Meios de Cultura

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Meios de Cultura  
 
● É todo o suporte (nutrientes, condições físicas e químicas) preparado fornecido,                      
que permite o crescimento e desenvolvimento de microrganismos em                  
laboratório (fora de seu hábitat natural);  
● No caso do vírus que são parasitas intracelulares obrigatórios seu meio de                        
cultura é vivo e não igual o das bactérias.  
● NÃO HÁ UM MEIO DE CULTURA UNIVERSAL → Algumas bactérias                    
podem crescer bem em qualquer meio de cultura; outras requerem meios                      
especiais, e outras ainda não podem crescer em qualquer dos meios não vivos                          
até agora desenvolvidos;  
● Existem ainda algumas espécies bacterianas que só podem ser “cultivadas” em                      
animais experimentais (ex. Mycobacterium leprae e Treponema pallidum);  
● Variável;  
● usados para análises laboratoriais e estudo científico >> utilização no                    
isolamento e na identificação de bactérias que são de interesse para os                        
pesquisadores em campos como a microbiologia de alimentos, de água e a                        
microbiologia clínica.  
● Inóculo - são microrganismos que são introduzidos em um meio de cultura                        
para dar início ao crescimento;  
● cultura - são micróbios que crescem e se multiplicam no interior ou sobre um                            
meio de cultura;  
➔ CRITÉRIOS QUE UM MEIO DE CULTURA DEVE PREENCHER:  
1. deve conter os nutrientes adequados para o microrganismo específico                  
que queremos cultivar.   
2. Deve conter também uma quantidade de água suficiente ;  
3. pH apropriado;   
4. Nível conveniente de oxigênio , ou talvez nenhum .   
5. deve ser estéril – isto é, inicialmente não deve conter microrganismos                      
vivos – dessa forma, a cultura conterá apenas os microrganismos (e sua                        
descendência) que foram introduzidos.   
6. deve ser incubada em temperatura apropriada .  
➔ CULTURA PURA: quando apenas um tipo de organismo está presente;   
➔ CULTURA MISTA: quando populações de organismos diferentes estão                
presentes;  
● A presença de determinados corantes ou de produtos químicos nos meios                      
produzirão certas alterações características ou padrões de crescimento que são                    
utilizados para a identificação ou a diferenciação de microrganismos.  
  
➔ CLASSIFICAÇÃO: De acordo com o estado sólido (agente solidificante),                  
objetivos funcionais e composição química.  
  
1. Quanto ao Estado físico/Consistência - meios podem ser encontrados de                    
3 formas, sólidas, líquidas ou sem-sólidas ;  
  
sólidos > têm a adição de uma substância/agente solidificante em                    
determinada quantidade (1,5 a 2% de ágar 1 ) ; superfície endurecida                    
permitem a formação de colônias; usado para distinção da morfologia,                    
isolamento de colônias, conservação de cepas; preparados              
adicionando-se ágar ao meio líquido e posterior colocação em tubos de                      
ensaio ou placas de Petri , onde o meio se solidifica; o crescimento                        
bacteriano é visualizado pela formação de colônias;  
ex: ágar nutritivo; Agar Sangue, Agar Manitol Salgado, Agar MacConkey,                    
Agar A Hektoen Entérico, Agar Mueller Hinton, ágar chocolate;  
1 hidrocolóide fortemente gelatinoso extraído de diversos gêneros e espécies de algas marinhas vermelhas que                              
consiste em uma mistura heterogênea de dois polissacarídeos, agarose e agaropectina; solidificante que é usado                              
no preparo dos meios de cultura, que quando adicionado a um caldo nutriente (mistura de nutrientes específicos                                  
necessários para o cultivo de um determinado microrganismo), forma um meio de cultura; Poucos                            
microrganismos podem degradar o ágar, o que permite que ele permaneça sólido. Além disso, o ágar se liquefaz a                                      
cerca de 100°C (o ponto de ebulição da água) e ao nível do mar ele permanece líquido até a temperatura diminuir                                          
até cerca de 40°C. Para utilização no laboratório, o ágar é mantido em banho-maria a 50°C. Nessa temperatura,                                    
ele não destrói a maioria das bactérias quando adicionado sobre elas (como mostrado na Figura 6.17a, p. 168).                                    
Uma vez solidificado, ele pode ser incubado a cerca de 100°C antes de se liquefazer novamente; essa propriedade                                    
é particularmente útil quando bactérias termófilas estão sendo cultivadas. Os meios com ágar geralmente são                              
contidos em tubos de ensaio ou placas de Petri.  
  
  
Líquido (caldo) - não possui agente solidificante; colocados em tubos de                      
ensaio; pode ser usado como meio de nutriente, mas também como meio                        
seletivo para identificação de algum tipo de bactéria; crescimento é                    
observado pela turvação do meio;   
ex. BHI (infusão de cérebro e coração);   
Semi-sólido - têm 0,3 a 1,0 % de ágar; intermediário; forma gelatinosa;                        
feito em tubos de ensaios; crescimento é visualizado pela turvação do                      
meio; muito usado para observar a motilidade da bactéria;  
ex. ágar SIM; Nitrato Motilidade;  
  
2. Quanto à composição química - Sintéticos e meios complexos;  
Sintéticos ou quimicamente definidos - são preparados a partir de                    
ingredientes puros dos quais se conhece a exata composição química dos                      
constituintes do ágar; usados para estudo de necessidades nutricionais                  
de determinadas bactérias; meio mínimo se fornecer apenas os                  
nutrientes exatos (incluindo quaisquer fatores de crescimento)              
necessários ao organismo para o crescimento;  
Complexos ou não-definidos - A exata composição do meio não é                      
conhecida; meio quimicamente indefinido; função de similar ao                
ambiente natural da bactéria; contêm materiais complexos de origem                  
biológica, como sangue ou leite ou extrato de levedura ou extrato de                        
carne bovina, cuja composição química exata é obviamente                
indeterminada;  
ex. ágar sangue (quantidades não é conhecida porque pode variar a                      
quantidade de nutrientes presentes no sangue); ágar chocolate;  
  
3. Quanto à função - Meios simples, enriquecidos e meios seletivos,                    
meios diferenciais, meios de enriquecimento, meio de transporte,                
meios de manutenção ou estocagem e meio deidentificação;  
  
Meio simples/básico - possuem os componentes essenciais para o                  
crescimento de microorganismos pouco exigentes; permitem o              
crescimento, porém não atendem a nenhuma condição nutricional                
específica de um determinado microrganismo; servem ao cultivo de                  
vários microorganismos;  
Ex: caldo/ágar simples; água peptonada, caldo/ágar nutriente, Agar                
Padrão para Contagem;  
  
  
Meio de enriquecimento - usado para amplificar as bactérias que estão                      
em pequeno número na amostra; geralmente usado para microorganismo                  
específico; normalmente é um meio líquido; Contém nutrientes                
especiais que permitem o desenvolvimento de microorganismos              
específicos que não deve estar presente em número suficiente para                    
permitir ser isolado e identificado; usado p/ isolar um microorganismo                    
de um meio que está em pequena quantidade;  
usados para amostras fecais (coprocultura) inibindo o crescimento da                  
microbiota das fezes e permitindo o crescimento de Salmonella e                    
Shigella que são patogênicas;  
ex. Caldo selenito-cistina; Caldo RappaportVassiliads, Caldo Verde de                
Malaquita; Caldo Acetamida;  
  
  
  
Meio enriquecido - permite o crescimento de micro-organismos                
exigentes que necessitam de fatores de crescimento, (sangue, soro,                  
extrato de levedura, gema de ovo, etc.], mas não inibem o crescimento de                          
outros;   
Ex: ágar sangue, ágar chocolate, caldo BHI;  
  
Meios seletivos - favorecem o crescimento de determinados Mo, mas                    
inibem a proliferação de outros, devido à adição de substâncias                    
inibidoras [antibióticos, sais biliares, corantes]; variação de nutrientes,                
pH, temperatura, pressão osmótica, etc. usado para isolar determinado                  
MO ou categoria de bactérias;  
Ex: ágar mitis salivarius bacitracina sacarose, ágar Salmonella-Shigella 2 ;                
Lowenstein-Jensen; Mac Conkey além de seus nutrientes, contém cristal                  
violeta e sais biliares que inibe o crescimento de bactérias                    
gram-positivas e permite o crescimento de gram-negativas.  
  
  
  
  
  
2 altamente seletivo para o isolamento de Salmonella spp. e algumas espécies de Shigella a                              
partir de amostras clínicas e de alimentos.  
  
  
Meio diferencial - possui substâncias que evidenciam uma característica                  
que permite separar um grupo ou uma espécie de micro-organismo. São                      
comumente utilizados no isolamento e identificação presuntiva 3 de                
bactérias; por exemplo modificação da coloração, onde outros tipos de                    
bactérias não conseguem mudar; geralmente permite o crescimento de                  
várias espécies de MO ao mesmo tempo, nos permitindo distingui-los.  
permitem a distinção entre dois ou mais tipos de bactérias pela simples                        
observação apresentadas pelas suas colônias que neles se desenvolvem.  
ex. Agar Sangue; Agar MacConkey, Agar Hektoen Entérico ;  
OBS: A grande maioria dos meios diferenciais são também seletivos ;  
3 que tem possibilidades de ser; provável. 
  
  
Meio de transporte - usados para transporte e manutenção de amostras                      
biológicas como fezes e secreções; meio inerte (porque permitem a                    
viabilidade da maioria dos patógenos sem alterar a sua concentração);                    
não possuem nutrientes, apenas um agente redutor > previne                  
desidratação e oxidação enzimática dos patógenos presentes em fezes, e                    
secreções;  
ex. meio de stuart ou Amies usado para o transporte com swabs; meio                          
cary-blair e salina glicerinada tamponada (transporte de fezes para                  
isolamento de Salmonella e shigella);  
  
  
Meio de estocagem ou manutenção - utilizados para conservação de                    
microorganismos no laboratório, garantindo sua viabilidade;  
ex. Agar leite; Caldo TSB; Agar Sabouraud; água destilada;  
Meio de identificação - usado para identificação de bactérias                  
gram-negativas e gram-positivas;  
  
➔ Medidas do crescimento microbiano  
  
-crescimento de populações microbianas pode ser medido por meio de diversas                      
técnicas;  
-Alguns métodos medem o número de células, outros medem a massa total da                          
população, a qual é frequentemente proporcional ao número de células;   
-A quantificação de uma população normalmente é registrada como o número de                        
células por mililitro (mL) quando for líquido ou número de células/grama (g)                        
quando o meio for sólido;  
1. Contagem total de células/Contagem microscópica direta - um determinado                  
volume de uma suspensão bacteriana é colocado em uma lâmina microscópica                      
( lâmina de contador de células de Petroff-Hausser Especialmente );                
frequentemente utilizado para contar o número de bactérias no leite;   
Uma amostra de 0,01 mL é espalhada em uma superfície de um centímetro                          
quadrado da lâmina, um corante é adicionado para visualizar a bactéria, e a                          
amostra é observada com lentes objetivas de imersão; Deve ser determinada a                        
área de observação de cada região da lâmina; Após a contagem de diferentes                          
regiões da lâmina, a média do número de bactérias por campo observado pode                          
ser calculada; A partir desses resultados, o número de bactérias no centímetro                        
quadrado contendo a amostra também pode ser calculado; Como essa área da                        
lâmina continha 0,01 mL, o número de bactérias em cada mililitro da suspensão                          
é o número de bactérias na amostra multiplicado por 100;  
desvantagem → bactérias móveis são difíceis de serem contadas por esse                      
método; as células mortas acabam sendo contadas como vivas; necessidade de                      
uma concentração de células bastante elevada para permitir uma contagem                    
satisfatória – em torno de 10 milhões de bactérias por mililitro;   
vantagem → um tempo de incubação não é requerido; elas geralmente são                        
reservadas para situações nas quais o tempo é essencial >> Esse é o caso dos                              
contadores de células eletrônicos ou contadores Coulter, que contam                  
automaticamente o número de células em um volume líquido determinado;  
  
  
2. Contagem de viáveis ou contagem em placa - medeo número de células                          
viáveis (vivas); é que são necessárias 24 horas ou mais para que colônias visíveis                            
sejam formadas (desvantagem) → pode ser um problema sério para certas                      
aplicações, como o controle de qualidade do leite, quando não é possível manter                          
um lote do produto durante esse tempo;  
princípio > consideram que cada bactéria viva cresce e se divide para produzir                          
uma única colônia → Isso não é sempre verdadeiro, pois as bactérias                        
frequentemente crescem unidas em agregados ou cadeias > Portanto, uma                    
colônia muitas vezes resulta não de uma única bactéria, mas de um curto                          
fragmento de uma cadeia ou de um agregado bacteriano → unidades formadoras                        
de colônias (UFC);   
Quando uma contagem em placas é feita, é importante que somente um número                          
limitado de colônias se desenvolva na placa ( recomendação de 25 a 250                          
colônias) → Quando muitas colônias estão presentes, algumas células são                    
reprimidas e não podem se desenvolver → causam imprecisão na contagem ;                      
porém muitos microbiologistas preferem placas com 30 a 300 colônias → Para                        
assegurar que algumas contagens de colônias estejam nessa faixa, é preciso                      
diluir o inóculo inicial várias vezes >> processo de diluição seriada  
  
sabendo mais ou menos o número de bactérias que possam estar presentes no inóculo                            
inicial é possível realizá-lo;   
ex. prepare um inóculo inicial que contém 10.000 bactérias/mL > muito grande e vai                            
formar colônias maiores que a da faixa, por isso tem que diluir;   
se eu pegar 1mL desse inóculo inicial e acrescentar 9 ml de ágar estéril vou estar                                
diluindo minha amostra 10 vezes dando um total de 1000 bactérias, mas ainda é muito,                              
daí preciso diluir mais;   
então eu pego 1mL desse inóculo contendo 1000 bactérias e acrescento mais 9ml de                            
ágar vou estar diluindo mais 10 vezes, daí se ele for semeado em placa vai conter só 100                                    
bactérias;  
A forma de semear o inóculo aqui pode ocorrer de 2 formas: método de incorporação                              
em placas >> meio é colocado em cima do inóculo bacteriano; Um mililitro ou 0,1 mL                                
das diluições da suspensão bacteriana é introduzido em uma placa de Petri; O meio                            
nutritivo, no qual o ágar é mantido líquido por aquecimento em banho-maria a 50°C, é                              
vertido sobre a amostra, que é, então, misturada com o meio por agitação lenta da                              
placa ; Quando o ágar solidifica, a placa é incubada; Com essa técnica, as colônias                            
crescerão tanto dentro do ágar nutriente (a partir de células que ficaram em suspensão                            
no meio nutritivo assim que o ágar solidificou) quanto na superfície da placa de ágar;                              
desvantagens → alguns microrganismos relativamente sensíveis ao calor podem ser                    
danificados pelo ágar fundido, sendo incapazes de formar colônias; quando certos                      
meios diferenciais são utilizados, a aparência diferenciada da colônia na superfície é                        
essencial para fins diagnósticos; As colônias que se formam abaixo da superfície de                          
uma placa por incorporação não são adequadas para esses testes > por isso temos o                              
outro método; ou pelo método de espalhamento em placas >> utilizado com                        
frequência; Um inóculo de 0,1 mL é adicionado à superfície de um meio de ágar                              
previamente solidificado; O inóculo é, então, espalhado de modo uniforme na                      
superfície do meio com um bastão de vidro ou metal com um formato específico,                            
esterilizado; Esse método espalha todas as colônias na superfície (colônias crescem                      
apenas na superfície do meio) e evita o contato entre as células e o ágar fundido;  
  
  
  
  
  
3. Massa de células/peso seco - Para bactérias e fungos filamentosos, os métodos                        
comuns de medida são menos satisfatórios; Uma das melhores maneiras de                      
medir o crescimento de organismos filamentosos é pelo peso seco; Neste                      
procedimento, os fungos são removidos do meio de crescimento, filtrados para                      
a remoção de outros materiais e secos em um dessecador , sendo, então,                        
pesados ; Para bactérias, o mesmo procedimento básico é seguido;  
4. Turbidimetria - estima a turbidez para monitorar o crescimento bacteriano,                    
pois À medida que as bactérias se multiplicam em um meio líquido, o meio se                              
torna turvo ou opaco com as células; instrumento usado é o espectrofotômetro                        
(ou colorímetro); nele um feixe de luz é transmitido através de uma suspensão                          
bacteriana até um detector fotossensível. Com o aumento do número de                      
bactérias, menos luz atingirá o detector > Essa alteração da luz será registrada                          
na escala do instrumento como a porcentagem de transmissão (%T). Também                      
será registrada na escala do instrumento uma expressão logarítmica de                    
absorbância (densidade óptica, ou DO) >> utilizada para representar                  
graficamente o crescimento bacteriano; Quando as bactérias estão em                  
crescimento logarítmico ou em declínio, o gráfico da absorbância em função do                        
tempo será uma linha quase reta; Se as leituras de absorbância forem                        
combinadas com contagens em placas da mesma cultura, essa correlação                    
poderá ser utilizada para estimativas futuras do número de bactérias obtidas                      
pela medida de turbidimetria;  
Mais de um milhão de células/mL devem estar presentes para que os primeiros                          
sinais de turbidez sejam visíveis > Em torno de 10 milhões a 100 milhões de                              
células por mililitro são necessários para que uma suspensão seja turva o                        
suficiente para possibilitar uma leitura no espectrofotômetro.   
  
  
5. Análises químicas/Atividade metabólica - maneira indireta de estimar o                  
número de bactérias; mede a atividade metabólica de uma população; assume                      
que a quantidade de um produto metabólico determinado, como um ácidoou                        
CO2, é diretamente proporcional ao número de bactérias presentes ; Contam                    
somente células vivas ativas metabólicamente;  
ex. ensaio microbiológico, no qual a produção de ácido é utilizada para se                          
determinar as quantidades de vitaminas;    
  
6. Contagem em Membrana Filtrante - limitado a análise de amostras líquidas                      
límpidas, sem sólidos em suspensão, que possam ser filtradas através de uma                        
membrana de poro; vantagem → permite a inoculação de maiores volumes da                        
amostra, concentrando na membrana os microrganismos presentes na                
quantidade inoculada; Membranas filtrantes com tamanho de poro de 0,45µm                    
têm sido reconhecidas como padrão para o crescimento de microrganismos . A                      
utilização da técnica de membrana filtrante é de uso farmacêutico, alimentos e                        
bebidas, águas, análises de microbiológicos geral;  
  
  
7. Número Mais Provável (NMP) - técnica estatística; princípio: quanto maior o                      
número de bactérias em uma amostra, maior será o número de diluições                        
necessárias para reduzir a densidade até um ponto no qual mais nenhuma                        
bactéria esteja presente nos tubos de diluição seriada; utilizado quando os                      
microrganismos não crescem em um meio sólido ( bactérias quimioautotróficas                  
nitrificantes ); Também é prático quando o crescimento de bactérias em um                      
meio líquido diferencial é utilizado para identificar microrganismos ( como                  
bactérias coliformes em água, que fermentam seletivamente lactose,                
produzindo ácido); fornece somente uma estimativa de 95% de probabilidade de                      
uma população bacteriana estar em uma faixa determinada; MNP obtido é                      
estatisticamente o número mais provável;  
  
  
➔ TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO/SEMEADURA OU SEMEIO  
  
-Semeadura = Inocular (transferir o micro-organismo a um meio de cultura)  
-Método pelo qual se transfere inóculos bacterianos de um meio de cultura ou material                            
a ser analisado (secreções, alimentos) para um outro meio de cultura.  
-Para garantir que apenas o microrganismo desejado seja semeado, são utilizadas as                        
técnicas assépticas → procedimentos que devem ser adotados visando a não                      
contaminação de materiais, meios e culturas;  
-mudam de acordo com o tipo do meio de cultura e microrganismo que será estudado;  
  
  
  
➢ TÉCNICA DE SEMEADURA EM MEIO SÓLIDO EM PLACA (TÉCNICA                  
DE ESGOTAMENTO)   
-Nela, a suspensão bacteriana (que é o líquido com o microrganismo) é espalhada de                            
forma aleatória em toda a placa, até que todo o material seja utilizado. Assim, é                              
possível ter a certeza de que haverá realmente um crescimento bem distribuído e que                            
garantirá uma boa análise mais tarde;  
-objetivo → obtenção de colônias isoladas ; É importante não cruzar as estrias (não                          
tocar a alça na estria anterior), para reduzir o inóculo a cada estria e obter as colônias                                  
isoladas  
-materiais: alça ou fio de platino, alça descartável e alça de drigalski;  
-esgotamento em estrias ou estrias múltiplas;  
-Há duas possíveis condutas:  
1. A placa é visualmente dividida em três setores, inicia-se a deposição das                        
bactérias num setor, depois nos outros dois restantes. Não é necessário flambar 4                        
a alça antes de um novo estriamento, entretanto, uma estria NÃO DEVE tocar a                            
outra.  
2. A técnica consiste em depositar o material em um dos polos do meio de cultivo                              
e depois espalhá-lo em 4 setores, por meio de estria em zig zag, utilizando uma                              
alça de platina. Esta deve ser flambada antes de um novo estriamento e deve                            
recarregar a alça na estria anterior, de maneira a obter quantidades                      
progressivamente menores do material.  
-O sucesso da semeadura está em:  
 a) grande número de estrias;  
 b) não perfurar o meio;  
 c) não voltar a alça sobre a estria  
 d) pegar pequena quantidade de material para semear.   
 e) SEMPRE TRABALHAR COM TODO MATERIAL PRÓXIMO À CHAMA                    
DO BICO DE BUNSEN PARA EVITAR CONTAMINAÇÃO EXTERNA NO SEU                    
EXPERIMENTO.  
 f) SEMPRE FLAMBAR A ALÇA BACTERIOLÓGICA QUANDO                
NECESSÁRIO.  
 g)DESCARTAR SWABS CONTAMINADOS EM SOLUÇÃO DE              
HIPOCLORITO DE SÓDIO À 0,5 %.   
  
4 Passar pelas chamas para desinfectar. 
  
  
  
➢ TÉCNICA DE SEMEADURA EM MEIO SÓLIDO EM PLACA (TÉCNICA                    
DE INOCULAÇÃO POR ESPALHAMENTO OU SPREAD PLATE 5 )  
-Inóculos de 0,1 ou 1,0 ml são espalhados uniformemente sobre a superfície do meio já                              
solidificado com a própria ponta da pipeta, alça bacteriológica / swab / alça Drigalsky;  
-Neste caso só crescerão colônias na superfície do meio sólido ;  
-Objetivo → obtenção de crescimento confluente, ou para contagem bacteriana ; muito                      
utilizada na realização de antibiogramas;  
5 placa espalhada; 
  
  
➢ TÉCNICA DE SEMEADURA EM MEIO SÓLIDO EM PLACA (TÉCNICA                  
DE INOCULAÇÃO POUR-PLATE OU DISSEMINAÇÃO (MÉTODO EM              
PROFUNDIDADE)  
-técnica de semeadura em profundidade;  
-permite o crescimento na superfície e dentro do ágar;  
-Transferir 1,0 ml da cultura para placa de Petri vazia, colocar 10 – 20 ml do meio                                  
fundido (e resfriado a cerca de 45 – 50°C) sobre a cultura e homogeneizar suavemente                              
com movimentos circulares , após a solidificação do meio, a placa será incubada em                          
uma estufa bacteriológica para permitir o crescimento das colônias;  
-É preciso garantir que o meio não solidifique antes da homogeneização nem fique                          
quente para não matar as células microbianas;   
-As colônias crescerão não só na superfície, como também no meio de cultura;  
-Objetivo → usado para contagem bacteriana; É utilizado também para análise de                        
microrganismos anaeróbios, adicionando uma outra camada de meio fundido após o                      
endurecimento da primeira camada;  
  
*RESUMO DAS DUAS ÚLTIMAS:  
  
  
  
  
➢ TÉCNICA DE SEMEADURA EM MEIO SÓLIDO EM TUBO (ÁGAR                  
INCLINADO)  
  
-Flambar a alça e deixar esfriar; Retirar a tampa (de rosca ou tampão de algodão) dotubo e retirar com a alça uma porção de amostra; Repor a tampa no tubo que contém a                                    
amostra; Retirar a tampa do tubo que vai ser inoculado; Introduzir a alça até a base da                                  
superfície do meio inclinado, passando-a ao longo da sua superfície em movimentos                        
de zig-zag; Fechar o tubo; Flambar a alça;  
  
ágar inclinado  
1. Estria sinuosa - semear com alça ou agulha bacteriológica, em zig-zag,                      
partindo da base para a extremidade do bizel (superfície inclinada do meio).                        
Objetivo → obtenção de intensa massa de micro-organismos;  
  
2. Picada Central - semear com agulha bacteriológica, no centro do Ágar.                      
Dependendo da finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo ou até o                            
fundo deste;   
Objetivo → verificar fermentação (metabolismo) e motilidade em algumas                  
técnicas;  
  
3. Picada em Profundidade - semear com agulha bacteriológica, no centro do                      
Ágar; Dependendo da finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo ou até                            
o fundo deste.   
Objetivo → verificar fermentação e/ou motilidade em algumas técnicas;  
  
4. Estria Reta - semear com agulha bacteriológica, fazendo uma linha reta, com                        
cuidado de não ferir o Agar, partindo da base para a extremidade do bizel                            
(superfície inclinada do meio);  
Objetivo → obtenção de pequena massa de microorganismos.  
  
  
➢ TÉCNICA DE SEMEADURA EM MEIO LÍQUIDO: (TÉCNICA DA                
DIFUSÃO DO INÓCULO)   
-Objetivo → é um repique genérico para crescimento bacteriano em meio líquido;                        
-Flambar a alça ou agulha bacteriológica e deixar esfriar;    
-Retirar a tampa (de rosca ou tampão de algodão) do tubo e retirar com alça uma                                
porção de amostra;    
-Fechar o tubo que contém a amostra;    
-Retirar a tampa do tubo que vai ser inoculado Introduzir a alça até aproximadamente                            
¼ de profundidade do meio;   
-ou inclinar levemente o tubo (cerca de 30°) e agitar a alça para dispensar o                              
micro-organismo;    
-Fechar o tubo.    
-Flambar a alça;  
-uma alça da colônia (Ágar em placa) ou da cultura (de outro meio ou líquido) é                                
introduzida no meio líquido, com agitação da alça, para maior difusão dos                        
micro-organismos (da alça para o meio e homogeneização no meio);   
  
  
RESUMO:   
  
  
➢ Técnica de Coloração de Gram  
  
-mais utilizada;  
-consiste na preparação de um esfregaço em lâmina de vidro para microscopia, de                          
preferência da porção mais purulenta/sanguinolenta da amostra;  
-No caso de líquidos corporais, pode-se realizar uma citocentrifugação para se                      
concentrar o material, obtendo assim uma melhor visualização das estruturas.   
-O processo consiste basicamente em tratar bactérias sucessivamente com cristal                    
violeta, lugol (suplemento iodado, iodo + iodeto de potássio), álcool e fucsina;   
-O cristal violeta e o lugol penetram tanto nas bactérias Gram-positivas quanto nas                          
Gram-negativas, formando um complexo de cor roxa.   
-O tratamento com álcool é a etapa diferencial;   
-nas Gram-positivas, o álcool não retira o complexo cristal violeta+lugol, pois a sua                          
ação desidratante faz com que a espessa camada de peptideoglicano torne-se menos                        
permeável, retendo o corante;  
-Nas Gram-negativas, devido à pequena espessura da camada de peptideoglicano, o                      
complexo corado é extraído pelo álcool, deixando as células descoradas;  
-O tratamento com fucsina não altera a cor roxa das Gram-positivas, ao passo que as                              
Gram-negativas descoradas pelo álcool tornam-se avermelhadas;   
-coloração de Gram é amplamente utilizada para identificar e classificar bactérias;  
  
A) Preparar o Esfregaço    
1. Utilizar um lâmina limpa e seca, flambe-a rapidamente no bico de Bunsen.                        
Identifique o lado da lâmina onde será feito o esfregaço com o auxílio do lápis                              
dermatográfico.   
2. Colocar uma gota de solução salina sobre a lâmina. Com a alça microbiológica                          
previamente flambada e fria retirar o material bacteriológico de uma colônia da                        
placa de Petri ou tubo inclinado. Homogeneizar esse material com movimentos                      
de rotação para se obter um esfregaço oval, fino e uniforme.   
3. Deixar secar próximo da chama e após seco, fixar o esfregaço passando o lado                            
oposto da lâmina rapidamente na chama do Bico de Bunsen (repetir o                        
procedimento por três vezes).  
  
B) Coloração de Gram   
1. Cubra toda a lâmina com solução de Cristal Violeta e aguarde por um minuto.  
2. Depois lavar rapidamente com água destilada.   
3. Cubra, a lâmina com solução de Lugol por um minuto e após este tempo,                            
inclinando a lâmina gotejar sobre o esfregaço a mistura de Álcool-Acetona ou                        
Álcool absoluto por 10 segundos, e em seguida lavar rapidamente em água                        
corrente.   
4. Cobrir a lâmina com solução de corante Fucsina, e após 30 segundos lavar com                            
água destilada e secar sem esfregar a lâmina com o auxílio do papel de filtro, ou                                
deixar em temperatura ambiente.   
5. Depois de seca, colocar uma gota de óleo de imersão e observar o resultado no                              
microscópio óptico sob objetiva de 100 X.