. 
Sendo o conteúdo de nitrogênio das diferentes proteínas aproximadamente 16%, introduz-se o fator empírico 6,25 para transformar o número de g de nitrogênio encontrado em numero de g de proteínas. Em alguns casos, emprega-se um fator diferenciado de 6,25.
MÉTODO DE KJELDAHL
Amostras contendo nitratos podem perde-los durante a digestão. Nestes casos, deve-se adicionar ácido salicílico ou fenol (cerca de 1 g), os quais retém os nitratos, como nitroderivados. Procede-se então a digestão.
DIGESTÃO
A matéria orgânica existente na amostra é decomposta com ácido sulfúrico e um catalisador, onde o nitrogênio é transformado em sal amoniacal.
DESTILAÇÃO
A amônia é liberada do sal amoniacal pela reação com hidróxido e recebida numa solução ácida de volume e concentração conhecidos.
TITULAÇÃO
Determina-se a quantidade de nitrogênio presente na amostra titulando-se o excesso do ácido utilizado na destilação com hidróxido.
MATERIAIS E MÉTODOS
EQUIPAMENTOS:
Balança analítica;
Frasco de Kjeldahl de 500 a 800 mL;
Chapa elétrica ou manta aquecedora;
Balão de destilação, 
frasco Erlenmeyer de 500 mL, 
buretas de 25 mL, espátula, 
papel de seda, 
pipeta graduada de 25 mL ou pipetador automático.
REAGENTES:
Ácido clorídrico 0,1 M
Ácido bórico 0,033 M
Solução de fenolftaleína
Vermelho de metila a 1% m/v
Hidróxido de sódio a 30% m/v
Mistura catalítica (TiO2, CuSO4 e K2SO4, na proporção 0,3:0,3:6)
Solução ácido sulfúrico conc.
MATERIAIS E MÉTODOS
Pese 1 g da amostra em papel de seda. Transfira para o balão de Kjeldahl (papel + amostra). 
Adicione 25 mL de ácido sulfúrico e cerca de 6 g da mistura catalítica. 
Leve ao aquecimento em chapa elétrica, na capela, até a solução se tornar azul-esverdeada e livre de material não digerido (pontos pretos). Aqueça por mais uma hora. Deixe esfriar.
Caso o laboratório não disponha de sistema automático de destilação, transfira quantitativamente o material do balão para o frasco de destilação. 
Adicione 10 gotas do indicador fenolftaleína e 1 g de zinco em pó (para ajudar a clivagem das moléculas grandes de proteínas).
Ligue imediatamente o balão ao conjunto de destilação. Mergulhe a extremidade afilada do refrigerante em 25 mL de ácido bórico 0,033M, contido em frasco Erlenmeyer de 500 mL com 3 gotas do indicador vermelho de metila. 
MATERIAIS E MÉTODOS
Adicione ao frasco que contém a amostra digerida, por meio de um funil com torneira, solução de hidróxido de sódio a 30% até garantir um ligeiro excesso de base. Aqueça à ebulição e destile até obter cerca de (250-300) mL do destilado. 
Titule diretamente a solução de hidróxido de amônio com a solução de acido clorídrico 0,1 M, usandovermelho de metila.
REAÇOES POR ETAPA DO MÉTODO
DIGESTÃO: 
DESTILAÇÃO:
TITULAÇÃO:
CÁLCULOS
Ou simplesmente: 
VANTAGENS X DESVANTAGENS
VANTAGENS
Preciso;
Oficial para proteínas;
Qualquer alimento.
DESVANTAGENS
Mede N orgânico total;
Demorado;
Reagentes corrosivos. 
EXEMPLO 
Uma amostra de feijão pré-cozida desidratada foi analisado para determinar o teor de proteínas (em duplicata) pelo Método Kjeldahl. Os seguintes dados foram obtidos estão na tabela abaixo. Determine o teor de proteínas nas amostras assumindo que a proteína do feijão possui em média 17,5% de nitrogênio. 
	PARÂMETRO	RESULTADO
	Umidade (%)	8,20
	Peso amostra 1 (g)	1,025
	Peso da amostra 2 (g) 	1,012
	Nomralidade do HCl (N)	0,1042
	Volume HCl (amostra 1 – mL)	21,0
	Volume HCl (amostra 2 – mL)	20,2
	Volume HCl (branco – mL)	0,2