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Gisele Quagliotto Microbiologia clínica Estudo dos microorganismos causadores de doenças infectocontagiosas em humanos, seu diagnóstico clínico e laboratorial, e seus aspectos patogênicos e epidemiológicos. ➜MICROBIOTA: conjunto de microorganismos que vivem naturalmente em diversas partes do organismo humano.. ➜ FASE PRÉ-ANALITÍCA: compreende a fase de cadastro do paciente, coleta da amostra, transporte e armazenamento da mesma. ➜FASE ANALÍTICA: compreende a analíse propriamente dita.. ➜FASE PÓS-ANALÍTICA: compreende a verificação das análises realizadas na fase analítica, além do envio/entrega dos resultados ao paciente e ao médico. Na microbiologia são analisados microorganismos geralmente procariontes. Ou seja, microorganismos com organização estrutural simples, DNA não organizado e reprodução rápida. No caso de bactérias, a parede celular destas é capaz de fazer sua diferenciação em bactérias gram positivas e gram negativas. As bactérias gram positivas apresentam uma parede celular mais espessa e com uma grande quantidade de peptideoglicanos. Durante o processo de coloração, essas bactérias se coram de roxo/azul. Já bactérias gram negativas apresentam uma parede celular mais fina e com menor quantidade de peptideoglicanos, e assim durante a coloração se coram de vermelho/rosa. ➜Como lembrar das cores das bactérias na coloração de Gram: 👎 Quando as finanças vão mal, dizemos que tudo está no VERMELHO, logo NEGATIVO. 👍Quando as coisas vão bem, dizemos que conseguimos terminar o mês no AZUL, logo POSITIVO . A coloração de Gram foi descoberta por Cristian Gram em 1884, quando ele descobriu que poderia corar as bactérias e que estas adquiriam cores diferentes. O método consiste em aplicar corantes em uma lâmina contendo o material que se quer analisar, e assim, as bactérias presentes adquirirão cor, fazendo com que a identificação das mesmas se torne mais fácil. As etapas da coloração de Gram são as seguintes: Gisele Quagliotto ➜ Aplicar o corante cristal violeta na lâmina e aguardar 1 minuto. ➜Lavar a lâmina com água destilada. ➜Cobrir a lâmina com lugol e aguardar 1 minuto. ➜Lavar a lâmina novamente com água destilada. ➜Cobrir a lâmina com álcool e aguardar 30 segundos. ➜Lavar novamente com água. ➜Cobrir a lâmina com fucsina( ou safranina) e aguardar 30 segundos. ➜Lavar a lâmina novamente e deixar secar, para realizar a visualização em microscópio. As bactérias podem se apresentar de diversas formas,sendo que podem estar sozinhas ou agrupadas. Elas podem se apresentar sozinhos na forma de cocos,bacilos ou espirilos. Ou agrupados como na forma de diplococos ou estreptococos por exemplo. IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM POSITIVOS ➜Staphylococcus spp. ➜Streptococcus spp.. ➜Enterococcus spp. O primeiro passo para identificação de bactérias é a realização de esfregaço para visualizar a presença ou ausência de bactérias. Também é realizado quando necessário a inoculação da amostra em meios de cultura.. Após a realização das lâminas, é realizada a observação destas em microscópio onde no laudo será reportado a presença ou ausência de microorganismos, e quando presentes será descrita a morfologia observada.. Por exemplo: “Presença de cocos gram positivos em cachos sugestivos de Streptococcus spp.” Quando cocos gram positivos são encontrados, existem diversas provas de identificação que podem ser realizadas para comprovar a etiologia daquele microorganismo. PROVA DA CATALASE: consiste em colocar a amostra de bactérias em contato com o peróxido de hidrogênio e pesquisar a formação de bolhas.. Formou bolhas = + Não formou bolhas = - Catalase positiva indica ➜ Staphylococcus spp ou micrococcus spp. Catalase negativa indica ➜ Streptococcus spp ou Enterococcus spp. TESTE DA COAGULASE: tem como objetivo a separação de Staphylococcus de importância clínica, neste caso, Staphylococcus aureus. Consiste na observação da formação de coágulos na amostra. Presença de qualquer grau de coágulo indica resultado POSITIVO, assim indicativo de Staphylococcus aureus. Ausência de coágulos iindica resultado NEGATIVO, assim indicativo das demais espécies de Staphylococcus. Gisele Quagliotto TESTE DE DNASE: este teste também visa diferenciar a presença de Staphylococcus aureus de outros tipos bacterianos, por meio da utilização do ágar DNAse juntamente com o HCl. Dessa forma, o Staphylococcus aureus possui uma enzima extracelular chamada desoxirribonuclease que tem a capacidade de degradar o DNA. Quando houver a presença de uma zona transparente ao redor da colônia significa um resultado POSITIVO, logo, existe a presença do microorganismo pesquisado. Caso não haja essa precipitação, o ágar seguirá intacto e assim, NEGATIVO para Staphylococcus aureus. TESTE DA NOVABIOCINA: tem como finalidade separar cepas de Staphylococcus saprophyticus das demais cepas. O Staphylococcus saprophyticus é novabiocina resistente e é a única espécie isolada em humanos como causadora de infecções urinárias. A amostra é semeada como um antibiograma, e um disco contendo novabiocina é colocado no teste.. A ausência de halos de inibição ou halos menores de 15 mm é considerado um resultado POSITIVO, ou seja, a bactéria é RESISTENTE, logo, entende-se que o microorganismo em questão é o Staphylococcus saprophyticus. Halos maiores que 15 mm considera-se um microorganismo sensível, ou seja, as demais espécies de Staphylococcus. TESTE DE HEMÓLISE EM ÁGAR-SANGUE: tem como finalidade a identificação do Streptococcus pneumoniae das demais cepas de streptococcus. O resultado da inoculação das bactérias em ágar-sangue podem ser separados em três formas: alfa, beta e gama- hemolítico. Alfa hemolítica ➜ o microorganismo é capaz de realizar uma hemólise parcial, podendo ser observado uma coloração cinza- esverdeado ao redor da colônia, sendo sugestivo a presença do Streptococcus pneumoniae. Beta- hemolítico ➜os microorganismos nesse caso geram uma lise completa das hemácias ao redor da colônia, sendo observado uma zona transparente ao redor dessas colônias. Pode ser sugestivo de Streptococcus pyogenes ou Streptococcus agalactine. Gama hemolítico ➜ neste caso não existe hemólise, logo, entende-se que os microorganismos contidos naquele colônia são não hemolíticos. TESTE DE BILE SOLUBILIDADE: este teste também tem como finalidade de detectar a presença de Streptococcus pneumoniae.. Ao adicionar os sais biliares a amostra, caso exista a presença do S. pneumoniae a suspensão ficará límpida, pois esses sais tem a capacidade de lisar o microorganismo. Caso a suspensão fique turva, é um resultado negativo para esse microorganismo. Gisele Quagliotto TESTE DE CAMP ou CAMP TEST: tem como finalidade a identificação de cepas de Streptococcus agalactiae. TESTE DE BACITRACINA : tem como finalidade diferenciar Streptococcus pyogenes de outras cepas. É um teste realizado em ágar-sangue de carneiro e colocado um disco de bacitracina, onde caso haja qualquer tipo de halo de inibição ao redor do disco é considerado como sensível e indicativo de S. pyogenes. TESTE DE OPTOQUINA: este teste tem como finalidade a detecção da presença de Streptococcus pneumoniae, onde um disco impregnado com optoquina é colocado em uma placa contendo a amostra a ser pesquisada, e caso haja qualquer tipo de halo de inibição é considerado sensível e indicativo de S. pneumoniae. TESTE NaCl 6,5% : é um teste utilizado para separar Enterococcus spp, que são NaCl 6,5% positivos de Streptococcus spp que são NaCl 6,5% negativos. O meio utilizado é o caldo BHI que normalmente apresenta 0,5% de NaCl sendo que para este teste é acrescentado ao calco NaCl até atingir a marca de 6,5%, criando um meio de crescimento adequado para os Enterococcus spp. Casohaja turvação ou mudança de coloração do meio, o resultado é considerado POSITIVO, e sugestivo de Enterococcus spp. Caso não haja alterações o resultado é considerado NEGATIVO, sugestivo de Streptococcus spp, principalmente S. viridans ou pneumoniae.. INDETIFICAÇÃO DE BACILOS GRAM NEGATIVOS FERMENTADORES( ENTEROBACTÉRIAS) E NÃO FERMENTADORES. As enterobacterias são microorganismos fermentadores que habitam nossa microbiota intestinal, como a Klebsiela, Enterobacter, Proteus e outros..... Porém algumas enterobacterias são consideradas patogênicas e podem causar infecções intestinais, sendo que estas não fazem parte da nossa microbiota intestinal. As gêneros de enterobactérias de maior interesse clínico estão listadas abaixo: ➜Escherichia, principalmente E. coli. ➜Shigella, como S. soneii, S. dysenteriae, S. flexenere e S. boudyi. ➜Salmonella. ➜Yersinia... A amostra que se quer analisar nesses casos é semeada em ágar Mc Conkey, que é um meio destinado ao crescimento de bactérias Gram negativas e ainda indicar a fermentação de lactose por esses microorganismos. ➜Colônias fermentadoras de lactose deixam o meio ROSA. ➜Colônias não fermentadores de lactose deixam o meio AMARELO CLARO. Após crescimento observar a coloração do meio, sendo que se apresentar cor rosa, as enterobactérias são lactose positiva, sendo sugestivo de Escherichia coli,Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella. Se o meio apresentar cor amarelo claro, as enterobactérias são lactose negativa, sendo sugestivo de Salmonella, Shigella, Proteus,Citrobacter.... Outro teste que pode ser realizado para diferenciação de enterobacterias de bacilos não-fermentadores é o teste da oxidase, que se negativo indica enterobacterias, caso positivo indica bacilos não-fermentadores como a Pseudomonas sp.. Diversas provas bioquímicas podem ser realizadas para a identificação de enterobactérias, os quais estão listados abaixo: 1- Fermentação da glicose 2- Fermentação da lactose. 3- Motilidade. 4- Utilização do citrato. 5- Descarboxilação da lisina. 6- Produção de sulfeto de hidrogênio (H2S) 7- Produção de gás (CO2). 8- Oxidase. 9- Produção de indol. 10- Produção de uréase. 11- Produção de fenilalanina desaminase. 12- Produção de gelatinase ou DNAse. Gisele Quagliotto IDENTIFICAÇÃO DE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS NÃO FERMENTADORAS As principais bactérias gram negativas não fermentadoras que causam infecções em seres humanos são a Pseudomonas spp, Acinetobacter spp, Complexo Burkholderia, Stenotrophomonas spp e Chryseibacterium spp. As provas de identificação mais utilizadas para esse tipo de bactéria são o rugai e a prova de oxidase. O rugai é uma prova que presume a não fermentação da glicose pela via fermentativa,dessa forma, se o tubo continuar inalterado, significa que existem essas bactérias naquele meio. O antibiograma é um teste muito importante para que exista a melhor escolha de tratamento para o paciente. O primeiro passo para identificação de uma bactéria é a bacterioscopia, que quando esta tem um resultado positivo o material deve ser enviado para a cultura, onde o microorganismo será identificado e dessa forma, o antibiograma será realizado. BACTERIOSCOPIA ➜ CULTURA ➜ IDENTIFICAÇÃO ➜ ANTIBIOGRAMA ➜ ORIENTAÇÃO As metodologias mais utilizadas para realização do antibiograma são a metodologia de disco-difusão, o E-test e pelo método de concentração inibitória mínima. Os antibióticos escolhidos para o teste primeiramente são as drogas chamadas de grupo A, que são as drogas de primeira escolha. Depois, são utilizadas drogas do grupo B que seriam de segunda escolha. E caso as drogas dos grupos A e B não sejam efetivas, as drogas de grupo C serão testadas. IMPORTANTE: para tratamento de primeira escolha é preferível que se use agentes bacteriostáticos e caso estes não forem efetivos, utilizar os agentes bactericidas. IMPORTANTE ²: antibióticos do mesmo grupo/classe teoricamente deveriam apresentar o mesmo resultado, no caso resistência ou sensibilidade. MÉTODO DE DISCO DIFUSÃO: método com baixo custo, praticidade e facilidade de execução. Os meios mais utilizados são o meio ágar Müller-Hinton ou o ágar sangue, onde nesses meios são dispostos discos com antibióticos impregnados e incubadas essas placas a 35ºC de 16 a 18 horas. O resultado é lido através de uma régua ou parquímetro para medir os halos de inibição de cada disco e assim definir se a bactéria presente é sensível ou resistente aos antibióticos dispostos. E-TEST: este é um método quantitativo que avalia a sensibilidade de um microorganismo aos medicamentos antibióticos. São utilizados o ágar Müller-Hinton ou ágar-sangue, onde fitas contendo os antimicrobianos são colocados na placa contendo o microrganismo e esta é incubada a 35ºC de 16 a 18 horas. Após a incubação, ler os halos de inibição formados. A coprocultura, também conhecida como cultura de fezes tem como objetivo diagnosticar as gastroenterites que podem ser causadas por bactérias, fungos e vírus. Alguns cuidados devem ser tomados na coleta da amostra para esse exame, como por exemplo evitar o uso e o contato da amostra com papel higiênico e preconizar que esse material chegue ao laboratório em no máximo 1 hora após a coleta. No caso de crianças que necessitem a coleta em fraldas, utilizar as fraldas do lado contrario e transferir a amostra para o frasco imediatamente após a evacuação. Os principais patógenos encontrados neste tipo de amostra são a Salmonella, a Shigella e Escherichia coli. Os meios de cultura mais utilizados são : ➜Ágar Mc Conkey ➜Ágar SS ➜ especifico para Salmonella e Shigella. ➜Ágar XLD ➜meio cromogênico, que gera cor na presença das bactérias PROCEDIMENTOS EM COPROCULTURA Gisele Quagliotto MATERIAL UTILIZADO ➜ FEZES ⬇️ UTILIZAÇÃO DE CALDOS DE ENRIQUECIMENTO ( PROMOVEM O CRESCIMENTO DE BACTÉRIAS) ⬇️ ⬇️ CALDO GN CALDO SELENITO 6 a 8 horas a 36ºC 18 a 24 horas ideal a 36ºC ( Por questões de tempo, fica somente de 6 a 8 horas.) ⬇️ ⬇️ Ágar Mc Conkey Ágar Mc Conkey ou SS 18 a 24 hrs a 36ºC 18 a 24 hrs a 36ºC ⬇️ ⬇️ ANÁLISE DAS COLÔNIAS SUSPEITAS ⬇️ REALIZAÇÃO DE PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO ⬇️ IDENTIFICAÇÃO SOROLÓGICA ⬇️ ANTIBIOGRAMA São considerados líquidos biológicos estéreis o líquido cefalorraquidiano ou líquor e o sangue. O líquor tem como funções a proteção mecânica do SNC, proteção biológica contra agentes patológicos e atua como carreador de metabólitos essenciais para os tecidos nervosos. As principais patologias que podem atingir o SNC são a meningite e a encefalite,sendo a meningite a mais comum. Os principais exames realizados no líquido cefalorraquidiano para detecção de patógenos são os exames físicos que irão avaliar cor e aspecto da amostra.; Exames citomorfológicos que irão contabilizar as células e hemácias presentes nesse liquor; Os exames bioquímicos que irão determinar glicose, proteínas totais e lactato; Além da realização de bacterioscopia ( Gram), hemocultura, contra umunoeletroforese e aglutinação em látex( técnica imunológica). Quando existir infecções VIRAIS: 0-500 leucócitos, células mononucleares no início da infecção ( caso infecção por enterovírus, ocorre predomínio de células polimorfonucleares). Proteínas – normais ou pouco aumentadas, Glicose – normal Lactose- normal Quando existir infecções BACTERIANAS: >500 leucócitos, polimorfonucleares Proteínas > 100 mg/dL Glicose– diminuída Lactato- aumentado. Quando existir infecções fúngicas: Até 500 leucócitos, com perfil misto Proteínas >500 mg/Dl Glicose – normal ou diminuída Lactato – aumentado. HEMOCULTURA A hemocultura ou cultura de sangue tem como objetivo investigar infecções causadas por fungos e bactérias. Microorganismos aeróbicos são a grande maioria dos casos, pelo sangue ser oxigenado. Já microorganismos aeróbicos são raros. Para hemocultura são coletadas de 2 a 3 amostras de diferentes sítios, com um intervalo de tempo que varia de 30 minutos a 1 hora. Para análise podem ser utilizados sistemas manuais ou automatizados, sendo que em sistemas automatizados a incubação é mais curta e a positividade pode ser detectada com <48 horas, porém se trata de um processo com um valor maior. Já sistemas manuais tem um custo menor, mas são mais demorados, com incubação de até 7 dias e possuem maior possibilidade de contaminação. Quando detectadas hemoculturas positivas,realizar esfregaço sanguíneo e coloração de Gram Gisele Quagliotto Também conhecida como lepra, é uma doença infectocontagiosa causada pelo bacilo Mycobacterium leprae, sendo uma doença que atinge a pele e nervos periféricos. Se trata de um problema de saúde pública, atingindo 1,56 indivíduos a cada 10 mil habitantes. É uma doença curável, porém de longo tratamento. A transmissão ocorre através das vias aéreas superiores e a via de penetração também se trata das vias aéreas superiores. A incubação pode ser longa, de 2 a 5 anos sem qualquer tipo de manifestação. Quando há positividade de um paciente, o resto da família deve realizar o exame já que o adoecimento está ligado ao tempo de exposição. O diagnóstico é realizado por meio de anamnese e posteriormente baciloscopia para comprovação. A baciloscopia é realizada a partir de raspados intradermicos coletados dos dois lóbulos da orelha, dos dois cotovelos e da lesão, se houver. O tratamento é realizado a partir de antibióticos, de uso no mínimo por 6 meses. TIPOS DE HANSENÍASE ➜Hanseníase indeterminada: é a forma inicial da doença, onde as baciloscopias de pele não revelam bacilos, logo se trata de uma forma paucibacilar e não-contagiante ➜Hanseníase tuberculóide: Também não apresentam bacilos, logo é uma forma paucibacilar. Nesta etapa existe uma forte resposta imune celular. ➜Hanseníase virchowiana: caso mais grave da doença, onde já existem diversas manchas hipocrômicas espalhadas pelo corpo e formação de pápulas e nódulos. A baciloscopia nesse caso é positiva sendo um caso multibacilar. ➜Hanseníase dimorfa: aparecimento de lesões características das formas tuberculóide e virchowiana , com acomentimento neurológico e áreas de anestesia.
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