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◗ Introdução A indústria do biocontrole vem-se expandindo rapidamente nos últimos anos, impulsionada principalmente por uma crescente tendência de diminuição no uso de produtos químico-sintéticos na agricultura. Padrões cada vez mais rigorosos estão sendo exigidos para que inseticidas, acaricidas e outros produtos químicos possam ser liberados para comercialização, levando em conta principalmente o impacto sobre o ambiente e a saúde do consumidor. Com isso, o custo atual para o desenvolvimento de um inseticida ultrapassa 100 milhões de dólares e exige um período de, no mínimo, dez anos para que todos os testes de segurança sejam rea- lizados. Segundo van Lenteren (2001), nesse mesmo período de dez anos é possí- vel implementar um programa eficiente de controle biológico, com um custo de 2 milhões de dólares, obtendo-se uma relação custo/benefício de 1:20 contra apenas 1:2 do controle químico. Essa realidade tem encorajado vários empresários a investir nesse ramo do agronegócio, e hoje já existem biofábricas comercializando mais de 125 espécies de inimigos naturais no mundo. Na Europa, 26 empresas comercializam cerca de 80 espécies de inimigos naturais para uso principalmente em cultivos protegidos (casas de vegetação), abrangendo uma área superior a 14 mil hectares (Parra, 2001). Nos CONTROLE DE QUALIDADE EM CRIAÇÕES MASSAIS DE PARASITÓIDES E PREDADORES Introdução 295 Criação massal versus controle de qualidade 296 Componentes de qualidade 297 Modificações sofridas por populações de laboratório 299 Aspectos genéticos envolvendo inimigos naturais em criações massais 301 Programas de controle de qualidade: um exemplo com Trichogramma 303 Considerações finais 308 295 ◗ LUSINÉRIO PREZOTTI Faculdade de Ciências Agrárias, Faag/Univale, 35020-220, Governador Valadares, MG ◗ JOSÉ ROBERTO P. PARRA Departamento de Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola, Esalq/USP, 13418-900, Piracicaba, SP c c c c c c c 17 CONTROBIOLOG¥Cap.17 21/5/02 8:42 AM Page 295 EUA são comercializadas 130 espécies e na Colômbia, segundo Velásques (2001), 20 empresas comercializam inimigos naturais para uso principalmente nas culturas de milho, soja, algodão e tomate (Capítulo 20). Entretanto, para que se obtenha sucesso no uso do biocontrole e se estabeleça uma tradição em sua utilização, a confiança deve ser a condição primordial. A baixa qualidade de inimigos naturais pode resultar em propaganda negativa desse méto- do de controle e comprometer todo um programa desenvolvido ao longo de mui- tos anos de pesquisa. O êxito na utilização do controle biológico dependerá da habilidade da linhagem liberada em controlar a população-alvo. O controle de qua- lidade surge, portanto, como uma peça fundamental em programas de criação mas- sal, visando identificar problemas de produção, indicar sinais de deterioração da linhagem ao longo das gerações de criação e, principalmente, garantir aos usuários desse método de controle a qualidade do produto adquirido. Leppla & Ashley (1989) definiram o controle de qualidade como o monitora- mento e controle sofisticado do complexo processo de produção para programas de criação massal que assegurem que o produto apresente qualidade razoavelmente consistente e alcance o desempenho desejado no campo. Nesse sentido, não é neces- sário idealizar uma qualidade máxima ou ótima, mas uma qualidade aceitável. Neste capítulo serão abordados alguns aspectos gerais que devem ser observados em programas de manejo da qualidade de inimigos naturais em criações massais. ◗ Criação massal versus controle de qualidade O principal objetivo de qualquer laboratório de criação massal é a produção de um grande número de inimigos naturais para subseqüentes liberações em progra- mas de controle biológico, o que exige um rigoroso controle com relação ao núme- ro e principalmente à qualidade dos insetos liberados para que se obtenha êxito (Clarke & McKenzie, 1992). A qualidade total de um inimigo natural pode ser defi- nida como a capacidade deste em executar seu papel após a liberação em campo; portanto, o objetivo do controle de qualidade é checar se a qualidade total está sen- do mantida (van Lenteren, 1991). Como para controle biológico criam-se dois insetos, o hospedeiro (natural ou alternativo) e o inimigo natural, são dois organismos que apresentam possibilidade de degeneração. Um hospedeiro de má qualidade pode produzir inimigos naturais não competitivos com os da natureza (Parra, 1992). Dessa forma, o controle de qua- lidade deve ser feito em ambos os insetos. Os três principais elementos inter-relacionados do controle de qualidade em criações massais são os controles da produção, do processo e do produto (Figura 17.1). O controle da produção é a garantia de que a criação do inseto e as operações a ela associadas estão sendo executadas, sendo o desempenho dessas operações con- trolado diretamente pelo monitoramento dos procedimentos, equipamentos e ambiente. O controle do processo refere-se ao ajuste desses procedimentos de cria- ção por meio do monitoramento do produto inacabado, comparando-o com padrões preestabelecidos. O controle do produto visa assegurar que os insetos encontram-se em condições apropriadas para tratamento, manuseio e transferência para utiliza- ção. A distribuição e o acompanhamento da eficiência no controle das populações- alvo são as operações finais (Leppla & Fisher, 1989). Segundo van Lenteren (1991), o controle de qualidade em programas de cria- ção massal de insetos entomófagos pode ser abordado de duas maneiras: (1) ava- lia-se a eficiência do inseto em exercer sua função e, se os resultados não são C O N T R O L E B I O L Ó G I C O N O B R A S I L : P A R A S I T Ó I D E S E P R E D A D O R E S296 CONTROBIOLOG¥Cap.17 21/5/02 8:42 AM Page 296 satisfatórios, localiza-se a causa e melhora-se o método de criação; ou (2) listam-se as mudanças que podem ser esperadas quando uma criação massal é iniciada, ava- liam-se essas mudanças e, se forem indesejáveis, melhora-se o método de criação. De acordo com o referido autor, a desvantagem do primeiro método é que ocorrem alterações que não podem ser corrigidas porque o material já está tão modificado que não é mais possível localizar a causa e os efeitos. Já o segundo método pode exigir a avaliação de um elevado número de componentes. ◗ Componentes de qualidade Os principais componentes de qualidade, segundo Bigler (1992), consistem de complexas propriedades fisiológicas e ecológicas que não têm a mesma importância e dependem do uso e do programa de liberação. A importância rela- tiva de cada atributo deve ser avaliada para cada programa de controle particu- lar e qualquer tipo de generalização pode conduzir a erros de interpretação. O conhecimento completo das propriedades ecológicas, fisiológicas e biológicas de cada relação praga/inimigo natural específica é necessário antes da avaliação dos principais componentes. Em geral, a maioria dos laboratórios de criação massal monitora a qualidade dos insetos utilizando parâmetros biológicos, como fecun- didade, viabilidade de ovos, peso de larvas e pupas, emergência, razão sexual, 297C O N T R O L E D E Q U A L I D A D E E M C R I A Ç Õ E S M A S S A I S D E P A R A S I T Ó I D E S E P R E D A D O R E S FIGURA 17.1 Subdivisões primárias do controle de qualidade verificadas na produção massal de insetos (adaptado de Leppla & Fisher, 1989) CONTROBIOLOG¥Cap.17 21/5/02 8:42 AM Page 297 mortalidade, longevidade, habilidade de vôo e competitividade de cópula (Clar- ke & McKensie, 1992). Noldus (1989) considera que a qualidade total abrange uma série de caracte- rísticas relacionadas à espécie a ser controlada, à cultura, ao clima e à estratégia de liberação a ser aplicada. Para esse autor, em programas de controle biológico por meio de liberação inundativa e inoculativa estacional, as características dese- jáveis para um inimigo natural incluem: adaptabilidade a extremos climáticos e a vários hábitats, eficiência de busca, especificidadehospedeira, discriminação do hospedeiro, utilização do hospedeiro (habilidade de matar o hospedeiro e/ou uti- lizá-lo para reprodução), capacidade reprodutiva e ausência de efeitos colaterais negativos. Na Europa, já existe uma série de normas-padrão, desenvolvidas em parceria pela Organização Internacional de Controle Biológico (IOBC) e empresários de bio- controle, para testes de qualidade em criações de diversos inimigos naturais utiliza- dos em cultivo protegido. Os testes envolvem a avaliação dos seguintes componentes de qualidade (van Lenteren, 1992): c Quantidade. Para predadores, número de indivíduos vivos por recipiente; para parasitóides, se liberados como adultos, número de insetos vivos e, se liberados na forma imatura, número de adultos emergidos após determinado período. c Razão sexual. Porcentagem mínima de fêmeas (razão com tendência de maior número de machos pode indicar condições de criação inadequadas). c Fecundidade. Número de descendentes produzidos durante determinado período (para parasitóides, também pode ser indicação da eficiência em matar o hospedei- ro). c Longevidade. Longevidade mínima em dias. c Predação. Número de presas consumidas durante determinado período (os testes de fecundidade, longevidade e capacidade de predação podem ser combinados). c Tamanho do adulto. Comprimento da tíbia posterior, algumas vezes tamanho da pupa (normalmente fornece boa indicação da fecundidade, longevidade e capaci- dade de predação). c Atividade de vôo. Vôo de curta extensão (se o inimigo natural ainda consegue voar); vôo de longa extensão associado à capacidade de predação/parasitismo (se o inimigo natural consegue voar e demonstrar bom desempenho). c Desempenho em campo. Capacidade de localizar e consumir/parasitar a presa/ hospedeiro em culturas nas condições de campo. Para cada teste são recomendadas condições de temperatura, umidade relativa e fotoperíodo específicos, exigindo-se ainda dos fornecedores de insetos a especificação da data de validade de cada remessa na embalagem do material, assim como todos os números/razões/tamanhos etc. obtidos para as variáveis descritas anteriormente. Técnicas mais sofisticadas, como eletroforese, eletrorretinografia e olfatome- tria, também têm sido usadas para avaliar a qualidade de insetos e identificar a deterioração de linhagens (Clarke & McKensie, 1992). No aspecto molecular, o per- fil isoenzimático e mesmo as recentes técnicas de DNA como RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) e microssatélites (SSR – Single Sequence Repeats), demonstram potencial como métodos para caracterização da qualidade de linha- gens e espécies. C O N T R O L E B I O L Ó G I C O N O B R A S I L : P A R A S I T Ó I D E S E P R E D A D O R E S298 CONTROBIOLOG¥Cap.17 21/5/02 8:42 AM Page 298 ◗ Modificações sofridas por populações de laboratório Segundo van Lenteren (1991), grande parte dos obstáculos encontrados em programas de produção massal poderia ser evitada com a criação dos inimigos naturais sob condições tão naturais quanto fosse possível. Na maioria dos progra- mas comerciais de criação massal, a planta hospedeira utilizada é diferente da cul- tura na qual o controle biológico será aplicado, assim como ocasionalmente as espécies de hospedeiro/presa são distintas das espécies-praga a serem controladas (van Lenteren & Woets, 1988). Outro fato relevante é a utilização, normalmente, de apenas uma espécie de presa/hospedeiro na criação massal e, caso esta apresen- te deficiência em um ou mais nutrientes, pode levar a carências específicas ou qua- lidade subótima. Neuenschwander et al. (1989) citam como fator de sucesso para o estabeleci- mento, dispersão e eficiência do parasitóide Apoanagyrus lopezi (De Santis) (Hyme- noptera, Encyrtidae) no controle da cochonilha da mandioca Phenacoccus manihoti Matile-Ferrero (Hemiptera, Pseudococcidae), na África, a produção de um núme- ro suficiente de microimenópteros de alta qualidade. Segundo os autores, a criação de A. lopezi em seu hospedeiro natural e na planta hospedeira original sob condi- ções próximas às de campo pode ter sido a mais importante contribuição para a manutenção de sua qualidade. Além disso, o momento de liberação, o tamanho da população liberada, a fase preferida do hospedeiro, a alimentação do hospedeiro e outras exigências nutricionais, a capacidade reprodutiva, o superparasitismo e o tempo de desenvolvimento foram levados em conta para uma eficiente criação, estocagem e transporte. Os insetos e plantas estudados, a tecnologia desenvolvida e a cuidadosa supervisão contribuíram para a boa qualidade, que em liberações ino- culativas é mais importante do que o uso de elevado número de parasitóides. Entretanto, mesmo em criações sob condições próximas às naturais, alguns obstáculos que podem influenciar a qualidade dos inimigos naturais ainda persis- tem (van Lenteren, 1991), a saber: • a mudança comportamental como resultado da criação em condições artifi- ciais ou em hospedeiros ou meios artificiais. Os inimigos naturais podem mudar suas reações com relação às pistas do hospedeiro ou da planta hospe- deira, como resultado de um condicionamento pré-imaginal ou imaginal; • a falta de técnicas que evitem uma pressão de seleção, conduzindo a uma deterioração genética dos organismos produzidos massalmente. Em função dessa deterioração, os inimigos naturais podem perder sua eficiência; • a infecção por patógenos, conduzindo a alta mortalidade, desenvolvimento prolongado, adultos menores, ampla flutuação na qualidade dos insetos e efei- to patológico direto. A criação do inimigo natural por muitas gerações sob condições uniformes e em hospedeiros inadequados pode comprometer a tolerância às condições naturais extremas e ocasionar a perda da preferência pelo hospedeiro-alvo (Smith, 1996). Cônsoli & Parra (1995) observaram que condições térmicas flutuantes foram mais adequadas para o parasitismo de Trichogramma galloi Zucchi do que condições de temperatura constante, mesmo no caso de temperaturas abaixo da mínima ótima (20ºC). No entanto, embora as criações sob condições térmicas flutuantes sejam recomendadas, estas são difíceis de serem utilizadas quando se trata de criações comerciais. A perda da preferência pelo hospedeiro-alvo é uma área controvertida, já que esse efeito tem sido demonstrado para algumas espécies, mas não para outras (como Trichogramma) (Smith, 1996). 299C O N T R O L E D E Q U A L I D A D E E M C R I A Ç Õ E S M A S S A I S D E P A R A S I T Ó I D E S E P R E D A D O R E S CONTROBIOLOG¥Cap.17 21/5/02 8:42 AM Page 299 A falha dos parasitóides liberados em “assumir” um comportamento de busca do hospedeiro freqüentemente contribui para sua dispersão prematura e conse- qüente falha no controle adequado da praga-alvo. Resultados de estudos de labo- ratório e campo conduzidos por Gross et al. (1981) demonstraram que a pré-exposição de fêmeas de Trichogramma pretiosum Riley (Hymenoptera, Tricho- grammatidae) a ovos de seu hospedeiro natural, Helicoverpa zea (Boddie) (Lepidop- tera, Noctuidae), antes da liberação, levou a um aumento significativo (cerca de seis vezes) no tempo gasto pelo parasitóide na busca do hospedeiro, em estudos de laboratório, e na taxa de parasitismo, em condições de campo. Tentativas para conter essa perda de preferência incluem a determinação de limites máximos para o número de gerações criadas em laboratório e a alternância periódica de hospedeiros, ou ambas. Na Suíça, Trichogramma brassicae Bezd. é cria- do por no máximo seis gerações sobre Anagasta kuehniella (Lepidoptera, Pyralidae); se mantido por mais tempo, tal hospedeiro é trocado pelo hospedeiro-alvo. Essa troca pelo hospedeiro-alvo ou qualquer hospedeiro alternativo também é reco- mendada na Alemanha, Austrália e Rússia, embora, em alguns casos, os problemas de parasitismo possam ocorrer nas gerações iniciais (Smith, 1996). Métodos de armazenamento são vitais para programas comerciais de criação massal, já que os produtores deparam com problemas de planejamentoda produ- ção e de imprevisibilidade de demanda (Steinberg et al., 1991), devendo-se atentar para a influência desses métodos na qualidade do inimigo natural produzido. Couillien & Grégoire (1994) observaram que o armazenamento de adultos do predador Rhizophagus grandis Gyll. (Coleoptera, Rhizophagidae) a 3-7ºC ocasionou uma perda de 81% na capacidade de início de vôo desse predador em experimen- tos realizados em túnel de vento. Da mesma forma, mudanças no método de cria- ção ocasionaram um significativo efeito na capacidade de “decolagem” dos descendentes. Schelt et al. (1991), combinando o armazenamento a frio com testes de fecundidade para Aphidoletes aphidomyza (Rondani) (Diptera, Cecidomyiidae), demonstraram que, embora a taxa de emergência permaneça alta, a oviposição decresce de 48 ovos por fêmea, quando não armazenada, para 22 ovos após uma semana e para nenhum após duas a três semanas de armazenamento. Além dos obstáculos já descritos, deve-se atentar para o fato de que as carac- terísticas desejáveis para a criação massal de um inimigo natural são geralmente contrárias àquelas necessárias a seu bom desempenho em condições de campo Bartlett (1985) fez referência a 18 fatores que podem afetar a qualidade do inseto transferido do campo para o laboratório (Capítulo 9). Da mesma forma, van Lenteren (1991), com base em diferentes autores, listou alguns desses principais fatores: • populações de laboratório são mantidas em condições ambientais constantes com fatores abióticos estáveis (luz, temperatura, vento, umidade) e fatores bióticos constantes (alimento, ausência de predação e parasitismo), não exis- tindo seleção para superar situações inesperadas de estresse. Os resultados são uma mudança no critério que determina a adaptabilidade e uma modificação de todo o sistema genético; • não existe competição interespecífica em populações de laboratório, o que leva a uma possível modificação na variabilidade genética; • as condições de laboratório são adequadas para uma média ou, às vezes, para os genótipos mais fracos. Não é possível escolher o ambiente, já que todos os indivíduos são confinados sob as mesmas condições. O resultado é um possí- vel decréscimo na variabilidade genética; C O N T R O L E B I O L Ó G I C O N O B R A S I L : P A R A S I T Ó I D E S E P R E D A D O R E S300 CONTROBIOLOG¥Cap.17 21/5/02 8:42 AM Page 300 • o comportamento dependente da densidade (por exemplo, eficiência de busca) pode ser afetado em situações de laboratório; • o processo de seleção para cópula pode ser modificado porque fêmeas não copuladas ou previamente copuladas terão meios restritos de escape; • características de dispersão, especificamente comportamento de vôo dos adul- tos e dispersão larval, podem ser bastante restringidas em condições de labo- ratório. ◗ Aspectos genéticos envolvendo inimigos naturais em criações massais Um dos maiores obstáculos do controle de qualidade é a detecção da perda da variabilidade genética em insetos criados massalmente. Existem dois tipos de processos que podem resultar em deterioração genética: os processos aleatórios e os não-aleatórios ou adaptativos. Desses mecanismos de deterioração, a deriva genética (ou efeito fundador), o cruzamento consangüíneo e a seleção parecem ser os mais relevantes para colônias criadas em laboratório (Mac- kauer, 1972). Segundo Wajnberg (1991), não é possível evitar esses diferentes me- canismos; no máximo, eles podem ser reduzidos. O processo de seleção atua continuamente durante o estabelecimento e manu- tenção de uma colônia. Nos primeiros estágios do estabelecimento, a seleção filtra os insetos que não conseguem se ajustar às grandes mudanças. Essa ação contribui para a deterioração genética e explica a alta mortalidade dos materiais recém-intro- duzidos. Também pode ser responsável, em parte, por algumas das reduções de tamanho que ocorrem, de tempos em tempos, em colônias criadas massalmente, sem explicação aparente (Bartlett, 1984). A deriva genética é o mais importante dos processos aleatórios que influenciam a freqüência gênica de uma colônia de laboratório, e mesmo taxas de mutações de 10-5 a 10-6 não modificam o conteúdo genético de uma população o suficiente para evitar seus efeitos (Joslyn, 1984). Em populações grandes a redução da variabilidade provo- cada pela deriva é menor do que em pequenas (Wajnberg, 1991). O tamanho numé- rico e a origem geográfica do grupo inicial estão relacionados com a reserva genética e, conseqüentemente, com a reserva de habilidades para responder a eventos aleató- rios e à seleção. Dessa forma, o potencial evolutivo da população de laboratório é essencialmente determinado quando a criação-estoque é isolada no campo (Mac- kauer, 1976). Parte da população selvagem (onde a migração gênica pode ocorrer e a diversidade ambiental é grande) é transferida para o laboratório, torna-se uma popu- lação “fechada” e todas as mudanças genéticas passam a ser feitas a partir da limitada variabilidade genética da população fundadora (efeito fundador) (Bartlett, 1984). O efeito fundador é um exemplo extremo de deriva genética (Wright, 1977). Por causa desse efeito, que é uma forma de erro de amostragem, somente parte da porção gené- tica selvagem é realmente incorporada no material do laboratório (Joslyn, 1984). O tamanho da população fundadora afetará diretamente a “quantidade” de variabilida- de que ocorrerá naquela limitada fração genética nativa (Bartlett, 1985). O tamanho da colônia inicial varia entre menos de dez e vários milhões de indivíduos, dependendo da facilidade da coleta, do tamanho do organismo e da dis- ponibilidade física para armazenamento e recepção do material. Não existe uma maneira simples ou generalizada que ajude a determinar o tamanho ótimo da amostra inicial, mas, de acordo com Mackauer (1976), uma colônia com aproxima- damente 500 indivíduos, coletados no campo em uma área convenientemente 301C O N T R O L E D E Q U A L I D A D E E M C R I A Ç Õ E S M A S S A I S D E P A R A S I T Ó I D E S E P R E D A D O R E S CONTROBIOLOG¥Cap.17 21/5/02 8:42 AM Page 301 grande, deve incluir um nível de diversidade genética que caracterize a população parental de maneira adequada para a maioria dos programas de controle biológico. Já Bartlett (1985) menciona um número mínimo de mil indivíduos, enquanto Waage (1985) considera de 250 a 500 indivíduos a quantidade adequada para se iniciar uma colônia. Entretanto, esses números baseiam-se em fundamentos teóri- cos de genética de populações, sendo necessário realizar estudos específicos para cada espécie, ou mesmo linhagem, a ser criada. Prezotti (2001) observou que cria- ções de populações sexuadas de T. pretiosum podem ser iniciadas com apenas um casal e mantidas durante, pelo menos, 25 gerações de laboratório sem que sua qua- lidade seja comprometida. Em discussões sobre a deriva genética e o endocruzamento, torna-se mais ade- quada a adoção do conceito de “tamanho efetivo da população”, representado na literatura genética como “N e ” (Roush, 1990). O tamanho efetivo da população representa, do ponto de vista da amostragem estatística, o “número genético” de indivíduos em uma população idealizada, onde a reprodução ocorre ao acaso e igual número de descendentes é produzido por indivíduo (Crow & Kimura, 1970). O N e é afetado pela razão sexual da população e pela variação no tamanho da prole (Roush, 1989). Se um indivíduo produz maior número de descendentes do que outros, ocorre uma desproporcionalidade na geração seguinte, levando a uma redução da variabilidade genética da população (Roush, 1990). Segundo Falconer (1960), para uma população diplóide, o N e pode ser calculado utilizando-se a seguinte fórmula: N e = 4N m N f /(N m + N f ) , em que: N m = número de machos; N f = número de fêmeas. Para populações haplodiplóides, como himenópteros parasitóides de reprodu- ção arrenótoca, Lí (1955) propõe a seguinte fórmula: N e = 9N m N f /(4N m + 2N f ) O N e é normalmente menor doque o número real de indivíduos com poten- cial para reprodução na população (N). Como regra geral, N e é 48-95% de N (Crow & Kimura, 1970), em condições naturais. A estrutura genotípica da população também pode ser afetada por seu sistema de acasalamento. A ocorrência de acasalamentos entre indivíduos aparentados ou cruzamentos consangüíneos implica a produção de progênie mais homozigótica em relação ao que se esperaria com acasalamentos ao acaso (pan-mixia), e esses indi- víduos homozigóticos geralmente exibem características inadequadas (Bartlett, 1984). O endocruzamento pode ser medido por meio de um coeficiente, represen- tado por “F”, o qual quantifica a perda de heterozigotos (Roush, 1990). O coeficien- te de endocruzamento está diretamente relacionado com o tamanho da população (Bartlett, 1984), sendo qualquer alteração em F, em dada geração, calculada por: F = 1/(2N e ) (Falconer, 1960). Wright (1922), citado por Falconer (1960), propôs uma fórmula de recorrência para o monitoramento do endocruzamento ao longo das gerações, na qual: F t = 1/(2N e ) + [1 – 1/(2N e )]F t-1 , sendo: F t = coeficiente de endocruzamento na geração t; N e = número efetivo de indivíduos; F t-1 = coeficiente de endocruzamento na geração t-1. C O N T R O L E B I O L Ó G I C O N O B R A S I L : P A R A S I T Ó I D E S E P R E D A D O R E S302 CONTROBIOLOG¥Cap.17 21/5/02 8:42 AM Page 302 De acordo com Joslyn (1984), para manter uma heterogeneidade satisfatória, uma colônia não deve declinar abaixo do número de insetos fundadores. Segundo esse autor, a manutenção de um alto N e reduz o efeito da deriva aleatória e dos cru- zamentos consangüíneos e ajuda a compensar a deterioração genética. Alguns predadores e a maioria dos parasitóides utilizados em criações massais com propósito de controle biológico demonstram uma baixa depressão como con- seqüência do endocruzamento, quando comparados à maior parte dos outros ani- mais (Roush, 1990). Vários desses agentes de biocontrole, especialmente os parasitóides, parecem apresentar uma rotina de cruzamentos consangüíneos na natureza, seja pela baixa densidade populacional, seja por seu comportamento nor- mal de acasalamento (Roush, 1989). De acordo com Crozier (1977), esse endocru- zamento periódico pode levar à exposição e eliminação seletiva de alelos recessivos letais e semiletais, particularmente em himenópteros de reprodução arrenótoca (haplodiplóides), em que todas as características (exceto aquelas expressas somen- te nas fêmeas) são expostas a cada geração nos machos haplóides. Chapman & Stewart (1996) constataram um coeficiente de endocruzamento de 0,757 em uma população natural de Ancistrocerus antilope (Panzer) (Hymenopte- ra, Vespidae), o que corresponde a um sistema de acasalamento com 91,3% dos cruzamentos ocorrendo entre irmãos. Legner (1979) acasalou fêmeas virgens com seus filhos (produzindo um coeficiente de endocruzamento de 50%) em duas espé- cies do parasitóide Muscidifurax (Hymenoptera, Pteromalidae) e em seguida avaliou a taxa intrínseca de crescimento (rm) dessas linhagens em comparação com linha- gens em que não ocorreu o cruzamento consangüíneo. O autor encontrou redu- ções no rm de menos de 4%. Resultados similares têm sido demonstrados para outros Hymenoptera Parasitica, como Cothonaspis boulardi (Eucoilidae) (Biemont & Bouletreau, 1980) e Dinarmus vagabundus Timberlake (Pteromalidae) (Rousse et al., 1988). Sorati et al. (1996) estudaram os efeitos do endocruzamento sobre Tricho- gramma sp., com base em medidas de fecundidade, tamanho do corpo, largura da cabeça e comprimento da tíbia posterior, e concluíram que essa espécie não está sujeita à depressão por consangüinidade. Da mesma forma, Prezotti (2001) demonstrou que populações de T. pretiosum suportam altas taxas de endocruzamen- to, em criações de laboratório, sem que reflexos degenerativos que comprometam sua qualidade sejam evidenciados em suas características biológicas. ◗ Programas de controle de qualidade: um exemplo com Trichogramma Os parasitóides do gênero Trichogramma são normalmente utilizados em libera- ções inundativas ou inoculativas estacionais, com a expectativa de efeito imediato sobre a população da praga. Portanto, são exigidos grandes números de parasitóides, de excelente qualidade, para liberações em locais e momentos exatos (Bigler, 1994). Populações para liberações inundativas são freqüentemente selecionadas com base naquelas que apresentam alta fecundidade e emergência, razão sexual com alto número de fêmeas, alta longevidade, preferência hospedeira pela praga-alvo, capa- cidade de busca e tolerância às condições climáticas. Uma população com essas características, segundo Smith (1996), é definida como de “alta qualidade”. A produção de Trichogramma de alta qualidade depende do uso apropriado de instalações equipamentos adequados e de um meticuloso controle das operações de criação (Bigler, 1994). Uma representação esquemática da possível divisão da qua- lidade total de Trichogramma em componentes principais de qualidade foi feita por Bigler (1994) (Figura 17.2), que relatou que tal divisão é necessária para selecio- 303C O N T R O L E D E Q U A L I D A D E E M C R I A Ç Õ E S M A S S A I S D E P A R A S I T Ó I D E S E P R E D A D O R E S CONTROBIOLOG¥Cap.17 21/5/02 8:42 AM Page 303 nar aqueles componentes considerados mais importantes para o desempenho no campo ou aqueles que reconhecidamente são mais suscetíveis a alterações. A divisão do controle de qualidade em três subdivisões primárias (controles da produção, do processo e do produto), proposta por Leppla & Fisher (1989), tam- bém foi adotada por Laing & Bigler (1991) e utilizada para a implementação do controle de qualidade em programas de criação massal de Trichogramma (Figura 17.3). De acordo com esses autores, o uso inicial do controle de qualidade deve ocorrer durante a seleção da população fundadora. Nesse estágio, o processo tem de ser rigorosamente delineado, podendo-se aplicar vários testes de qualidade. Em uma seqüência aproximada de dificuldade, os testes indicados para a seleção da população fundadora são: determinação da porcentagem de emergência, razão sexual, fecundidade, longevidade, duração da emergência, taxa de desenvolvimen- to, locomoção, aceitação do hospedeiro (natural e alternativo), adequação ao hos- pedeiro (natural e alternativo), tolerância à temperatura (limites térmicos), resposta funcional, capacidade de quiescência e diapausa e desempenho em semi- campo e campo. A atual recomendação do Grupo de Controle de Qualidade da IOBC para Tri- chogramma é selecionar, preliminarmente, com critérios bem rigorosos, linhagens e espécies com base em características biológicas e comportamentais (Hassan, 1994, C O N T R O L E B I O L Ó G I C O N O B R A S I L : P A R A S I T Ó I D E S E P R E D A D O R E S304 FIGURA 17.2 Importância relativa dos componentes de qualidade em relação ao objetivo da produção e uso de Trichogramma (adaptado de Bigler, 1994) CONTROBIOLOG¥Cap.17 21/5/02 8:42 AM Page 304 1997). As avaliações subseqüentes de qualidade que podem ser feitas durante os processos de criação e distribuição seriam menos intensivas e mais focalizadas em atributos que possibilitem medidas rápidas. Apesar de a variação entre populações de Trichogramma permitir a seleção de parasitóides de alta qualidade, nem sempre uma linhagem é superior em todos os atributos, sendo freqüentemente incerto se uma linhagem de alta qualidade em laboratório é sinônimo de parasitóides eficien- tes em campo. Após o término do processo de seleção, uma ou mais linhagens/espécies de Tri- chogramma passam a ser utilizadas no programa de criação massal. A IOBC indica os seguintes testes para uso durante a fase de produção: determinação da porcen- tagem de emergência, razão sexual, fecundidade, longevidade, locomoção (cami- nhamento e vôo), aceitação do hospedeiro (natural) e identificação das espécies/ linhagens (Bigler, 1994). Os índices médios recomendadoscomo padrão de quali- dade pela IOBC para Trichogramma brassicae Bezd., T. cacoeciae Marchal e T. dendroli- 305C O N T R O L E D E Q U A L I D A D E E M C R I A Ç Õ E S M A S S A I S D E P A R A S I T Ó I D E S E P R E D A D O R E S FIGURA 17.3 Controle de qualidade para produção e uso de Trichogramma criado massalmente (adaptado de Laing & Bigler, 1991) CONTROBIOLOG¥Cap.17 21/5/02 8:42 AM Page 305 mi Matsumura (teste com o hospedeiro alternativo A. kuehniella) são: parasitismo ≥ 25 ovos/fêmea em 48 horas; emergência ≥ 80%; razão sexual ≥ 0,5; longevidade ≥ 7 dias (van Lenteren, 1994). Prezotti (2001) observou que, em programas de controle de qualidade de T. pretiosum, o monitoramento das populações de laboratório pode ser simplificado, deixando-se de analisar cerca de sete variáveis biológicas, conforme recomendação da IOBC, e direcionando-se as avaliações apenas para as variáveis longevidade, parasitismo e atividade de vôo. A atividade de vôo é uma característica fundamental para o desempenho de parasitóides em condições de campo e pode ser monitorada por meio de um teste relativamente barato, rápido, de aplicação simples e preciso, que deve ser incluído como uma avaliação-padrão para medições de qualidade em populações de Tricho- gramma. O teste de vôo foi desenvolvido por Dutton & Bigler (1995) para avaliar a ati- vidade de vôo de Trichogramma brassicae Bezdenko em condições de laboratório. Os autores detectaram diferenças na atividade de vôo entre duas linhagens de T. bras- sicae criadas em laboratório, a primeira por duas gerações (F2) e a segunda por 39 (F39). O teste de vôo pode ser utilizado, potencialmente, como um indicador da qualidade de diferentes espécies de Trichogramma, bem como, com algumas modi- ficações, para outros parasitóides e mesmo predadores. A unidade-teste original, desenvolvida por Dutton & Bigler (1995), consis- te de um cilindro de PVC com 18 cm de altura e 11 cm de diâmetro (Figura 17.4A). Uma placa de Petri transparente, pulverizada com cola 24 horas antes do experimento, é colocada na parte superior do cilindro, servindo de armadi- lha para os parasitóides em vôo (a cola deve ser isenta de odores ou outras características que possam afetar o comportamento do parasitóide). A parte infe- rior do cilindro é fechada com uma tampa plástica firmemente ajustada. Inter- namente, a parte inferior e os lados são revestidos com uma folha plástica preta, de maneira a forçar a atração dos insetos em direção à fonte de luz (topo). Um anel de cola de 0,5 cm é pulverizado na região interna do cilindro a 2,5 cm da extremidade inferior como uma barreira para o caminhamento dos parasitóides. Um recipiente plástico (2 x 2 x 1 cm) contendo aproximadamente 300 ovos de A. kuehniella, parasitados por Trichogramma spp., próximos à emergência, é colo- cado na região inferior central do cilindro. A posição e o número de parasitói- des no anel de cola, na placa de Petri (“voadores”) e no fundo (“não-voadores”) são registrados e utilizados nos cálculos de porcentagens, em relação ao núme- ro total de adultos emergidos. Os parasitóides considerados “não-voadores” são observados por microscópio estereoscópico para determinar a porcentagem de indivíduos com deformações nas asas. Em função de algumas dificuldades encontradas na utilização do modelo ori- ginal, principalmente relacionadas ao escape de parasitóides, Prezotti et al. (2001) realizaram algumas modificações visando o aumento da eficiência do teste (Figura 17.4A). O modelo adaptado, denominado “modelo Esalq”, consiste de um cilindro de PVC com as mesmas dimensões do modelo original; entretanto, seu interior é pintado com tinta acrílica preta sobre uma camada de tinta látex branca, para faci- litar sua fixação (Figura 17.4A-a); com isso, substituiu-se o uso da folha plástica preta recomendada no modelo original. O fundo do tubo é vedado com um plásti- co flexível preto (maior que o diâmetro do tubo) ajustado firmemente por um disco de isopor de aproximadamente 1 cm de espessura e com o mesmo diâmetro do tubo (Figura 17.4A-b). Após o encaixe, as sobras do plástico são fixadas no exterior do tubo com elásticos, que permitem uma perfeita vedação, evitando a fuga dos parasitóides. Em função da espessura do isopor, o anel de cola, utilizado como bar C O N T R O L E B I O L Ó G I C O N O B R A S I L : P A R A S I T Ó I D E S E P R E D A D O R E S306 CONTROBIOLOG¥Cap.17 21/5/02 8:42 AM Page 306 reira, é pincelado a 3,5 cm da extremidade inferior da parede interna do modelo. Os ovos parasitados, com parasitóides prestes a emergir, são colocados no fundo de um tubo de ensaio (9,0 x 2,5 cm), que, por sua vez, é fixado no centro da região inferior da unidade-teste com fita adesiva (Figura 17.4B). A introdução do tubo de ensaio foi realizada com o objetivo de permitir que, durante o caminhamento, os parasitóides “voadores” tenham tempo suficiente para distender as asas e ultrapas- sar o anel de cola, evitando-se, assim, erros na avaliação. Os resultados obtidos por Prezotti et al. (2001) com a utilização do modelo Esalq (Tabela 17.1) evidenciam que as modificações realizadas no modelo original, recomendado pela IOBC, levam a um menor percentual de erros e sugerem que o modelo Esalq poderá vir a substituir o convencional em testes de vôo para contro- le de qualidade de populações de Trichogramma. 307C O N T R O L E D E Q U A L I D A D E E M C R I A Ç Õ E S M A S S A I S D E P A R A S I T Ó I D E S E P R E D A D O R E S FIGURA 17.4 Unidades-teste para avaliação da atividade de vôo de Trichogramma em laboratório. A - Modelo original de Dutton & Bigler (1995) com indicação (setas) dos locais em que foram realizadas adaptações: a. pintura interna preta em substituição à folha plástica preta; b. anel de cola pincelado a 3,5 cm do fundo, em vez de 2,5 cm; c. vedação do fundo com plástico preto e isopor em substituição à tampa plástica. B - Modelo Esalq. CONTROBIOLOG¥Cap.17 21/5/02 8:42 AM Page 307 TABELA 17.1 COMPARAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE DOIS MODELOS PARA AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DE VÔO DE Trichogramma pretiosum, EM LABORATÓ- RIO, COM BASE NA PORCENTAGEM DE INDIVÍDUOS CAPTURADOS EM DIFERENTES LOCAIS DAS UNIDADES-TESTE E NA PORCENTAGEM DE INDIVÍDUOS DEFORMADOS. TEMPERATURA: 25±1ºC; UMIDADE RELATIVA: 60±10%; FOTOFASE: 24 HORAS (Prezotti et al. 2001) Parâmetros avaliados Modelo População1 Média F 3 F 35 F 72 % de indivíduos capturados na tampa (“voadores”) IOBC (adaptado) 76,9 79,1 75,4 77,1 B Esalq 85,3 89,0 83,6 86,0 A Média 81,1 a 84,0 a 79,5 a % de indivíduos capturados no anel (barreira) IOBC (adaptado) 09,2 05,3 10,0 08,2 A Esalq 05,5 03,2 06,4 05,0 B Média 07,4 a 04,2 b 08,2 a % de indivíduos capturados no fundo (“não-voadores”) IOBC (adaptado) 13,9 15,6 14,6 14,7 A Esalq 09,1 07,9 10,0 09,0 B Média 11,5 a 11,7 a 12,3 a % de indivíduos com asas deformadas2 IOBC (adaptado) 29,3 a A 24,2 a A 32,6 a B 28,7 Esalq 21,0 b A 23,6 b A 47,9 a A 30,8 Média 25,2 23,89 40,22 1 Populações F 3 , F 35 e F 72 : o número refere-se à geração de criação em laboratório. 2 Porcentagem de deformados em relação ao total de parasitóides encontrados no fundo dos tubos. Médias seguidas da mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (P ≤ 0,05). Letras minúsculas: comparação entre popula- ções; letras maiúsculas: comparação entre modelos. ◗ Considerações finais A preocupação com a qualidade de inimigos naturais criados em laboratório é relativamente recente e tem aumentado bastante nos últimos anos, principalmente em função da atuação do grupo de trabalho da IOBC. Na Europa, esse grupo, atuan- do com a participação das empresas privadas que comercializam inimigos naturais, tem alcançado bons resultados com relação à padronização de normas e técnicas de controle de qualidade para os principais inimigos naturais disponíveis no mercado. As técnicas desenvolvidas pela IOBC vem sendo adotadas por empresas envolvidas com o biocontrole, não só nos países da Europa,mas em vários outros em que a cria- ção de inimigos naturais é uma atividade comercial. No entanto, é fundamental que os padrões de qualidade sejam estabelecidos, em cada país, com base em suas con- dições particulares de criação e uso desses insumos biológicos. Na Colômbia, a qua- lidade dos inimigos naturais produzidos pelos 20 laboratórios que comercializam diferentes espécies de parasitóides e predadores é fiscalizada por uma instituição governamental (ICA) com base em padrões predeterminados pela pesquisa. No Brasil, estudos direcionados ao controle de qualidade em criações de inimi- gos naturais são muito raros, em virtude da pouca tradição no uso do controle bio- lógico aplicado. Atualmente existem, no país, poucas empresas privadas comercializando inimigos naturais, ainda assim em pequena escala, estando a cria- ção de inimigos naturais praticamente restrita a atividades de pesquisa em univer- sidades e órgãos governamentais. C O N T R O L E B I O L Ó G I C O N O B R A S I L : P A R A S I T Ó I D E S E P R E D A D O R E S308 CONTROBIOLOG¥Cap.17 21/5/02 8:42 AM Page 308 A demanda, no entanto, tem sido crescente por causa das exigências do mer- cado consumidor interno e principalmente externo, com relação à qualidade dos alimentos produzidos. Alia-se a isso a confiança dos empresários do setor agrícola nos métodos de controle biológico, em função da comprovação, pela pesquisa, da eficiência de vários inimigos naturais no controle de pragas em diversas culturas e em diferentes regiões do país. Essa demanda crescente é benéfica do ponto de vista da expansão do uso do controle biológico aplicado no Brasil, mas, por outro lado, é motivo de preocupação, pois falhas no processo de criação podem levar à produ- ção de inimigos naturais de má qualidade e provocar um descrédito na eficiência desse método de controle. É imprescindível, portanto, que critérios sejam definidos para garantir a quali- dade do produto, desde a fundação das colônias de laboratório até sua utilização final. Isso envolve o desenvolvimento de técnicas de monitoramento da qualidade que detectem com precisão e rapidez a queda da qualidade dos insetos criados e, principalmente, o desenvolvimento de processos de criação que evitem ou retar- dem ao máximo essa perda de qualidade. É papel da pesquisa definir esses critérios, a fim de demonstrar para os futuros investidores desse novo ramo do agronegócio brasileiro a seriedade com que a atividade deverá ser exercida e nortear os futuros órgãos fiscalizadores, bem como os consumidores desse novo produto, sobre os padrões de qualidade que deverão ser obedecidos. ◗ Referências bibliográficas Bartlett, A.C. 1984. Genetic changes during insect domestication, p.2-8. In E.G. King & N.C. Leppla (eds.), Advances and challenges in insect rearing. 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