RELATÓRIO MÉTODO E PRÁTICA DA COLOROÇÃO DE GRAM

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CENTRO UNIVERSITÁRIO EUROAMERICANO – CAMPUS ASA SUL 
ODONTOLOGIA 
 
ALINE ALVES SOUSA 
ANNA CLARA DE OLIVEIRA SALES 
CAROLINA MELO GUEDES BRITO 
LUANA ALVES DE OLIVEIRA 
LUISA GABRIELLA MUNDIM 
MAYARA ANDRADE 
 
 
 
RELATÓRIO: MÉTODO E PRÁTICA DA COLORAÇÃO DE GRAM 
 
 
 
 
 
 
BRASÍLIA 
ABRIL/2019 
 
 
 
 
 
 
RELATÓRIO: MÉTODO E PRÁTICA DA COLOROÇÃO DE GRAM 
 
 
 
 
Trabalho apresentado ao Centro 
Universitário UNIEURO sob orientação da 
profa. Drª Livia Pimentel de Sant’Ana 
Dourado. 
 
 
 
 Discentes: Aline Alves Sousa 
 Anna Clara de Oliveira Sales 
 Carolina Melo Guedes Brito 
 Luana Alves de Oliveira 
 Luisa Gabriella Mundim 
Mayara Andrade 
 
 
BRASÍLIA-DF 
ABRIL /2019 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 4 
2. OBJETIVOS .................................................................................................... 6 
 2.1. Objetivo Geral ................................................................................................... 6 
 2.2. Objetivos Específicos ....................................................................................... 6 
3. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................... 7 
 3.1. Materiais ............................................................................................................ 7 
 3.2. Métodos ............................................................................................................. 7 
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES .................................................................... 9 
5. QUESTIONÁRIO ........................................................................................... 10 
6. CONCLUSÃO ................................................................................................ 12 
7. BIBLIOGRAFIA ............................................................................................. 13 
8. ANEXOS ........................................................................................................ 14 
 
 
 
 
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1. INTRODUÇÃO 
 
O método mais utilizado em bacteriologia é o método criado em 1884 pelo 
médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram, que observou que as bactérias 
adquiriam cores diferentes quando tratadas com diferentes corantes, se tornando 
roxas quando gram-positivas e vermelhas quando gram-negativas. (ministério da 
saúde) 
 
Desde a criação deste método, vários pesquisadores tentaram colocar uma 
justificativa para a diferença de coloração entre as bactérias, até surgirem as três 
teorias mais famosas: A primeira delas é a da existência de um substrato gram-
positivo específico. A segunda, da afinidade com o corante primário cristal de violeta 
e a terceira, sobre os diferentes graus de permeabilidade das paredes das 
bactérias, sendo a mais utilizada quando a questão é justificar a diferença da 
coloração entre os organismos, pois engloba tanto a espessura da parede celular, 
quanto às dimensões dos espaços intersticiais. 
 
Como citado existe uma diferença morfológica entre as bactérias negativas e 
positivas. As positivas irão apresentar uma parede celular mais espessa, por isso o 
complexo cristal violeta+lugol continua retido dentro da célula, após a lavagem com 
álcool etílico. Enquanto as negativas tem uma parede celular mais fina, esse terá 
uma influência diferente, onde o solvente age na porção lipídica das membranas 
externas das bactérias, perdendo a cor violeta. (blog odontoacademica) 
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A coloração de Gram consiste em um dos mais importantes métodos no 
isolamento e identificação do agente etiológico causador de infecção a partir de 
líquidos biológicos, sendo a identificação um fator crítico para a recuperação da 
saúde do paciente, pois a infecção bacteriana é algo grave e em casos mais 
extremos pode gerar sequelas e até mesmo levar o indivíduo a óbito. (DAUR) 
 
A técnica tem uma extrema importância clínica, uma vez que permite a rápida 
identificação e diferenciação entre as gram-positivas e negativas a partir de 
esfregaços de pus ou líquidos orgânicos, dando assim um norte de tratamento e 
monitoramento da infecção antes mesmo da análise da cultura ter sido concluída, 
além de permitir a comparação da evolução patológica. (blog são Francisco) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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2. OBJETIVOS 
 
2.1. Objetivo Geral 
 Evidenciar microrganismos, identificando suas diferenças 
morfológicas e de comportamento na presença dos corantes cristal violeta e 
fucsina, aplicando a técnica de coloração de Gram. 
 
2.2. Objetivos Específicos 
• Preparar lâminas para análise; 
• Executar o método de coloração de Gram; 
• Diferenciar as bactérias de acordo com a cor obtida após o processo; 
• Fazer a comparação entre as bactérias gram-positivas e gram-negativas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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3. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
3.1. Materiais 
• Culturas de microrganismos (placas com amostras, aula 1); 
• Lâminas para microscopia; 
• Óleo de imersão; 
• Microscópio; 
• Alça de platina; 
• Tubo contendo solução com água destilada e corante: cristal de violeta. 
• Bateria de corantes (cristal violeta fucsina) e reagentes (álcool e lugol); 
• Lamparina; 
• Isqueiro. 
 
3.2. Métodos 
Para realização do procedimento e manuseio dos materiais, foi necessário o uso 
de luva, touca, máscara e lamparina. 
 
Parte I – Preparação da lâmina 
Foi realizada a identificação e limpeza das lâminas de vidro utilizando papel 
toalha umedecido com álcool 70%. Posteriormente a alça de platina foi aquecida afim 
de mantê-la estéril, depois de fria ela foi usada para coletar a colônia bacteriana das 
placas de Petri. 
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Para cada esfregaço foi colocada uma gota de água destilada na lâmina para 
ajudar a dispersar a amostra na sua superfície. Depois ela foi levada próxima à chama 
da lamparina para que o material fosse fixado. 
Em seguida as lâminas fixadas seguiram para um recipiente preparado para 
fazer a coloração de Gram. 
Parte II – Coloração de Gram 
Primeiro o corante de cristal violeta foi usado para cobrir a lâmina afim de obter-
se a coloração da colônia presente. Aguardou-se um minuto e depois o excesso foi 
retirado com uma rápida lavagem com água destilada. 
Em seguida o lugol (mordente) foi aplicado, para se ligar ao corante cristal violeta 
e evidenciar a presença das bactérias gram-positivas. Ele cobriu o esfregaço durante 
um minuto, o excesso foi removido primeiramente com água destilada. Logo após foi 
jogado o álcool para descoloração e depois água destilada para lavar a amostra. 
Para verificar a presença de gram-negativas foi jogado a fucsina por 30 
segundos, retirou-se o excesso do corante com água destilada e por fim foi usado papel 
toalha para secar as laterais da lâmina sem que toca-se a amostra. 
Após a secagem total, as lâminas foram observadas no microscópio óptico, para 
análise das bactérias presentes, sua forma e arranjo. O mesmo processo foi repetido 
para as quatro amostras. 
 
 
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4. RESULTADOS E DISCUSSÕES 
 
Foram elaboradas as seguintes lâminas para a coloração de Gram e observação 
no microscópio: “bigode sujo”, “bigode limpo”, “boca suja”, “unha suja”, “mão suja”. 
No “bigode sujo”, foi observado uma espessa camada, apresentando-se na cor 
roxo escuro, portanto, seguindo a teoria as bactérias dessa coloração são classificadas 
em gram-positivas. Ademais, no “bigode limpo” apesar da desinfecçãocom água e 
sabão, ainda assim foi percebido um pequeno desenvolvimento de colônias 
bacterianas, que após a coloração, foram categorizadas como gram-negativas em 
função da cor rosa claro. 
Na segunda lâmina “boca suja”, observou-se a presença de bactérias que 
apresentaram duas cores: roxo escuro e rosa, foram classificadas em gram-positivas e 
gram-negativas respectivamente. Em contrapartida, para a amostra de “boca limpa (UV)”, 
não foi possível preparar uma lâmina, pois não foi apresentado nenhum foco de 
bactérias, podendo constatar que a radiação UV é um excelente bactericida. 
Nas lâminas de “unha suja” e “mão suja”, não foi possível observar a morfologia 
das bactérias em decorrência do insucesso do esfregaço ou da coloração. 
Com a análise microscópica foi possível identificar a presença de bactérias cocos 
em todas as lâminas, porém, a identificação dos arranjos não foi viável, pois todas as 
bactérias estavam muito agregadas umas nas outras. Sendo necessário uma 
microscopia de alto alcance para visualização dos mesmos. 
 
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5. QUESTIONÁRIO 
 
1. Por que a coloração Gram é tão importante? 
A coloração de Gram é muito útil, pois permite uma rápida identificação e 
diferenciação das bactérias. É a partir dessa técnica, que conseguimos diferenciar 
se a bactéria é gram-positiva ou gram-negativa, como também podemos visualizar 
suas morfologias. As bactérias gram-negativas possuem uma parede celular fina e 
simples, sendo menos resistentes. Já as bactérias gram-positivas possuem uma 
parede celular espessa, sendo mais resistentes aos antibióticos. Diante disso, saber 
se a bactéria é gram-positiva ou gram-negativa, faz toda diferença no tratamento. 
 
2. Qual a função do lugol? 
Como mordente sua função é ter grande afinidade pelo corante. O lugol é rico em 
iodo, que ao entrar na bactéria faz uma ligação com o corante cristal violeta, 
formando um complexo que fica na cor roxo escuro. 
 
3. Fazer um tabela com as etapas da coloração de Gram e descrever a 
aparência das células gram-positivas e gram-negativas após cada etapa: 
 
 
 
 
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Etapas da coloração de 
Gram 
 
Aparência das células 
 
Gram + Gram - 
Preparar o esfregaço do 
material microbiológico, 
“pescando” o material, com o 
auxílio da alça de platina e 
esfregar na lâmina com uma 
gota de água destilada. 
 
Fixar o material, mantendo a 
lâmina próxima a chama até 
o material secar. 
 
Aplicar o corante cristal 
violeta, cobrindo o esfregaço, 
durante 1 minuto. 
 
Violeta 
 
Violeta 
Retirar o excesso de cristal 
violeta, através de uma 
lavagem rápida com água 
destilada. 
 
Aplicar a solução de lugol 
(Mordente)sobre o esfregaço, 
durante 1 minuto. 
 
 
Retirar o excesso de lugol, 
com água destilada 
rapidamente. 
 
Lavar rapidamente com o 
etanol até descolorir, e em 
seguida com água destilada. 
 
Roxo escuro 
 
Transparente 
Cobrir o esfregaço com o 
corante de Fucsina ou 
Safrina durante 30 segundos. 
 
Roxo escuro 
 
Rosa 
Lavar com água destilada e 
secar a amostra com papel 
absorvente, sem que o papel 
encoste na amostra. 
 
Observar no microscópio o 
resultado. 
 
Roxo escuro 
 
Rosa 
 
 
 
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6. CONCLUSÃO 
 
Com o presente trabalho foi observado amostras da mucosa bucal, pelos faciais 
e região inferior da unha. Foram utilizadas diferentes substâncias e técnicas como: 
os raios UV, álcool 70, água sanitária e até mesmo a simples prática da lavagem 
com água e sabão. a diminuição da proliferação bacteriana, 
Após a coleta do material, seu esfregaço e sua evidenciação com a técnica de 
coloração de Gram, diferentes bactérias foram observadas na amostra, sendo suas 
divergências de positividade e arranjo. 
A partir da observação no microscópio das mesmas superfícies com e sem o 
sistema de desinfecção foi observado bactérias Grans + e Grans - com 
características de bactérias cocos. A partir disso foi concluído que a técnica que 
atingiu a melhor meta para eliminação das bactérias que foi a da luz UV, porém as 
demais também trouxeram um resultado favorável à diminuição bacteriana. 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
 
7. BIBLIOGRAFIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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8. ANEXOS 
 
 
 
 
Anexo A: Procedimento de coloração de gram. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Bigode Limpo Bigode sujo 
 
 
Unha Suja Unha Limpa 
 
 
Boca Suja