DIGESTÃO ENZIMÁTICA DE DNA E ELETROFORESE

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES 
 
ANA JULIA DE OLIVEIRA MARIANO 
BEATRIZ EGOSHI FIGUEIRA 
ISABELLE BANO BONATELLI 
JULIA CARDOSO DE BARROS LEITE 
MARIANA ARANHA GONZAGA CORREA 
NAYARA DOS SANTOS LOPES 
 
 
 
 
 
 
DIGESTÃO ENZIMÁTICA DE DNA E ELETROFORESE 
 
 
 
 
 
 
 
 
Mogi das Cruzes, SP 
2019 
 
 
UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES 
 
ANA JULIA DE OLIVEIRA MARIANO 
BEATRIZ EGOSHI FIGUEIRA 
ISABELLE BANO BONATELLI 
JULIA CARDOSO DE BARROS LEITE 
MARIANA ARANHA GONZAGA CORREA 
NAYARA DOS SANTOS LOPES 
 
 
 
 
 
 
DIGESTÃO ENZIMÁTICA DE DNA E ELETROFORESE 
 
 
 
 
 
 
Prof° Orientador :Doutora Marcella Araújo Manfredi 
 
Mogi das Cruzes, SP 
2019 
Relatório apresentado ao curso de 
Farmácia da Universidade de Mogi das 
Cruzes como parte dos requisitos de 
aprovação da disciplina de Biotecnologia. 
 
 
SUMÁRIO 
 
1.INTRODUÇÃO ....................................................................................... 4 
2.OBJETIVOS ............................................................................................ 6 
3.MATERIAIS E MÉTODOS 
3.1 MATERIAIS .................................................................................................... 7 
3.2 MÉTODOS ..................................................................................................... 8 
4.RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................. 9 
5.CONCLUSÃO ...................................................................................... 12 
REFERÊNCIAS ....................................................................................... 13 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 
 
 
1. INTRODUÇÃO 
Os plasmídeos correspondem a uma molécula de DNA circular, de fita dupla, 
extracromossômica que podem existir em bactérias e leveduras e é um dos vetores 
mais utilizados em técnicas de DNA, no qual está presente juntamente com proteínas 
e outros constituintes nas colônias das bactérias. (DAMIANO,2014) 
Apresentam de centenas a alguns milhares de nucleotídeos e replicam-se 
independentemente do cromossomo celular, podendo atingir um elevado número de 
cópias dentro da célula. Os plasmídeos geralmente apresentam genes para diferentes 
características, como genes de resistência a antibióticos, produção de toxinas e 
enzimas metabólicas e genes de conjugação bacteriana. (NONOHAY, HEPP,2017) 
Os sistemas de restrição foram caracterizados pela primeira vez em bactérias, no 
qual, nestes organismos tem a função de defesa contra vírus invasores 
(bacteriófagos). (CORDEIRO,2003). Deste modo as enzimas de restrição (ou 
endonucleases de restrição) são enzimas que apresentam a capacidade de clivar 
moléculas de DNA por meio da quebra da fita dupla. Cada enzima reconhece uma 
sequência específica de nucleotídeos, chamada de sítio de corte ou sítio de restrição, 
e apenas moléculas de DNA que apresentem essa sequência serão cortadas. 
(NONOHAY, HEPP, 2017) 
Os locais de restrição identificados pelas enzimas geralmente são compostos por 
4-6 nucleotídeos, onde cortam as ligações entre o grupo hidroxilo 3’ de um nucleotídeo 
e o grupo fosfato 5’ do nucleotídeo adjacente. (MOREIRA ,2014) 
Os principais grupos caracterizados para este grupo de enzimas são as do tipo l, 
tipo ll e tipo lll. No entanto apenas o grupo ll é o mais utilizado em engenharia genética. 
Nesta enzima ocorre apenas o corte, com sequência e formas especificas. 
(CORDEIRO ,2003) 
Dentre as aplicações das enzimas de restrição na biologia molecular e na 
engenharia genética estão: analises em RFLP (Restriction Fragment Length 
Polymorphism) para diagnóstico de doenças genéticas e mapeamento genético, AFLP 
(Amplified Fragment Length Polymorphism) para analises de divergência genética 
entre genomas, clonagem e subclonagem de fragmentos para sequenciamento, 
estudos de expressão gênica, e transformação de plantas. (CORDEIRO,2003) 
5 
 
Como técnica de digestão enzimática, a eletroforese é a mais conhecida. Segundo 
Cordeiro (2003), a eletroforese é um procedimento básico de todas as análises com 
ácidos nucléicos. Essa metodologia baseia-se no fato de que essas moléculas 
apresentam carga elétrica negativa quando solúveis em soluções aquosas. Essa 
carga é fornecida pela ionização dos grupamentos de fosfato presentes em suas 
moléculas. Essas moléculas podem migrar em um suporte sólido (agarose ou 
poliacrilamida) submetido a um campo elétrico (condição com diferença de potencial 
elétrico). Assim, os ácidos nucléicos migram em direção ao polo positivo e se separam 
dependendo do peso molecular que contêm. Moléculas pequenas tendem a migrar 
com velocidades maiores do que as grandes. 
Existem dois tipos de eletroforese, a horizontal e a vertical, empregadas para 
diferentes propósitos, de acordo com o tamanho das moléculas que permite separar. 
Assim, os fragmentos de DNA provenientes das extrações ou amplificações com 
diferença grande de comprimento são geralmente visualizados em géis de agarose 
horizontal, e as análises de microssatélites e sequenciamento de DNA são realizados 
em géis verticais de poliacrilamida. (NONOHAY,HEPP, 2017) 
Na Biotecnologia, a eletroforese dá suporte a outras técnicas tais como: clonagem 
e subclonagem de fragmentos gênicos; construção de bibliotecas genômicas e de 
DNA complementar (cDNA); análises de southern blot e northern blot, técnicas 
baseadas na amplificação via reação de polimerase em cadeia (PCR), no controle dos 
procedimentos da extração do DNA e RNA; em estudos genéticos de caracterização 
de germoplasma, mapeamento genético. (CORDEIRO, 2003) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6 
 
2 .OBJETIVOS 
Realizar a digestão enzimática simples e dupla e elaborar mapa de restrição de 
DNA plasmidial através dos dados obtidos com a eletroforese. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7 
 
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
3.1 MATERIAIS 
a) Berço para cuba de eletroforese; 
b) Béquer; 
c) Bico de Bunsen; 
d) Caneta esferográfica; 
e) Conversor de corrente elétrica; 
f) Cuba de Eletroforese; 
g) Erlenmeyer; 
h) Fita crepe; 
i) Fósforo; 
j) Micropipeta; 
k) Pente; 
l) Ponteira de plástico; 
m) Proveta; 
n) Solução tampão TBE (1x); 
o) Suporte de isopor para tubos eppendorf; 
p) Suporte para tubos de ensaio; 
q) Tripé de ferro; 
r) Tubos eppendorf. 
 
 REAGENTES 
a) Água; 
b) DNA plasmidial; 
c) ECO R1 (enzima de restrição); 
d) Bam HI (enzima de restrição); 
e) Gel de Agarose (0,8%); 
f) Brometo de etídio; 
g) Corante 50 % 
 
 
8 
 
3.2 MÉTODOS 
Iniciou-se o experimento com a marcação: “S” e “D” com caneta esferográfica nos 
tubos de eppendorf para indicar aquele com a digestão simples e digestão dupla. 
No tubo que seria iniciado a digestão simples, colocou-se 12 µL de água com auxílio 
da micropipeta e 11 µL na de dupla digestão. Em seguida, em ambos os tubos, 
adicionou-se 5 µL de DNA plasmidial e também 2 µL de enzima de restrição ECO RI 
em cada. Logo após, no tubo da digestão dupla, inseriu-se 1 µL de Bam HI. 
Levou-se os dois tubos com auxílio de um suporte de isopor para tubos eppendorf, 
para banho-maria por 30 minutos á 37ºC. Após o tempo decorrido, retirou-se do banho 
e aplicou-se 5 µL de Brometo de etídio nos dois tubos para a visualização da corrida 
no gel de agarose. 
Preparou-se o gel de agarose e em seu estado liquido ainda, colocou-se no berço 
da cuba de eletroforese, já com o pente inserido para ser formado o poço em que a 
amostra se posicionará, com o conversor de corrente elétrica para haver a corrida e 
com a fita crepe colada para que não haja vazamento. Aguardou-se até seu estado 
de solidificação para que pudesse inserir as amostras e retirou-se o pente, podendo 
visualizar a formação dos poços. 
Retirou-se a fita crepe e colocou-se o tampão TBE ao lado do berço da cuba para 
ser absorvido e as amostras foram incluídas nosdois poços respectivos com auxílio 
da micropipeta. Iniciou-se a corrida após alguns minutos de contato com o gel, e 
aguardou o resultado . 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
9 
 
4.RESULTADOS E DISCUSSÃO 
Em laboratório foram feitas digestões de DNA plasmidial com as enzimas de 
restrição Eco RI, Bam HI e Hind III. Sendo realizada a divisão de grupo por bancadas, 
foi disposto para o presente experimento a bancada de número 10. Após os 
procedimentos inicias, as digestões foram levadas para a eletroforese a fim de 
observar os resultados e visualizar o corte enzimático. Deste modo a figura 1 demostra 
os resultados obtidos . 
 Figura 1 :Mapa de restrição em gel de agarose 
 
 Fonte: Resultados obtidos em laboratório 
10 
 
Para realizar a digestão simples utilizou-se a enzima de restrição Eco RI, no qual 
obteve-se os seguintes resultados: Em 5100 pares de bases a enzima Eco RI realizou 
dois cortes, sendo eles um com 4300pb e outro com 800pb. Através destes valores 
construiu-se o seguinte mapa de restrição: 
 
Eco RI 
 
 
 
 
 
 
 
Para realizar a digestão dupla foi utilizado a enzima Eco RI e a enzima Bam HI. E 
obteve-se os seguintes resultados: Em 5100 pares de bases, foi realizado 3 cortes, 
sendo dois cortes realizados pela Eco RI e um pela Bam HI, a Eco RI realizou um 
corte de 3000pb e outro de 800 pb, já a enzima Bam HI realizou um corte de 1300pb. 
Apresentado no seguinte mapa de restrição: 
 
 
 
 
 
 
 
 
5100pb 
800p
b 
Eco RI 
Eco RI 
Eco RI 
5100 pb 3000pb 
Bam HI 
Eco RI 
1300pb 
800pb 
11 
 
Após analisar os resultados das digestões simples e duplas foi realizado uma 
digestão tripla utilizando os resultados da eletroforese, das digestões de Eco RI, Bam 
HI e Hind III. Para isso foi necessário montar o mapa de restrição de todos os grupos 
e a partir deles montar a digestão tripla. 
Na eletroforese em 5100 pares de bases, a Eco RI realizou dois cortes, a Hind III 
realizou dois cortes e a Bam HI realizou apenas um corte. 
 Dado esses resultados uma digestão tripla em 5100 pares de bases seria: 
• Eco RI: Um corte de 1300 pb e outro de 800pb. 
• Hind III: Um corte de 1000pb e outro de 500pb. 
• Bam HI: Um corte de 1500pb. 
• Eco RI+ Hind III+ Bam HI 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Bam HI 
Hind III 
Eco RI 
Eco RI 
Hind III 1500pb 
1000pb 1300pb 
800pb 
5100pb 
12 
 
5.CONCLUSÃO 
Pode-se concluir que após seguir os métodos experimentais, pode-se realizar as 
digestões simples e duplas de DNA plasmidial usando as enzimas ECO RI, BAM HI e 
RIND III. Na digestão simples, pode-se concluir que a ECO RI realizou dois cortes no 
DNA de 5100 pares de base, já na digestão dupla observou-se três cortes no DNA de 
5100 pares de base. Concluiu-se também que uma digestão tripla supondo o uso das 
três enzimas já citadas geraria 5 cortes no DNA plasmidial. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
 
REFERÊNCIAS 
 
CORDEIRO, Maria Cristina Rocha. Engenharia genética: Conceitos básicos, 
ferramentas e aplicações. Planaltina-DF: Embrapa, 2003. 25 p. Disponível em: 
https://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/568132/1/doc86.pdf. Acesso 
em: 19 set. 2019. 
DAMIANO, Deborah Kohn. Extração de DNA Plasmidial por Técnica de 
Boiling. Congresso Nacional De Iniciação Cientifica , [S. L.], N. 14, 2014. Centro 
Universitário das Faculdades Metropolitanas Unidas, p. 2. Disponível em: http://conic-
semesp.org.br/anais/files/2014/trabalho-1000017718.pdf. Acesso em: 22 set. 2019. 
MOREIRA, Catarina. Enzima de restrição. Revista de Ciência Elementar, Portugal, 
ano 2, v. 2,2014. Casa das Ciências, p. 1. Disponível em: 
https://www.fc.up.pt/pessoas/jfgomes/pdf/vol_2_num_2_60_art_enzimaRestricao.pdf. 
Acesso em: 19 set. 2019. 
NONOHAY, Juliana Schmitt de; HEPP, Diego. Biotecnologia ll: Técnicas e análises 
de biologia molecular. [S. l.]: Grupo A, 2017. 10 p. Disponível em: 
http://srvd.grupoa.com.br/uploads/imagensExtra/legado/B/BRUNO_Alessandra_Nejar/
Biotecnologia_II/Lib/Amostra.pdf. Acesso em: 19 set. 2019