TÉCNICAS DE SEMEADURA E ISOLAMENTO DE MICRO-ORGANISMOS

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TÉCNICAS DE SEMEADURA E ISOLAMENTO DE MICRO-ORGANISMOS 
 
 
Isolamento de um microrganismo:O isolamento consiste na obtenção de 
uma cultura pura (colônias isoladas de um único microrganismo, separando-o 
de outros que se encontram no mesmo material). 
 
Finalidades do isolamento: 
• Identificação de um micro-organismo: A simples observação de 
caracteres morfológicos não é suficiente para a identificação e 
classificação dos microrganismos. Para isto lançamos mão da análise de 
uma série de características destes como: características bioquímicas, 
sorológicas, de patogenicidade, e etc. O estudo destas características 
está na dependência do microrganismo que se pretende identificar. 
• Semeadura: Consiste no plantio de um microrganismo em um meio de 
cultura, a partir de um material contaminado qualquer. 
• Repique: Consiste na transferência de um microrganismo de um meio 
de cultura para outro. 
 
 
Objetivos: 
Após a realização da atividade prática você será capaz de: 
• executar e determinar a finalidade das principais técnicas de semeadura 
de bactérias em diferentes meios (líquidos, semi-sólidos e sólidos), tanto 
em tubos quanto em placas; 
• caracterizar os diferentes meios de cultura e a finalidade de cada um; 
• identificar e executar as técnicas de assepsia em laboratório. 
 
 
Material: 
Para a atividade prática serão utilizados: 
- Placa de Petri com Agar; 
- Tubo com Agar inclinado; 
- Tubo com Agar semi-sólido; 
- Cultura bacteriana em caldo e em Agar; 
- Alça bacteriológica. 
 
 
 
 
 
Técnica de semeadura ou repique de bactérias em meio líquido: 
 
 
• Fazer a desinfecção da área de trabalho e anti-sepsiadas mãos 
ANTES e DEPOIS de qualquer trabalho. (1) 
 
• Trabalhar SEMPRE na área de segurança: uma área de 
aproximadamente 10 cm ao redor da chama do bico de Bunsen. (2) 
 
• Esterilizar adequadamente todo material (p.ex.: alças e agulhas 
bacteriológicas) ANTES e DEPOIS de seu uso à sempre aquecer da 
base para a ponta, evitando a formação de aerossóis. (3) 
• Flambar a boca dos frascos e tubos ANTES e DEPOIS das inoculações, 
evitando a contaminação da cultura/material a ser analisado e 
garantindo que somente o microorganismo desejado será inoculado. (4) 
 
 
 
 
1- Segurar a alça com a mão direita, flambar primeiro na chama azul, 
depois na amarela. Esperar esfriar (a alça é flambada na posição vertical 
e deverá ficar atrás da chama para proteção do operador). 
2- Retirar a rolha de algodão do tubo que contem o microrganismo a ser 
semeado ou repicado (que deverá estar na mão esquerda) utilizando-se 
o dedo mínimo da mão direita. A ROLHA DEVERÁ PERMANECER 
SENDO SEGURA COM O DEDO MÍNIMO, ATÉ O FINAL DA 
OPERAÇÃO. 
3- Flambar a boca do tubo, e retirar o inóculo com a alça fria. 
4- Flambar novamente a boca do tubo e fechar. 
5- Pegar o tubo onde se irá realizar a semeadura, retirar a rolha e flambar. 
6- Semear o material, flambar a boca do tubo e fechar. 
7- Esterilizar a alça, identificar o tubo semeado e levar para incubação em 
estufa. 
 
 
De acordo com as características físicas dos meios de origem e destino, 
além dafinalidade da inoculação, podem-se utilizar diferentes técnicas de 
inoculação.A transferência de inóculo de um meio para outro também é 
denominada genericamente como repique. 
A seguir, veremos quais são as técnicas de inoculação: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Semeadura em meios sólidos 
 
 
 
 
 
 
Meio inclinado 
em 
tubos 
 
Estria sinuosa: semear com alça ou 
agulha bacteriológica, em zig-zag, 
partindo da base para a 
extremidade do bizel (superfície inclinada 
do meio). 
Objetivo: obtenção de intensa massa de 
micro-organismos 
Estria Reta: semear com agulha 
bacteriológica, fazendo uma linha reta, 
com cuidado de não ferir o 
Agar, partindo da base para a 
extremidade do bizel (superfície inclinada 
do meio). 
 
Objetivo: obtenção de pequena massa de 
Micro-organismos. 
Picada Central: semear com agulha 
bacteriológica, no centro do Agar. 
Dependendo da finalidade, o inóculo deve 
penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo 
deste. 
Objetivo: é utilizado para verificar 
fermentação e motilidade em algumas 
técnicas. 
 
 
 
Meio em camada 
alta 
 
Picada em Profundidade: semear com 
agulha bacteriológica, no centro do Agar. 
Dependendo da finalidade, o inóculo deve 
penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo 
deste. 
Objetivo: é utilizado para verificar 
fermentação e motilidade em algumas 
técnicas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Pour-plate ou disseminação (método 
emprofundidade): Transferir 1 ml da 
cultura paraplaca de Petri vazia, colocar 
10 – 20 ml do meio fundido (e resfriado a 
cerca de 45 – 50°C) sobre a cultura e 
homogeneizar suavemente com 
movimentos circulares. 
 
Objetivo: contagem bacteriana. É 
utilizado também para análise de micro-
organismos anaeróbios, adicionando uma 
outra camada de meio fundido após o 
endurecimento da primeira camada. 
 
 
 
 
 
 
Meio em placa 
de 
Petri 
 
Estria simples: transferir uma alçada da 
cultura para meio sólido em placa e estriar 
com a alça bacteriológica sobre o meio. 
A estria pode ser realizada em movimento 
de zigzag (estria sinuosa) ou como uma 
linha reta sobre o meio (estria reta). 
 
Objetivo: Essa técnica é muito utilizada 
paravisualização de determinadas 
propriedadesmetabólicas, como a 
produção de enzimashidrolíticas (hidrólise 
de substâncias do meio - 
gema de ovo, sangue...), e produção 
depigmentos. 
 
 
 
Esgotamento em estrias ou estrias 
múltiplas: transferir uma alçada da 
cultura para meio sólido em placa e estriar 
com a alça bacteriológica sobre o meio. A 
placa é dividida em 4 quadrantes e a 
inoculação pode ser feita de 2 tipos: a) em 
3 estrias: estriar em metade da placa, 
com movimentos de zig-zag. Quando 
atingir a metade, girar a placa 90° e estriar 
até a metade (1/4 da placa), girar mais 90° 
e estriar o meio restante. b) em 4 estrias: 
estriar até 2/3 da metade da placa, girar 
90°, estriar 2/3 do próximo quadrante (1/4 
da placa), girar 90°, estriar mais 2/3 do 
próximo quadrante (1/4 da placa), girar 
90° e estriar o restante do meio. 
 
Objetivo: obtenção de colônias isoladas.É 
importante não cruzar as estrias (não 
tocar aalça na estria anterior), para reduzir 
o inóculo a cada estria e obter as colônias 
isoladas. 
Pode-se, alternativamente, flambar a alça 
entre as estrias e tocar a ponta da estria 
anterior, arrastando um pequeno inóculo 
para a próxima estria. 
 
 
 
Semeadura em meios semi-sólidos 
 
 
 
Picada em Profundidade: semear com 
agulha bacteriológica, no centro do Agar. 
Dependendo da finalidade, o inóculo 
devepenetrar até 2/3 do tubo ou até o 
fundo deste. 
 
Objetivo: é utilizado para verificar 
fermentação e motilidade em algumas 
técnicas. Além disso, o meio também é 
utilizado para estocar culturas puras. 
Semeadura em meios líquidos 
 
 
 
Difusão: uma alçada da colônia (Agar 
emplaca) ou da cultura (de outro meio ou 
líquido) é introduzida no meio líquido, com 
agitação da alça, para maior difusão dos 
micro-organismos (da alça para o meio e 
homogeneização no meio). Pode-se 
inclinar o tubo a 30° e esfregar o inóculo 
na parede do mesmo, quando o 
tubo retornar à posição original o inóculo 
se difundirá no meio. 
Objetivo: é um repique genérico para 
crescimento bacteriano em meio líquido. 
 
 
 
EXECUÇÃO DA PRÁTICA 
 
a) A partir de cultura em placa: 
1. A partir de um crescimento isolado obtido em placa, pegar uma colônia 
com auxílio de uma alça bacteriológica e transferir para o tubo com 
caldo, através do processo de difusão. 
 
 
 
b) A partir de cultura em caldo: 
A partir de um crescimento obtido em caldo, realizar as seguintes inoculações: 
 
1. Com auxílio de uma alça bacteriológica, transferir o inóculo para o tubo 
com outro caldo, através da técnica de difusão. 
 
 
 
2. Com auxílio de uma alça ou agulha bacteriológica, transferir o inóculo 
para o tubo com Agar inclinado, através da técnica de estria (sinuosa ou 
reta). 
 
 
 
 
3. Com auxílio de umaalça bacteriológica, transferir o inoculo do caldo 
para a placa com Agar, através da técnica de esgotamento em estrias 
(3 ou 4 estrias). 
O sucesso da semeadura está em: 
a) grande número de estrias; 
b) não perfurar o meio; 
c) não voltar a alça sobre a estria 
d) pegar pequena quantidade de material para semear. 
 
 
4. Com auxílio de uma agulha bacteriológica, transferir o inóculo para o 
tubo com Agar semisólido, através da técnica de picada central. A 
inoculação deverá ter a profundidade de 2/3 do meio e não deverá ser 
mais do que uma única picada. 
 
 
 
5. Técnica de semeadura em placa pour-plate. 
 
A técnica da semeadura em placa pour-plate pode ser realizada com o 
objetivo de se obter colônias isoladas (estudo qualitativo) ou para realizar a 
contagem de colônias em placa (estudo quantitativo). 
 
Materiais: meio líquido contendo E.coli; seis tubos de ensaio com solução 
salina estéril; 1 placa de petri estéril, 20 ml de meio de cultura Agar nutriente 
fundido, pipeta estéril de 0,1mL. 
 
• Transferir 0,1 mL da cultura em caldo de E. coli para o tubo 1. 
• Agitar o tubo 1 e transferir 0,1 mL dessa suspensão para o tubo 2. 
• Agitar o tubo 2 e transferir 0,1 mL dessa suspensão para o tubo 3, e 
assim sucessivamente até o tubo 6. 
• Transferir 0,1 mL do tubo 6 para a placa de Petri estéril.. 
• Colocar 20 mL de ágar nutriente fundido sobre o fundo da placa, 
realizando movimentos rotatórios, em forma de 8, para a perfeita mistura 
da cultura com o ágar nutriente (não muito quente para não matar as 
bactérias). 
• Esperar solidificar, inverter a placa e incubar a 37o C, por 18-24 h. 
• Proceder à contagem de colônias (a placa deve ter 30 a 300 colônias no 
máximo, para ser possível a contagem). 
• Calcular o número de unidades formadoras de colônias/mL. 
 
Resultado: 
Deixar os cálculos indicados no espaço abaixo: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6. Leitura dos experimentos de semeadura. 
 
MEIO LÍQUIDO 
Para realizar a leitura dos resultados desta técnica devem-se observar os 
seguintes itens: 
a) Quantidade de crescimento: pode ser escassa, moderada ou 
abundante. 
b) Distribuição de crescimento no meio de cultura: pode ter 
crescimento uniformemente distribuído (nitidamente turvo); crescimento 
confinado à superfície do meio como uma espuma ou filme (película); ou 
crescimento acumulado como sedimento que pode ser granuloso ou 
viscoso. 
Contagem manual: 
 
A Placa de Petry foi divida em 4 partes iguais, onde 
escolhemos a mais homogênea para realizar a contagem. 
Resultado:400 colônias em 0,5 ml. Extrapolando para 1 
ml, resulta em aproximadamente 800 colônias. 
c) Odor: pode ser pútrido, aromático, ou desprezível. Registrar os 
resultados no quadro abaixo: 
 
Cultura bacteriana em meio líquido para meio líquido 
BACTÉRIA ITEM 
E.coli a) Abundante. 
b) Crescimento acumulado como 
sedimento que é granuloso. 
c) Desprezível. 
 
 
 
Cultura bacteriana em placa para meio líquido 
BACTÉRIA ITEM 
E.coli a) Abundante. 
b) Crescimento acumulado como 
sedimento que é granuloso. 
c) Pútrido. 
 
 
 
MEIO ÁGAR INCLINADO 
 
Para avaliar a leitura dos resultados desta técnica deve-se observar os 
seguintes itens: 
a) Quantidade: pode ser descrita como escassa, moderada ou abundante. 
b) Margem ou bordos do crescimento: pode ser descrita como uniforme 
ou nítida, ou mostrando várias irregularidades. 
c) Consistência da massa de crescimento: pode ser butírica ou de 
consistência semelhante à de manteiga, facilmente removível com a alça 
de platina: viscosa ou mucóide; seca ou quebradiça. 
d) Cromogêneseou pigmentação: pode ser opaca, translúcida ou com 
pigmento. 
BACTÉRIA ITEM 
E.coli a) Abundante. 
b) Nítido. 
c) Viscoso. 
d) Opaca. 
 
 
MEIO SEMI SÓLIDO 
 
O modo de se observar um resultado quando utiliza-se esta técnica é o 
seguinte: 
Resultado positivo: há crescimento por todo o meio de cultura, semelhante a 
um "pinheiro invertido". 
Resultado negativo: há crescimento somente no local da inoculação. 
Registrar o resultado no quadro abaixo: 
 
Bactéria Resultado 
E.coli Negativo. 
MEIO DE CULTURA SÓLIDO EM PLACA 
 
RESULTADO: 
Quando há desenvolvimento de colônias isoladas na superfície do meio, 
considera-se o isolamento correto. Neste método verificam-se as 
características de colônias quanto aos seguintes aspectos: 
a) tamanho: o tamanho das colônias varia desde dimensões muito 
pequenas (puntiformes), com apenas uma fração de milímetros de diâmetro, 
até colônias muito grandes, com 5 a 10 mm de diâmetro. 
b) borda: a periferia das colônias bacterianas pode formar muitos desenhos 
diferentes, dependendo da espécie. Pode ser inteira, ondulada, lobulada, 
denticulada ou franjada. 
c) elevação: as colônias podem ser achatadas, espraiadas, convexas 
(baixa e alta), umbilicada, centro saliente. 
d) cromogênese ou pigmentação: opaca, translúcida ou com pigmento. 
e) forma: as colônias podem ser circulares, irregulares ou rizóides. 
f) consistência da massa de crescimento: pode ser butírica ou de 
consistência semelhante à da manteiga, facilmente removível com a alça de 
inoculação: viscosa ou mucóide; seca ou quebradiça. 
 
Anotar seus resultados no quadro abaixo: 
BACTÉRIA ITEM 
E.coli 
 
 
 
a) Colônias grandes. 
b) Inteira. 
c) Centro saliente. 
d) Opaca. 
e) Circulares. 
f) Viscosa ou mucoide. 
 
 
7. Qual a função dos meios de cultura? 
Sua finalidade é fornecer nutrientes para o cultivo de microorganismos. 
Com o desenvolvimento da bactéria é possível identificá-la através do 
uso de meios de cultura seletivos. E a contagem é empregada para 
determinação quantitativa da população microbiana. 
 
8. Quais são as exigências básicas para o crescimento microbiano? 
Para obter sucesso no cultivo de microorganismos é necessário o 
conhecimento de suas exigências nutricionais, para que os nutrientes 
sejam fornecidos de forma e proporção adequada. Existem duas classes 
de meios de cultura: os quimicamente definidos (sais, compostos 
orgânicos purificados, água) e os complexos (utilizam hidrolisados carne 
e soja, extratos de levedura, sangue, soro, leite, solo e rúmen de 
bovino).Os fatores abióticos também influenciam no crescimento 
microbiano: fatores físicos (temperatura; pH; pressão osmótica, 
atmosférica, hidrostática) e fatores químicos (água, fontes de carbono, 
oxigênio, nitrogênio, minerais, fatores orgânicos de crescimento). 
Em resumo, o meio de cultura deve oferecer condições o mais próximas 
possível das condições naturais. 
 
9. Quanto à consistência, como são classificados os meios de 
cultura? 
Os meios de cultura podem ser preparados em três consistências: 
Sólidos:São meios adicionados de um agente solidificante como o agar-
agar, um produto derivado de algas marinhas (Gellidium sp.).Estes 
meios são acondicionados em Placas de Petri ou tubos contendo meio 
inclinado e são chamados de Agar nutriente.Em tubos, são destinados a 
realização de Provas Bioquímicas para identificação 
bacteriana.Em placas, se destinam ao isolamento de colônias, estudo 
morfológico destas e obtenção de cultura pura para estudo e 
identificação bacteriana. 
Semi-sólidos:Esses meios contém pequena concentração de agente 
solidificante, sendo portanto classificados como semi-sólidos. 
São acondicionados em tubos de ensaio e também são empregados 
para realização de provas bioquímicas para observar a 
motilidade bacteriana ou para conservação de culturas. 
Líquidos:São meios que não contêm agente solidificante. São 
chamados de Caldo Nutriente e são usados como meios de 
enriquecimento para o rápido crescimento bacteriano, obtenção de 
suspensões, etc. 
Eles são ainda classificados de acordo com a finalidade ou uso em: 
básico, seletivo, indicador ou diferencial, enriquecimento e especial. 
 
 
10. Utilizando um cotonete estéril, um aluno recolheu bactérias da 
garganta de outro aluno. Qual das técnicas de semeadura 
apresentadas seria adequada para obtenção de uma cultura pura? 
Esgotamento em estriasou estrias múltiplas, que tem por objetivo a 
obtenção de colônias separadas. 
 
 
 
Referências 
 
http://www.splabor.com.br/blog/meio-de-cultura-2/meio-de-cultura-identificacao-
e-cultivo-de-microorganismos/ 
 
http://pt.slideshare.net/AdrianaDantas2/meio-de-cultura-em-microorganismos 
 
https://docs.google.com/presentation/d/1duBSie9J6fnv8G9KZAk5JHL42jBBE0y
_zc2VAxgKdMA/edit?pli=1#slide=id.i12 
 
https://microdidatica.wordpress.com/microbiologia-geral/meios-de-cultura/ 
 
http://www.splabor.com.br/blog/meio-de-cultura-2/meio-de-cultura-identificacao-e-cultivo-de-microorganismos/
http://www.splabor.com.br/blog/meio-de-cultura-2/meio-de-cultura-identificacao-e-cultivo-de-microorganismos/
http://pt.slideshare.net/AdrianaDantas2/meio-de-cultura-em-microorganismos
https://docs.google.com/presentation/d/1duBSie9J6fnv8G9KZAk5JHL42jBBE0y_zc2VAxgKdMA/edit?pli=1#slide=id.i12
https://docs.google.com/presentation/d/1duBSie9J6fnv8G9KZAk5JHL42jBBE0y_zc2VAxgKdMA/edit?pli=1#slide=id.i12
https://microdidatica.wordpress.com/microbiologia-geral/meios-de-cultura/