Tecnicas de imunodiagnostico

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Técnicas Imunológicas
Testes Sorológicos
Uso de soro ou outros fluidos biológicos de paciente
p/ diagnóstico laboratorial
• Demonstração de anticorpos específicos
= diagnóstico presuntivo (indireto)
• Demonstração de agente infeccioso ou antígeno do
agente = diagnóstico direto
Vantagens dos testes sorológicos 
• Rapidez 
• Simplicidade 
• Possibilidade de automação 
• Armazenamento de material biológico 
• Baixo custo operacional 
• Oferta de kits comerciais padronizados
Aplicações dos testes sorológicos 
• 1 – Diagnóstico presuntivo e diferencial 
• 2 – Diferenciação de fases da doença 
• 3 – Diagnóstico de alergias 
• 4 – Diagnóstico de doenças autoimunes 
• 5 – Diagnóstico de imunodeficiências congênitas 
• 6 – Seleção de doadores de sangue 
• 7 – Seleção de doadores de órgãos para enxertos
• 8 – Dosagens hormonais 
• 9 - Prognóstico da doença 
• 10 – Avaliação da eficácia da terapêutica instituída 
• 11 – Avaliação da imunidade específica (vacinação)
• 12 – Pesquisa de antígenos em células ou tecidos 
• 13 – Pesquisas epidemiológicas 
• 14 - Pesquisa básica e aplicada
Fatores que interferem na ligação 
entre Ag e Ac 
• Especificidade dos anticorpos 
• Afinidade dos Ac 
• Avidez dos Ac 
• Concentração dos Ac e antígenos 
• Classe dos anticorpos envolvidos 
• Pureza dos antígenos utilizados 
Conceitos básicos em sorologia 
• Título 
• Teste de referência 
• Sensibilidade 
• Especificidade 
• Falso -positivo, falso positivo, falso -negativo 
negativo
• Reação cruzada 
• Precisão 
• Acurácia ou exatidão 
• Reprodutibilidade 
• Limiar de reatividade (cut off)
Resultado falso-positivo e falso-negativo
• “falso positivo”, quando o resultado é positivo mas o paciente
não possui a doença,
• “falso negativo”, quando o indivíduo é portador da doença mas ela
não é detectada no exame.
OBRIGATÓRIA alta sensibilidade 
e especificidade em testes de 
triagem
Interações Ag - Ac
 Ligações não covalentes
 Reversíveis – uma vez que as reações Ag-Ac ocorrem via ligações não-
covalentes.
Características das interações Ag-Ac
Afinidade
Força de interação entre um único sítio de ligação Ag-Ac (em
um único epítopo).
Ac de baixa afinidade ligam -se de modo fraco e tendem a se
dissociar com facilidade.
Ac de alta afinidade estabelecem ligações fortes e mais
duradouras.
Características das interações Ag-Ac
Avidez
- Força de interações total entre Ac e Ag.
- Soma das afinidades de todos epítopos envolvidos 
Em geral quanto maior a avidez, melhor seu efeito biológico final 
(ex. reconhecimento de antíganos complexos sobre a superfície 
de Afinidade x avidez patógenos)
Especificidade
- Capacidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ags. 
Características das interações Ag-Ac
Reação cruzada
- Dois Ag diferentes apresentam epítopos estruturalmente 
semelhantes
- Ac específicos para um epítopo se ligam a um epítopo não
relacionado, mas com propriedades químicas similares.
Métodos
Reagentes não marcados
(A ligação do Ac altera o estado físico do Ag)
 Reação de aglutinação
 Reação de precipitação
Reagentes marcados
 RIA
 ELISA 
 IF, citometria de fluxo
 Western Blotting
Reação de aglutinação
Direta eritrócitos (hemaglutinação), bactérias, fungos
Passiva látex
(Ag insolúvel)
Qualitativos Semi-quantitativos
Ex.: classificação sanguinea Ex.: detectar infecções 
- Quantidades de Ag solúvel são adicionadas a uma
quantidade fixa de soro contendo o Ac.
Precipitado visível
Reação de precipitação
- A medida que a quantidade de Ag aumenta, a quantidade
de precipitado também aumenta até um máximo, para
depois diminuir.
Precipitação em solução
Precipitação em gel
Imunodifusão Radial (Mancini)
Precipitação em gel
Imunodifusão Dupla
Reagentes marcados
- Enzimas, fluorocromos, isótopos
- Tipos:
 Radioimunoensaio - RIA
 Ensaio Imunoenzimático - ELISA 
 IF, citometria de fluxo
 Western Blotting
Radioimunoensaios
Utilizam Ac conjugados com radioisótopos para 
quantificar os ensaios.
• Vantagens:
– Alta sensibilidade
– Permite medidas rápidas e precisas
• Desvantagens:
– Custo
– Vida média dos reagentes
– Risco operacional (radiação)
oAPLICAÇÕES
• Além de anticorpos e antígenos, pode-se detectar e
quantificar :
• catecolaminas, esteroides, antibióticos, hormônios,
vitaminas, drogas, marcadores tumorais e até
partículas virais…
Ou Captura
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
- Baseia-se na quantificação de uma reação enzimática 
associada com complexos imunes.
Imunofluorescência
- Utilizam-se Ac ou Ag conjugados a moléculas reveladoras
chamadas fluorocromos.
- Visualização em microscópio de fluorescência
Imunofluorescência Direta
Aplicações:
- Detecção direta de microrganismos 
(secreções, urina, cortes de tecidos); 
- Identificação de subpopulações de 
linfócitos;
- Fenotipagem de células tumorais
Ex.: Detecção de Chlamydia trachomatis
em secreção uretral
Ex.: Detecção de Ac anti- T. cruzi
Aplicações:
- Detecção de anticorpos específicos contra 
diversos microrganismos; 
- Diagnóstico de doenças auto-imunes; 
Detecção de Ac anti-nuclear
Imunofluorescência Indireta
Citometria de fluxo
- Detecta, separa e quantifica células contendo um antígeno 
particular, marcadas com um fluorocromo; 
- Cada anticorpo é marcado com um fluorocromo diferente; 
- As células são então analizadas no citômetro de fluxo.
- As células saem de uma
célula de fluxo e são
iluminadas por um raio laser;
Citometria de fluxo
- A quantidade de raios laser
que é dispersa para fora das
células durante a passagem
das mesmas pelo laser pode
ser medida, o que
proporciona informação a
respeito do tamanho das
células.
- O laser pode também excitar o fluorocromo nas células e a
luz fluorescente emitida pode ser medida por um ou mais
detectores.
Aplicações:
-Caracterização de populações celulares;
- Contagem de microrganismos;
- Separação de populações celulares de 
acordo com a densidade dos antígenos, 
tamanho e granulosidade das células;
- Análise de proliferação celular.
CD4 
CD8
CD19
Western Blot
Ensaios imunocromatográficos
Teste rápido de HIV
(Ac anti-HIV)
Diagnóstico de gravidez
( detecção de beta HCG)
Técnicas de Biologia Molecular
Reação da Polimerase em Cadeia
Amostra + 
Reagentes
RT-PCR 
(Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction)
Termociclador
Detecção da Amplificação
Produto 
(PCR ou RT-PCR)
Eletroforese em 
gel de 
poliacrilamida
Referências Bibliográficas
• ABBAS, A. K. ; LICHTMAN, A. H. & POBER, J.S. Imunologia celular e molecular. 5a
ed., Rio de Janeiro, Elsevier, 2005.
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• GOLDSBY, R.A.; KINDT, T.J. & OSBORNE, B.A. Kuby Imunologia. 4ª ed. Rio de
Janeiro, Revinter, 2002.
• JANEWAY, C.A.; TRAVERS, P.; WALPORT, M. & CAPRA, J.D. Imunobiologia. O
sistema imunológico na saúde e na doença. 5ª ed. Porto Alegre, ArtMed, 2002.
• ROITT, I.M. & DELVES, P.J. Fundamentos de imunologia. 10ª ed. Rio de Janeiro,
Guanabara Koogan, 2004.
• SCROFERNEKER, M.L. & POHLMANN, P.R. Imunologia básica e aplicada. Porto-
Alegre, Sagra-Suzatto, 1998.