Resumo de Biotecnologia Clonagem de DNA

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Resumo de Biotecnologia para a prova.
Aula 1: Clonagem de DNA( inserir dentro de uma célula um gene que não é dela).
Termos que serão utilizados na prova:
-Células transformante: Célula que recebeu um gene que não é dela.
-Proteína recombinante: Proteína que a célula transformante vai produzir após receber o gene.
Para produzirmos uma proteína de interesse temos que seguir alguns passos, sendo eles:
1°- A primeira coisa que precisamos fazer é isolar o gene de interesse, para isso fazemos uma PCR, ou podemos comprar o gene de interesse pronto, isso vai depender do tanto de dinheiro que você vai ter.
2°- Após isolado, o gene de interesse deve ser cortado, para fazer esse corte utilizamos enzimas de restrição ( são enzimas que reconhecem sequências específicas de DNA).
3°- Após ser cortado, esse gene precisa ser colocado em um plasmídeo ( que é um pedaço de material genético circular de bactérias, que vai replicar-se e se expressar juntamente com o gene de interesse), para unir o gene de interesse com o plasmídeo é utilizada a DNA ligase, que vai unir a cadeia principal do segmento de DNA cortado, com a cadeia principal de DNA do plasmídeo, colando ambos.
4°- Colocamos em um tubo de ensaio com uma solução as bactérias e os plasmídeos já com o gene de interesse; As bactérias vão absorver esse plasmídeo através de um choque ( esse choque pode ser elétrico, assim sendo chamado de eletroforação, que consiste em dar um choque rápido na célula fazendo com que ocorra a abertura de um poro da membrana fazendo com que o gene entre; E esse choque também pode ser térmico, assim sendo chamado de quimiotransformação, que consiste em deixar a bactéria 20S no gelo, depois colocá-la a 80°C por 20S e depois colocá- la no gelo novamente durante 20S, fazendo com que ocorra a abertura dos poros da membrana para a entrada do gene, a desvantagem desse tipo de transformação, é que precisamos de uma bactéria competente.)
-Bactéria competente: É mais sensível, é processada até perder a parede celular (é retirado todo o açúcar).
5°- Transferimos a nossa solução de clonagem com as bactérias que incorporaram o gene de interesse, e as bactérias que não incorporaram o gene para um meio de cultura onde todas as bactérias vão proliferar dando origem a várias colônias; Para selecionar as bactérias que incorporaram o plasmídeo a solução é: Quando inserirmos o gene de interesse no plasmídeo, inserimos também um gene de resistência para determinado antibiótico, assim, todas as bactérias que incorporaram o plasmídeo vão estar carregando em seu material genético o gene de nosso interesse e o gene de resistência ao antibiótico específico; Junto aos nutrintes no nosso meio de cultivo adicionamos o antibiótico ao qual as bactérias certas serão resistentes, logo apenas as batérias quem incorporaram o plasmídeo irão sobreviver.
->Enzimas de Restrição: São enzimas bacterianas, todas as bactérias possuem enzima de restrição, essas enzimas quando reconhecem sequências de DNA, elas cortam o DNA, então na hora que o bacteriófago insere o DNA dele dentro da bactéria as enzimas de restrição vão picotar o material genético do vírus, fazendo com que o vírus seja inativado; Todas as bactérias possuem enzimas de restrição diferentes.
As enzimas de restrição possuem dois tipos de cortes diferente:
> Corte cego: Quando ela corta reto (o corte cego pode fazer com que o DNA se encaixe de cabeça para baixo)
> Corte coesivo: Quando ela corta de forma desproporcional.(mais usado)
-Bacteriófago: Vírus que vai infectar a bactéria podendo ter dois ciclos deferentes:
> Ciclo Lítico: O vírus vai matar a bactéria.
>Ciclo Lisogênico: O vírus vai inserir o genoma dele dentro da bactéria e vai forçar ela a ficar produzindo partícula viral.
-Região Poli Inter: Região com várias enzimas de restrição dessa bactéria.
- Pgem-Teasy Vector: É um vetor que quando entra na bactéria ele não vai ser produzido, ou seja, quando você colocar seu gene de interesse nesse vetor, e colocar ele na bactéria, a bactéria não vai produzir esse gene, porque esse vetor ele não é um vetor de produção, ele é um vetor auto replicativo, então todas as vezes que essa bactéria se dividir, ela vai replicar esse vetor pra você, aumentando a quantidade de gene de interesse que você possui.
Pode fazer de 200 nanogramas virar pelo menos 1 miligrama.
Aula 2 : Vetores. ( Plasmídeo, bacteriófago, cromossomo artificial )
Os vetores não necessariamente são os plasmídeos, podem ser também fago ( que é um vírus que pode infectar uma bactéria ), pode ser também um cosmídeo ( que é um cromossomo artificial, tanto em células quanto em leveduras )
O vetor tem que ter qualidades como: replicação autonômica, marcador de seleção ( resistência microbiana ) e sítio único de clivagem.
>Vetores de clonagem bacteriano:
-Transfecção: Injeta o gene na célula por outras tecnologias (meios químicos ou físicos).
-Infecção: Injeta na célula DNA pelo vírus
Dependendo da quantidade de DNA que você coloca pode ser tóxico para a célula.
>Plasmídeo: São moléculas de DNA circular, dupla fita extracromossômico; Por eles a bactéria faz o processo de conjugação, que é quando elas passam resistência a antibióticos de uma para outra; Nas células tem função de fixação de nitrogênio em certas bactérias, resistência a metais pesados e radiação, desenvolvem tumores em plantas e produzem determinantes de virulência bacteriana.
Cada célula possui uma origem de replicação própria; Existem 2 tipo:
- Propagação: A bactéria não faz RNAm, ou seja não tem proteína.
- Expressão: A bactéria faz RNAm, ou seja tem proteína.
>Bacteriófago: Aguenta grande quantidade de DNA (tanto circular quanto linear), ele que faz o controle de população bacteriana.
Possui 2 ciclos: lítico e lisogênico.
-Lítico: Mata sua bactéria após se replicar
-Lisogênica: Integra no material genético da bactéria, e ela continua viva.
	Transfecção (Vantagens)
	Infecção (Vantagens)
	É de fácil construção
	Possui um agente viral(partícula viral especialista em infectar células)
	Custo barato, é seguro
	É seguro, pois o fago não infecta humanos
	Possui 2 tipos de transformação:
	Infecta qualquer bactéria, não precisa de bactéria competente
	1)Eletroforação: Precisa de um eletroforador que dá uma choque elétrico rápido na célula, fazendo com que ocorra a abertura de um poro da membrana, e o gene entra.
	Infecção (Desvantagens)
Você precisa construir ele, e você não tem controle da expressão dele (não sabe se vai entrar na fase lítica, ou lisogênica), perigo NB2.
	2) Quimiotransformação: Quando dá um choque térmico na célula, deixando a bactéria 20S no gelo, depois coloca a 80°C por 20S, e depois no gelo durante 20S, abrindo os poros da membrana, e o gene entra.
	
	Transfecção (Desvantagens)
	
	Precisa ter uma bactéria competente, pode ocorrer fácil lise celular.
	
>Bactéria competente: Quando você processa a bactéria até ela perder a parede celular (quando perde o açúcar), é uma célula mais sensível.
>Cromossomo artificial: São eletroforados dentro da célula, tem que ter ORIc (Origem de replicação), pode ser usado tanto em bactéria quanto em levedura. (não vai ser pedido na prova).
>Gene reporter: Gene reporter é um gene que é inserido conjuntamente com outros genes de interesse, sua atividade pode ser acompanhada mais facilmente, por exemplo, o gene da aquaporina produz uma proteína fluorescente verde, se esse gene é colocado junto com um outro gene A, se a célula apresentar um brilho esverdeado, então é quase certo que o gene A também estará presente; Então esse gene reporta a presença de outro gene, que é o de interesse.
O gene reporter desse plasmídeo é a Luciferina (proteínas que brilham, extraídos de vagalumes), se colocarmos em meio de cultura com luciferase a célula vai brilhar.
>Genes de resistência: cada célula possui um gene de resistência específico.
-Célula humana: utilizar metal pesado, radiação, tóxicos etc...
-Célula de bactéria: utilizar antibiótico.
-Célula de fungo: utilizar antifúngico.
-Célula vegetal: utilizar agrotóxico.
Teste de expressão:Podemos fazer testes bioquímicos (eletroforese, etc), sorológicos (ELISA).
>Operon Lac: A bactéria possui o OPERON LAC, que faz com que quando a bactéria se encontre com a lactose ela ative todos os genes que degradam a lactose, são 3 enzimas:
-B Galactosidase
-Permease
-Transcritase
>Gene lac z: É o gene que produz a B galactosidase.
>Iptg: É um meio de cultura, que nos mostra se deu certo o incerto, se a bactéria conseguir quebrar a lactose ela vai ficar branca, se ela não conseguir quebrar a lactose ela fica branca.