Teìcnicas Instrumentais

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Profa.	Me.	Mariane	Machado	Curbete	
CRF-SP:	80.013	
mariane.curbete@docente.unip.br
TÉCNICAS INSTRUMENTAIS 
APLICADAS EM ANÁLISES DE 
MEDICAMENTOS E COSMÉTICOS 
 
Karl	Fischer	
Processo	de	determinação	de	umidade	baseado	
em	reações	que	ocorrem	na	presença	de	água		
❖ Titulação	de	um	amostra	diluída	tipicamente	em	metanol,	com	
o	RKF:	Mistura	de	iodo,	dióxido	de	enxofre	e	uma	amina	
																			Na	presença	de	água	ocorre	uma	reação	onde	o	iodo	é	
reduzido	 pelo	 dióxido	 de	 enxofre	 >>	 Reação	 complexa	 e	 não	
estequiométrica:	
	 				
	 													I2	+	SO2	+	2	H2O		→	2	HI	+	H2SO4	
❖ Baseia	numa	titulação	visual	
❖ Uma	molécula	de	I2	desaparece	para	cada	molécula	de	H2O	
❖ Quando	toda	H2O	da	amostra	for	consumida,	a	reação	cessa		
❖ Volume	 de	 RKF	 gasto	 na	 titulação	 da	 amostra	 é	 então	
utilizado	nos	cálculos	do	teor	de	umidade	
❖ Ponto	final	da	titulação	pode	ser	detectado	visualmente	pela	
mudança	de	cor	
❖ Pode	 ser	 realizada	 com	 tituladores	 automáticos	 que	
monitorizam	a	titulação	com	recurso	a	eléctrodos	de	platina	
✓ Excesso	de	H2O	em	MP	possibilita	a	ação	enzimática	
▪ Fungos	e	bactérias	
▪ Ocasionar	erros	de	pesagem	à Diminuição	do	teor	
do	ativo	
Índice	de	umidade	é	indicativo	das		
condições	de	armazenamento	e	conservação	
	CONFIABILIDADE	PA	
✓ Determinação	 FB:	 Método	 gravimétrico	 (estufa),	
destilação	azeotrópica	(MP	com	componentes	voláteis)	e	
volumétrico	(Karl	Fischer)	
CROMATOGRAFIA
Técnica	 sistematizada	 no	 início	 do	
século	 XX	 à Separação	 de	
pigmentos	 coloridos	 presentes	 no	
extrato	de	folhas
Passagem	de	éter	de	petróleo	
através	de	uma	coluna	de	
vidro	preenchida	com	
carbonato	de	cálcio,	à	qual	foi	
adicionado	o	extrato,	levou	à	
separação	dos	componentes	
em	faixas	coloridas
Botânico	russo	Mikhail	S.	Tswett
chrom	
(cor)
graphie	
(escrita)
Processo	NÃO	
dependa	da	cor
Método FQ de separação à Migração 
diferencial dos componentes de uma mistura, 
que ocorre devido a ≠ interações entre um 
sistema heterogêneo bifásico:	
1 - FASE ESTACIONÁRIA (FE)	
2 - FASE MÓVEL (FM)
Método	tem	sido	aplicado	na	separação,	
identificação	e	quantificação	de	≠	espécies	
químicas,	bem	como	para	purificação	de	
compostos,	por	meio	da	separação	de	substâncias	
indesejáveis	
Critérios	usados	para	a	CLASSIFICAÇÃO	das	≠	modalidades	
de	cromatografia	
✓Classificação	pela	forma	física	do	sistema	cromatográfico	
✓Classificação	pela	FM	empregada	
✓Classificação	pela	FE	utilizada	
✓Classificação	pelo	modo	de	separação
classificação	das	técnicas	cromatográficas.
CROMATOGRAFIA	EM	CAMADA	DELGADA	(CCD/TLC)
Separação	dos	componentes	de	uma	mistura	através	da	migração	
diferencial	 sobre	 uma	 camada	 delgada	 de	 adsorvente	 retida	
sobre	uma	superfície	plana	(analítica	ou	preparativa)
Processo	 de	 separação	 à Adsorção.	 Porém,	 ao	 utilizar	 FE	
tratadas	 pode	 ocorrer	 também	 separação	 por	partição	 ou	 troca	
iônica,	 o	 que	 permite	 seu	 emprego	 tanto	 na	 separação	 de	
substâncias	hidrofóbicas	como	hidrófilas
Mercado	dispõe	de	uma	grande	variedade	de	adsorventes:	sílica	
gel,	alumina,	terra	diatomácea,	celulose	e	poliamida	
1.	Preparo	das	placas*	e	
soluções 2.	Ativação	das	placas 
(105-110oC,	30-60	min)
3.	Aplicação	da	amostra 
capilares,	microseringas
4.	Saturação	da	Cuba ❖ Câmara	 UV:	 Substâncias	 com	 cromóforos	
à Absorvem	 radiação	 e	 tornam-se	
fluorescentes.	
❖ Vapores	de	iodo:	Universal	
❖ Métodos	 químicos:	 Solução	 é	 borrifada	
com	 ar	 comprimido,	 após	 aquecimento	
ocorre	 a	 reação	 formando	 manchas	
coloridas	
❖ Métodos	 biológicos:	 Substância	 com	
atividade	 biológica	 (revelador	 é	 uma	
suspensão	de	fungos)
6.	Visualização	e	Revelação
ETAPAS	DA	CCD
*Placas	pré-fabricadas
5.	Desenvolvimento
Rf:	Fator	de	retenção	
ds:	 Distância	 percorrida	 pela	
substância	(amostra	ou	padrão)	
dfm:	 Distância	 	 percorrida	 pela	 FM	
desde	o	ponto	de	aplicação	(Ex:	10	
cm)
7.	Cálculo	do	Fator	de	Retenção	(Rf)
ETAPAS	DA	CCD
(a) AF	SQR;	(b)	Produto	acabado;	(c)	Placebo
Cromatoplacas	reveladas	em	luz	UV	a	254	nm	(I)	e	vapores	de	iodo	(II)	
FM:	hexano,	acetato	de	etila	e	ácido	acético	(60:30:10,	v/v/v)
Aplicações
▪ Estabelecer	se	dois	componentes	são	idênticos	
▪ Verificar	a	pureza	de	um	composto	
▪ Determinar	o	nº	de	componentes	de	uma	mistura	
▪ Identificar	frações	coletadas	em	cromatografia	líquida	clássica		
▪ Acompanhamento	de	reações	orgânicas
Vantagens:	
✓Método	visual	de	fácil	compreensão	e	execução	
✓Separação	em	breve	espaço	de	tempo	
✓Alta	reprodutibilidade	e	versatilidade	
✓Custo	acessível		
✓Baixo	consumo	de	solventes		
✓Volume	reduzido	de	resíduos	gerados	ao	meio	ambiente	
CROMATOGRAFIA	LÍQUIDA	DE	ALTA	EFICIÊNCIA	(CLAE/
HPLC)
Método	analítico	de	alto	custo	à Técnica	de	escolha	e	ocupa	
lugar	de	destaque	entre	os	métodos	modernos	de	análise
Análises	são	normalmente	 realizadas	numa	escala	de	 tempo	de	
poucos	minutos,	com	alta	resolução,	eficiência	e	sensibilidade	
Facilidade	em	efetuar	a	separação,	identificação	e	quantificação	
das	substâncias	químicas	e	de	seus	produtos	de	degradação
COMPONENTES	CROMATÓGRAFO
válvula	de	seis	pórticos
Não	podem	promover	a	destruição	
do	soluto,	devem	ter	alta	
sensibilidade	e	reprodutibilidade,	
baixo	limite	de	detecção	e	de	ruído,	
resposta	rápida	e	linear	as	alterações	
de	[solutos],	mudanças	na	FM	e	na	
temperatura
COMPONENTES	CROMATÓGRAFO
Desgaseificador Forno	de	coluna
O
O
2
1
4
SNYDER;	KIRKLAND;	GLAJCH,	1997.
TIPOS	DE	FE	(COLUNA)
Tipo Diâmetro	interno	(mm)
Comprimento	
(mm)
Tamanho	da	
partícula	(µm)
Analítica 1	-	4,6 30	-	250 1,5	-	10
Semi-preparativa 8	-	10 100	-	250 5	-	200
Preparativa 20	-	50 100	-250 50	-	200
Caracterização	das	partículas	
(totalmente	porosas,	peliculares,	
superficialmente	porosas,	perfusão): 
▪ Tipo 
▪ Dimensões	físicas	(diâmetro) 
▪ Natureza	e	tamanho	dos	poros 
▪ Área	superficial
Colunas	usuais:	 
▪ Comprimento	–	30	a	300	mm 
▪ Partícula	–	1,5	a	5	μm
SÍLICA	DE	FASE	LIGADA	-	C18,	C8,	fenil,	difenil,	etc
❖ FE apolar: FM formada por solventes de média alta polaridade 
❖ Solventes: Água (solvente base), metanol, acetonitrila, etanol, 
isopropanol, tetrahidrofurano, entre outros
CLAE	-	FASE	REVERSA
octadecilsilano
Sílica	de	Fase	Ligada:	CN,	NH2,	etc
Sílica	
(grupo	silanol	+	OH)
❖ FE	polar:	FM	formada	por	solventes	de	baixa	a	média	polaridade	
❖ Solventes:		Hexano	(solvente	base),	acetato	de	etila,	CHCl3,	CH2Cl2,	éter	
etílico,	isopropanol,	entre	outros
CLAE	-	FASE		NORMAL
Pode	ser	utilizada	tanto	para	fins	Qualitativos:	
▪ Identificação	à Comparação	de	 tempos	de	retenção	 (tR)	de	
analitos	e	padrões,	ou	técnicas	hifenadas
Quantificação	 do(s)	 analito(s)	 de	 interesse	 presentes	 em	
produtos	acabados	e/ou	em	matérias-	primas:		
▪ Curva	analítica	à Áreas	dos	picos	x	Concentração
Ár
ea
	(x
10
4)
0
50
100
150
200
Concentração	(μg/mL)
0 25 50 75 100
Detector	DAD	
❖ Composto	por	uma	série	de	fotodiodos	que	são	posicionados	lado	a	lado	
num	cristal	de	silício	de	modo	que	cada	λ	difratado	pela	grade	atinja	um	
diodo	
❖ Abs	 de	 uma	 amostra	 pode	 ser	 determinada	 em	 todos	 os	 λ	 de	 modo	
simultâneo,	por	meio	de	varredura	
❖ Softwares	permitem	determinar	a	PUREZA	do	pico	cromatográfico	:	
❖ Comparação	 dos	 espectros	 na	 região	 do	 UV	 obtidos	 em	
diferentes	pontos	do	pico	
❖ Construção	de	uma	curva	de	pureza	
❖ Cálculo	em	que	relaciona	a	razão	da	abs	em	cada	ponto	do	pico	
>>	 Região	 em	 que	 a	 curva	 de	 pureza	 se	 desloca	 para	 valores	
abaixo	de	zero	indica	a	presença	de	impurezas
Pureza	do	pico	cromatográfico	-	DAD	
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min
-25
0
25
50
75
mAU
7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 min
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
25.0
50.0
75.0
mAU
Peak
Zero Line
Purity Curve
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 nm
0
25
50
75
100
125
mAU
Método	de	extração	
ADEQUADO
CONFORMIDADE DO SISTEMA CROMATOGRÁFICO
▪ Assimetria ou fator de encaudamento (As ouT): É a medida da 
proporção entre as duas partes de um pico cromatográfico no sentido 
longitudinal
CONFORMIDADE DO SISTEMA CROMATOGRÁFICO
As	 2	
▪ Fator de retenção ou de capacidade (k): É a medida da posição do 
pico de interesse relativo ao composto não retido, ou seja, é a razão 
de distribuição do analito entre FE e a FM à AFINIDADE FE
	tM	=	 Vol	M	=	0,65.	∏.	r2	.	L
coluna	analítica	Zorbax	Eclipse	XDB	C18	
Agilent®	(4,6	x	250	mm,	5	µm)	
CONFORMIDADE DO SISTEMA CROMATOGRÁFICO
A migração um analito pela coluna provoca o alargamento da banda 



TR ideal: Alargamento e otimização
tempo
Fator de retenção 
K	 2	
▪ Número de pratos (N): É definido como uma medida da eficiência 
da análise >> Consiste na relação entre o tempo de permanência do 
analito na coluna e alargamento do pico
1	min	–	1,1	cm	(??)	
					x					-		0,3	cm	(h/2)
CONFORMIDADE DO SISTEMA CROMATOGRÁFICO
N 2000	
▪ Resolução: É a medida da separação entre dois picos adjacentes
1	min	–	1,1	cm	(??)	
					x					-		0,6	cm	(largura	tang)
CONFORMIDADE DO SISTEMA CROMATOGRÁFICO
Análises quantitativas e qualitativas exigem resolução na linha de base (baseline resolution)
Rs	>	1,5-2,0
Rs Mínima
CROMATOGRAFIA	GASOSA
1. Reservatório	 de	 gás	 e	 controle	 de	
vazão/pressão	
2. Injetor	(vaporizador)		
3. Coluna	e	forno	da	coluna	
4. Detector	
5. E l e t r ô n i c a	 d e	 t r a t a m e n t o	
(amplificação)	de	sinal	
6. Registro	de	sinal
ESPECTOFOTOMETRIA
Método	de	análise	óptico	muito	utilizado	em	
investigações	biológicas	e	físico-químicas
Baseia-se	na	interação	da	substância	com	a	energia	
radiante,	resultando	na	absorção	ou	transmissão	
de	luz	pela	substância	química	analisada
Absorção	das	radiações	UV,	Vis	e	IV	depende	da	
estrutura	molecular	de	cada	substância	
Abs	de	luz	por	uma	molécula	é	o		
resultado	de	uma	transmissão	eletrônica	>>>	RESPOSTA
▪ Espectrofotómetro	mede	o	quanto	de	luz	foi	absorvida	pela	amostra 
▪ Intensidade	da	 luz	ANTES	de	passar	pela	amostra	 (luz	 incidente):	 I0	e		
DEPOIS	de	passar	pela	amostra	(luz	transmitida):	I 
▪ Transmitância	da	amostra	é	definida	pela	razão	(I/I0)	>>>	%T	
Abs	das	soluções	são	determinada	num	comprimento	de	

onda	(nm)	ou	pode	ser	feito	varredura
ESPECTOFOTOMETRIA	NO	UV
▪ (amostra	 tem	 que	 ser	 inserida	 no	 caminho	
óptico	do	aparelho)
PRÁTICA: 
▪ Comparação	 das	 abs	 das	 soluções	 da	 amostra	 com	 do	
padrão	em	um	determinado	comprimento	de	onda		
	
Ca	=	Concentração	da	amostra	(µg/mL)	
Cp	=	Concentração	do	padrão	(µg/mL)	
Aa	=	Absorbância	da	amostra	
Ap	=	Absorbância	do	padrão
Espectro	na	região	do	UV	do	AF	SQR		
em	álcool	etílico	(35	μg/mL)
Lâmbida	(λ)	max
“Abs é diretamente proporcional a 
concentração da solução de amostra”
Lei	de	Lambert	Beer	ou	Lei	de	Beer	ou		
Lei	de	Beer-Lambert-Bouguer	
ABSORÇÃO	DEPENDE:	
✓CONCENTRAÇÃO	(mol/L):	Quanto	maior	a	[amostra]	à Maior	a	
absorção	de	luz	
✓COMPRIMENTO	 DO	 CAMINHO	 ÓPTICO	 (cm):	 Quanto	 maior	 o	
caminho	percorrido	pelo	feixe	de	luz,	maior	a	absorção	da	luz	
✓CARACTERÍSTICA	DA	MOLÉCULA:	Épson	e	Lâmbida	
Batocrômico
Hipsocrômico
Hipercrômico
Hipocrômico
EFEITOS
DESLOCAMENTO
>		λ	
<		λ	
aumento	em	ε	
Diminuição	em	ε	
A	=	ε	x	C	x	l
A:	Absorbância	
ε:	Épson	
C:	Concentração	
l	ou	b:	Comprimento	da	cubeta
	
3,056mg/100mL	
b:	1	cm 
ε:?
PM:	504
A	=	ε	x	C	x	l
1,0mg/100mL	
b:	1	cm 
ε1;	ε2	:?
PM:	504
A	=	ε	x	C	x	l
❖ Parte	 do	 espectro	 eletromagnético	 que	 fica	 entre	 400	 e							
750	nm	
❖ As	ondas	de	luz	com	comprimento		
				entre	esses	limites	parecem	coloridas 
			quando	a	luz	branca	é	transmitida		
			através	dela	ou	é	refletida	a	partir	dela 
ESPECTOFOTOMETRIA	NO	IV
Comprimento	de	onda	
da	luz	absorvida	(nm)
Cor	da	luz		
absorvida
Cor		
observada
400 violeta amarelo
450 azul laranja
500 verde-azulado vermelho
530 verde-amarelado violeta-avermelhado
550 amarelo violeta
600 vermelho-alaranjado verde-azulado
700 vermelho verde
Relação	entre	a	cor	de	luz	absorvida	e	a		
cor	observada	do	composto	>>>	IV
A	cor	observada	é	conhecida	como	a		
cor	complementar	da	cor	absorvida
ABSORÇÃO	NA	REGIÃO	DO	IV
✓ Uma	 molécula	 possui	 uma	 frequência	 característica	 de	
vibração	das	ligações	
✓ A	 molécula	 absorve	 frequência	 (energia)	 selecionadas	 de	
radiação	IV	
✓ No	 processo	 é	 absorvido	 frequências	 que	 equivalem	 as	
frequências	vibracionais	das	moléculas,	aumentando	assim	a	
amplitude	dos	movimentos
Nº	de	Onda:		Proporcional	à	energia	de	vibração	
Axial:	Movimento	
rítmico	ao	longo	do	
eixo	da	ligação
Angular:	Variações	de	
ângulos	de	ligação
O	que	acontece	em	
2000	cm-1	ao	emitir	
radiação?	É	capaz	de	
emitir	resposta?
AS	BANDAS	ESTÃO	DIRETAMENTE	RELACIONADAS		
COM	OS	GRUPOS	FUNCIONAIS
Anéis	Benzênicos
1600	cm-1	
1580	cm-1	
1500	cm-1	
1450	cm-1
Álcoois	 3300	-	3200	cm-1
Aldeídos 2800	-	2700	cm
-1	
1725	cm-1
Nitrilas
2200	-	2300	cm-1
Espectroscopia	na	região	do	IV		
❖ Quantificação	de	substâncias	orgânicas	
❖ Controle	e	acompanhamento	de	reações		
❖ Determinação	da	pureza	
	
aztreonam
VANTAGENS:	
1. Baixo	tempo	nas	análise	
2. Não	destrói	a	amostra	
3. Fácil	manuseio	dos	instrumentos	
4. Baixo	custo	operacional		
5. Não	utiliza	solventes	orgânicos