AULA2_Microscopia e Métodos de estudo citológicos

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Citologia e Embriologia
Tyago Eufrásio 
Microscopia e Métodos 
de estudo citológicos
Tyago Eufrásio 
O microscópio: instrumento básico para o
estudo da célula
Hans e Zaccharias Janssen (1590): Aparelho
com duas lentes que chamaram de microscópio
Robert Hooke (1665): Analisa um pedaço de
cortiça. Dá o nome aos espaços de células
(pequenas celas)
Microscopia Óptica
Theodor Schwann (1839): Observa existência
de células nos animais e vegetais
A partir de então os microscópios ópticos se
modernizaram
Microscopia Óptica
Princípio da microscopia óptica: Utilizar um
conjunto de lentes para ampliar o espectro
luminoso originário da amostra, e assim ampliar
em numerosas (N) vezes o tamanho da
imagem formada.
Microscopia Óptica
Unidades de medida utilizadas em
microscopia
As dimensões das estruturas biológicas podem
agrupar-se em dois grandes grupos:
macroscópicas e microscópicas
Micrômetro (μm): para a microscopia óptica
Nanômetro (ηm) e o angstrom (Å): para a
microscopia eletrônica.
Microscopia Óptica
A sua relação com a unidade fundamental do
sistema métrico, o metro (m) e com o milímetro
(mm) é a seguinte:
1 μm = 10-3 mm (0,001 mm) = 10-6 m
1 ηm = 10-3 μm = 10-6 mm (0,000001 mm)= 10-9
m
1 Å = 10-1 ηm = 10-4 μm = 10-7 mm (0,0000001
mm) = 10-10 m
Microscopia Óptica
Microscopia Óptica
Microscopia Óptica
Partes constituintes do microscópio óptico
• Sistema óptico: compõe-se de três sistemas
de lentes (ocular, objetivas e condensador) e
uma fonte de luz.
• Sistema mecânico: constituído pela estrutura
que suporta os elementos do sistema óptico,
e inclui os elementos de focagem.
Microscopia Óptica
Microscopia Óptica
1. Oculares: local onde se observa a imagem. Pode
possuir uma (monocular) ou duas oculares
(binocular) e possuir ajuste de foco
para um dos olhos (botão de correção dióptrica).
2. Tubo ou canhão: suporta a ocular.
3. Braço: fornece suporte à platina e ao canhão,
fixado à base.
4. Revólver: fornece suporte às objetivas, girando
sobre um eixo fixo para alterar os aumentos da
ampliação.
Microscopia Óptica
5. Objetivas: conjunto de lentes que permitem a
ampliação da imagem. Microscópios ópticos comuns
geralmente possuem 4 ou 5 objetivas, mas a
quantidade e ampliação pode variar. As objetivas
secas geralmente possuem aumento de 4x, 10x, 40x
e 50x, assim chamadas, pois nessas não se usa óleo
de imersão para a observação. A lente que amplia
100x é chamada de objetiva de imersão, pois
necessita de óleo para aumentar seu poder de
resolução.
6. Platina ou mesa: local de suporte à lâmina.
Possui pinças para fixação e uma abertura central
por onde a luz irá passar.
Microscopia Óptica
7. Condensador com diafragma: sistema de lentes
convergentes que distribuem a luz de forma regular
para formação da imagem.
8. Fonte de luz: geralmente possui uma lâmpada,
que irá gerar a luz artificial. Pode possuir um controle
da quantidade de luz, geralmente localizado
lateralmente à base.
9. Charriot: parafusos que são usados para
movimentar a lâmina, movendo a imagem na ocular
no sentido vertical e horizontal.
Microscopia Óptica
10. Parafuso macrométrico: permite o ajuste do
foco rápido, movimentando rapidamente a platina na
direção vertical.
11. Parafuso micrométrico: permite um ajuste fino
do foco, movimentando verticalmente a platina de
maneira lenta.
12. Pé ou base: fornece suporte a todas as partes do
microscópio.
Microscopia Óptica
Microscopia Óptica
Microscopia Óptica
Microscopia Óptica
Finalizado a observação microscópica, desligar a
lâmpada, girar o revólver de forma a encaixar a
objetiva de 4x, baixar a platina, retirar a lâmina e
enxugar a objetiva de 100x com papel fino (NÃO
ESFREGAR A LENTE). Desligar o equipamento.
Microscopia Óptica
Relação entre aumento total e diâmetro do campo de
observação.
Microscopia de Contraste de Fase
A invenção do microscópio de contraste de fase
abriu novas possibilidades de investigação na área
de biologia celular ao permitir a visualização de
células vivas. Este microscópio óptico é bastante
semelhante ao microscópio óptico comum, sendo,
no entanto, dotado de um sistema óptico particular
(um anel de fase, localizado na objetiva, e um anel
circular, localizado no condensador) que amplia a
diferença de fase dos raios luminosos que
atravessam a célula.
Microscopia de Contraste de Fase
Microscopia de Campo escuro
A microscopia de campo escuro é um tipo de
microscopia óptica que se utiliza de técnicas de
iluminação para aumentar o contraste de células
não coradas, podendo, assim como a microscopia
de contraste de fase, ser utilizada para o estudo de
células vivas. A microscopia de campo escuro,
como o próprio nome sugere, produz uma imagem
de fundo bastante escura, quase negra,
destacando, assim, o material biológico, que se
apresenta de forma muito brilhante.
Microscopia de Campo escuro
A microscopia de campo escuro é um tipo de
microscopia óptica que se utiliza de técnicas de
iluminação para aumentar o contraste de células
não coradas, podendo, assim como a microscopia
de contraste de fase, ser utilizada para o estudo de
células vivas. A microscopia de campo escuro,
como o próprio nome sugere, produz uma imagem
de fundo bastante escura, quase negra,
destacando, assim, o material biológico, que se
apresenta de forma muito brilhante.
Microscopia de Campo escuro
Microscopia de Fluorescência
A microscopia de fluorescência foi uma grande
conquista da biologia celular, ampliando de forma
espetacular os estudos nessa área da ciência. A
microscopia de fluorescência, assim como as outras
microscopias ópticas, também utiliza a luz como
fonte de radiação, sendo mais comum a utilização
de lâmpadas de mercúrio e xenônio.
O microscópio de fluorescência utiliza filtros que
selecionam o comprimento de onda que irá excitar o
corante (filtro de excitação) e o comprimento de
onda que será visualizado pelo observador (filtro de
barreira). Uma vez que o fundo é escuro, a amostra
fluorescente é facilmente visualizada.
Microscopia de Fluorescência
Microscopia de Fluorescência
A microscopia confocal é a técnica de microscopia
óptica que mais tem contribuído para o
entendimento dos processos biológicos ao nível
celular. Uma vez que a microscopia confocal
também se baseia no uso de corantes vitais (que
não necessitam de fixadores ou agentes
permeabilizantes para atravessarem a
membrana plasmática), que permitem o estudo de
células vivas, diversos processos celulares antes
pouco compreendidos.
Microscopia Confocal
Microscopia Confocal
A microscopia eletrônica utiliza o feixe de elétrons
como radiação. A fonte de elétrons é um filamento
ou catodo que bombeia os elétrons através de uma
estrutura cilíndrica até a amostra. A grande
vantagem no uso do feixe de elétrons ao invés do
feixe de luz, utilizado na microscopia óptica, é o
reduzido comprimento de onda do feixe de elétrons
(0,004 nm). Este valor é cerca de 100 mil vezes
menor que o comprimento de onda da luz visível.
Devido ao menor comprimento de onda do feixe de
elétrons, o limite teórico de resolução do
microscópio eletrônico é de 0,002 nm (0,02 Å).
Microscopia Eletrônica
Microscopia Eletrônica
A microscopia eletrônica permite a visualização de
detalhes estruturais de organelas, tais como a
mitocôndria, das nucleoporinas do envelope
nuclear, dos ribossomos e de diversas outras
estruturas celulares e, até, mesmo, de vírus.
Existem três tipos de microscopia eletrônica: a
microscopia eletrônica de transmissão, a
microscopia eletrônica de varredura e a
microscopia eletrônica de tunelamento.
Técnica Citológica/Histológica
É um conjunto de operações empregado em um
material organizado (tecido biológico), com o
objetivo de possibilitar seu estudo por meio de
um microscópio, possibilitando a observação de
estruturas não visíveis ao olho nu.
Métodos de estudo das células e tecidos
Técnica Citológica/HistológicaPara a formação da imagem ao microscópio de
luz, o material biológico deve ser fino o
suficiente para a luz atravessá-lo. Podem ser
realizados esfregaços de sangue e sêmen, por
exemplo.
Métodos de estudo das células e tecidos
Técnica Citológica/Histológica
Esmagamento
Métodos de estudo das células e tecidos
Técnica Citológica/Histológica
Células obtidas por raspagem da mucosa oral ou
do colo uterino no exame de Papanicolau são
espalhadas na lâmina com a própria espátula da
coleta.
Métodos de estudo das células e tecidos
Técnica Citológica/Histológica
Para a obtenção de cortes histológicos, o
primeiro passo é fixar o material coletado
para evitar a autólise e preservar a morfologia e
a composição química do tecido. Fixadores
bastante usados são o formol (ou
paraformaldeído), o glutaraldeído e misturas
fixadoras, como o líquido de Bouin.
Métodos de estudo das células e tecidos
Técnica Citológica/Histológica
Uma técnica de coloração muito usada é a
hematoxilina e eosina (HE). A hematoxilina é
um corante azul-violeta, rico em cargas positivas
(corante catiônico), e a eosina é um corante
rosa, rico em cargas negativas (corante
aniônico).
Métodos de estudo das células e tecidos
Técnica Citológica/Histológica
O material biológico deve ser endurecido para
ser cortado, o que é conseguido incluindo-o
em uma substância que se solidifica depois de
penetrá-lo, como, por exemplo, a parafina.
Esse bloco é cortado em um aparelho especial,
o micrótomo, em fatias de 5 a 8µm de
espessura. Os cortes são dispostos em lâminas
de vidro.
Métodos de estudo das células e tecidos
Técnica Citológica/Histológica
Métodos de estudo das células e tecidos
Técnica Citológica/Histológica
Como os tecidos são geralmente incolores, os
histologistas inventaram soluções corantes que
têm afinidades diferentes para certas organelas
e estruturas, possibilitando a sua localização.
Para o material ser corado, a parafina deve ser
dissolvida, o que é obtido colocando a lâmina
em xilol, e o tecido precisa ser hidratado, já que
esses corantes são solúveis em água. A
hidratação é conseguida passando a lâmina em
uma série alcoólica decrescente e em água. A
lâmina é então mergulhada nos corantes.
Métodos de estudo das células e tecidos
Técnica Citológica/Histológica
Uma técnica de coloração muito usada é a
hematoxilina e eosina (HE). A hematoxilina é
um corante azul-violeta, rico em cargas positivas
(corante catiônico), e a eosina é um corante
rosa, rico em cargas negativas (corante
aniônico).
Métodos de estudo das células e tecidos
Técnica Citológica/Histológica
Métodos de estudo das células e tecidos
Técnica Citológica/Histológica
Na citoquímica ou histoquímica, técnicas de
coloração evidenciam componentes
específicos da célula.
A reação do ácido periódico - Schiff (PAS de
periodic acid - Schiff) é utilizada para corar
carboidratos, como o glicogênio e as
glicoproteínas.
Métodos de estudo das células e tecidos
Técnica Citológica/Histológica
Na citoquímica ou histoquímica, técnicas de
coloração evidenciam componentes
específicos da célula.
A reação do ácido periódico - Schiff (PAS de
periodic acid - Schiff) é utilizada para corar
carboidratos, como o glicogênio e as
glicoproteínas.
Métodos de estudo das células e tecidos
Técnica Citológica/Histológica
O método de Feulgen, específico para a
desoxirribose do DNA, cora de vermelho ou
magenta o núcleo (é o mesmo corante do PAS).
O azul de Alcian cora glicosaminoglicanos
(açúcares ricos em grupos sulfato e carboxila,
portanto, com cargas negativas).
O Sudan é utilizado para demonstrar lipídios na
célula.
Métodos de estudo das células e tecidos
Técnica Citológica/Histológica
Para uma maior durabilidade do preparado, ele é
desidratado em uma série alcoólica crescente e
em xilol, e uma lamínula é colada sobre a lâmina
com um meio de montagem, como o bálsamo-
do-Canadá sintético. Agora o material está
pronto para ser observado ao microscópio de
luz.
Métodos de estudo das células e tecidos
Exercícios
Exercícios
Exercícios