EXTRAÇÃO DE DNA PLASMÍDICO DE E.COLI

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UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ
Gabriely Lopes Moreira[footnoteRef:1] Natali Kepper[footnoteRef:2] [1: Estudante do 3º de Biomedicina na Universidade Tuiuti do Paraná. Email: Gabrielymoreira@hotmail.com] [2: Estudante do 3º de Biomedicina na Universidade Tuiuti do Paraná. Email: Natinutricao@hotmail.com] 
EXTRAÇÃO DE DNA PLASMÍDICO DE E.COLI
Curitiba
2018
Introdução
Na primeira aula pratica foi realizado a extração do DNA plasmidial de E.coli para isso foi utilizado um método químico por lise alcalina, sendo ele um método simples e que apresenta bons resultados quantitativos e qualitativos. Essa técnica é baseada na diferença entre desnaturação, o DNA plasmidial circular e o cromossômico de alto peso molecular. Após ocorrer a extração ocorre uma técnica chamada de eletroforese que é utilizada para visualizar os fragmentos de DNA. A eletroforese foi inicialmente proposta por Arne Teselius (1937) como técnica empregada para visualização de proteínas de acordo com as diferenças de comprimento dos fragmentos de aminoácidos e cargas elétricas. É utilizado para separar, identificar e isolar os fragmentos de DNA a partir da influência de um campo elétrico aplicado. géis de agarose ou poliacrilamida, que são atraídos para um polo negativo os positivo. Como o DNA possui uma carga negativo ele ira para o polo positivo. Nessa aula pratica utilizamos o gel agarose que é um polissacarídeo que forma uma rede para segurar as moléculas durante a migração e é utilizado na forma de gel para a eletroforese.
Objetivo
O objetivo das duas aulas praticas é a extração do DNA plasmidio da bactéria Escherichia coli e compreender a utilização de tal técnica. Além de realizar, em gel de agarose, eletroforese dos DNA’s extraídos.
Materiais
Tubos de microcentrífuga;
 Pipetas;
 Tips;
 Tubo de descarte;
 Microcentrífuga;
 Fonte de eletroforese;
 Banho Maria;
 Banho de gelo;
 Cuba de eletroforese
 Reagentes
Métodos
1. Introduzir 2 mL de meio LB com uma colônia da E.coli. Imcubar a 37ºC com forte agitação durante a noite.
2. Centrifugar 1,5ml da cultura de bactéria em microtubos a 12.000g por 30 seg a 4ºC numa microcentrifuga. 
3. Remover o sobrenadante por aspiração, deixando o sedimento o mais seco possível.
4. Ressuspender o sedimento em 100 µL de solução I (50mM glicose; 25mM Tris.HCl ; 10mM EDTA) a 4ºC. Agite bem com auxilio de um Vortex. 
5. Adicionar 200 µL de solução II (0,2M NaOH; 1% SDS). Misturar por inversão rápida d microtubo 5 vezes, assegurando-se de que toda a superfície interna do mcrotubo tenha entrado em contato com essa solução. Depois coloque o microtubo em gelo.
6. Adicionar 150 µL de solução III(5M acetato de potássio; ácido acético gracial). Misturar mantendo o microtubo invertido e agitando lentamente com movimentos circulares durante 10 seg.
7. Centrifugar a 12000 g durante 5 min a 4ºC num microcentrifuga. Depois, transferir o sobrenadante para um novo microtubo.
8. Colocar 2 volumes de etanol absoluto á temperatura ambiente no DNA. Misture no Vortex e incubar durante 2 min.
9. Centrifugar a 12000 g durante 5 min a 4ºC num microcentrifuga.
10. Aspirar lentamente o sobrenadante. Colocar o tubo em posição invertida sobre o papel absorvente. Removendo as gotas de sobrenadanteno microtubo.
11. Lavar o sedimento de DNA com 1 mL de etanol 70% a 4ºC. Repita esse passo.
12. Deixar o sedimento secar ao ar por 10 min.
13. Dissolver o DNA em 50 µL de tampão TE que contem RNAase a 20 µg/ml, misturando rapidamente no vortex.
14. Armazenar o DNA a 4ºC.
15. O gel de agarose foi preparado previamente. A voltagem aplicada foi de 100V e prosseguiu a corrida até que os corantes tenham migrado uma distância de aproximadamente 10cm no gel, sendo ,posteriormente, examinado por luz ultravioleta.
RESULTADO
Observou os resultado obtido na corrida eletroforética de DNA plasmidial extraídas pelo método de lise alcalina. Na parte superior (pólo negativo), nota-se a presença de bandas de DNA plasmidial enquanto na parte inferior (pólo positivo), a presença de RNA. O resultado obtido nos grupos, de modo geral, foi semelhante, exceto para os estudantes de biomedicina onde ocorreu um erro durante a extração do DNA. 
Referencias 
SANTOS, Francisco S. ELETROFORESE: UMA IMPORTANTE FERRAMENTA DA GENÉTICA. Disponível em: http://docs.wixstatic.com/ugd/b703be_3b26d805c6f24796803b53b94892488b.pdf.Acessado em 13 de junho de 2018.
TEXEIRA, A. B. Manual da aula prática de eletroforese para DNA.<https://www.passeidireto.com/arquivo/2148954/eletroforese_manual> Acessado em 13 d junho de 2018.
XAVIER, César S., DANIELLE, Pereira C. Desenvolvimento de um kit didático de eletroforese para o ensino prático de Biologia Molecular na educação básica e superior, Disponível em: http://www.bioquimica.org.br/revista/ojs/index.php/REB/article/view/700. Acesso em: 15 de junho de 2018.