RELATÓRIO DA AULA PRÁTICA BIOQUIMICA: Utilização de citrato, Prova de catalase e Produção de ácidos - Meio MR VP

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UNIVERSIDADE DE CAXIAS DO SUL
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA
CURSO DE ENGENHARIA AMBIENTAL
DISCIPLINA DE BIOQUÍMICA APLICADA A ENGENHARIA AMBIENTAL
BRENDA CARMINATTI BORGES
RELATÓRIO DA AULA PRÁTICA: Utilização de citrato, Prova de catalase e Produção de ácidos - Meio MR VP
Trabalho apresentado como parte dos requisitos para obtenção da aprovação na disciplina de Bioquímica Aplicada A Engenharia AmbientalI do Curso de Engenharia Ambiental. 
Professora: Eloane Malvessi
Caxias do Sul
2012
1. INTRODUÇÃO
A prova da utilização do citrato permite diferenciar microrganismos atendendo à sua capacidade para usar o citrato como única fonte de carbono. Esta acontece no meio de citrato ou meio de Simmons.
	Na ausência de glicose ou lactose fermentáveis, alguns microrganismos são capazes de usar o citrato como única fonte de carbono para produzir energia. Esta capacidade depende da presença de citrato permease que facilita o transporte do citrato para o microrganismo. Uma vez dentro da célula o citrato é degradado pela enzima citrase, produzindo ácido oxalacético e acetato. 
O meio de Simmons contém citrato de sódio como única fonte de carbono, NH4+ como fonte de nitrogênio e o indicador de pH, azul de bromotimol. Esta prova é feita em tubos em rampa, uma vez que o O2 é necessário para a utilização do citrato. Quando o microrganismo remove o citrato do meio e o oxida, ocorre libertação de CO2. Durante esta reação o meio torna-se alcalino, pois o CO2 gerado combina-se com sódio (fornecido pelo citrato de sódio) e água para formar carbonato de sódio, que é um produto alcalino. A presença de carbonato de sódio faz aumentar o pH e virar o indicador de pH do meio de verde para azul forte. Após incubação, as culturas citrato positivo são identificadas pela presença de crescimento, na superfície da rampa, acompanhado de coloração azul no meio de cultura. Nas culturas citrato negativas a cor do meio mantém-se verde e não apresentam crescimento no meio de cultura.
	A prova da catalase tem como objetivo determinar a capacidade dos microrganismos de produzir a enzima catalase para degradar o peróxido de hidrogênio. Durante a respiração aeróbia, os microrganismos produzem peróxido de hidrogênio (H2O2). A acumulação destas substâncias leva à morte das células, a não ser que aquelas possam ser enzimaticamente degradadas, por essa razão a maioria dos microorganismos produz a enzima catalase.	
A prova do vermelho de metila tem como objetivo determinar a capacidade dos microrganismos para oxidar a glicose com produção e manutenção de concentrações altas de produtos finais ácidos. 
	Nesta prova o indicador de pH, vermelho de metila, detecta a presença de grandes concentrações de produtos finais ácidos. O pH 4, quando vermelho de metila vira para rosa escuro, o que indica uma reação positiva. Quando o pH é 6, apesar de ainda ser ácido, como há menos ions hidrogénio, o indicador muda para amarelo e é uma prova negativa.
A prova de Voges-Proskauer tem como objetivo determinar a capacidade dos microrganismos produzirem produto final acetoina, a partir dos ácidos orgânicos que resultam da metabolização da glicose. 
	A adição do reagente permite detectar a presença de acetilmetilcarbinol (acetoína) que é percursor da síntese de 2,3 butanediol, pois ocorre a formação de um complexo rosa/vermelho que dá essa cor ao meio de cultura. O desenvolvimento de uma cor rosa/vermelha na cultura, 15 minutos após a adição do reagente representa uma prova positiva. A ausência dessa cor é uma prova negativa.
	Então neste contexto os objetivos foram avaliar a aplicação de provas bioquímicas na identificação de enterobactérias (bactérias comuns no intestino de animais), avaliar a presença de enzimas nestes microorganismos e avaliar a catalase enzimática presente em microorganismos.
2. PROCEDIMENTOS UTILIZADOS
Para a prova da utilização do citrato utilizamos dois tubos de ensaio preparados com meio citrato de Simmons, contendo citrato de sódio, NH4+ como fonte de nitrogênio e azul de bromotimol como indicador de pH. Adicionamos culturas de Salmonella sp e Escherichia coli, em tubos distintos, com o uso da alça estéril. Esses foram incubados a 34°C por 72 horas.
Na prova da catalase foi colocada uma gota de peróxido de hidrogênio (água oxigenada) em cada ponta de uma lamina, com o auxilio de uma alça de platina. Na primeira agregamos culturas de Salmonella sp e a segunda recebeu culturas de Staphylococcus aureus.
	Utilizamos quatro tubos de ensaio com 5 mL de meio MR-VP (auxiliador na diferenciação de microorganismos) previamente preparados. Uma alçada de cultura foi inoculada em duplicada nos tubos, ex: 2 tubos Enterobacter e 2 tubos Escherichia coli. Esses foram incubados por três dias a 37°C.
Passado o período de incubação, duas amostras contendo Enterobacter e Escherichia coli receberam seis gotas de solução 0,4% de vermelho de metila (VM). A sua duplicata também foi submetida a teste mas ao teste de Voges Proskauer (VP), que consiste em adicionar 0,6 mL de alfa-naftol 5% em etanol 95% e, 0,2 mL de hidróxido de sódio 40%; foi preciso agitá-los durante 15 minutos.
3. RESULTADOS DE DISCUSSOES
	A prova da utilização do citrato, após a incubação, verificou-se que a coloração do meio mudou de verde para azul no microorganismo Salmonella sp, demonstrando que esta metaboliza o citrato, produz a enzima citrase. O que aconteceu foi que com a metabolização do citrato o pH subiu para em torno de 7,5 deixando o meio mais alcalino, qual fez mudar a cor. Já na Escherichia coli não ocorreu mudança demosntrando que ela não metaboliza o citrato, o meio do tubo continuou verde, pois o pH em consequencia, não mudou, continuou em torno de 6,6.
	Na prova da catalase imediatamente houve efervescência na gota contendo Staphylococcus aureus e na gota contendo Salmonella sp mostrando que peróxido de hidrogênio foi decomposto em água e oxigênio; portanto, esses microoganismos produzem a enzima catalase.
	No teste do vermelho de metila a amostra de Escherichia coli apresentou imediata coloração rosa, indicando que tal microorganismo produz e mantém uma alta concentração de ácido após a metabolização da glicose, devido ao pH menor que 4,4 (pH ácido). O meio com Enterobacter imediatamente apareceu a cor amarela, a qual mostra que a bactéria testada produz pouca quantia de ácido e os ataca posteriormente, tornando o meio neutro ou alcalino (pH acima de 6,0).
No teste de Voges-Proskauer o tubo contendo Escherichia coli apresentou um rosado claro e a amostra de Enterobacter forneceu um rosa bem escuro. Identificou-se então que Enterobacter produz acetoína, e Escherichia coli não produz.
	
	BIBLIOGRAFIA
	http://www.microbiologia.ufba.br/aulas/provas%20bioquimicas.doc
	http://microbiologiabrasil.blogspot.com.br/2009/01/prova-da-utilizao-do-citrato.html
	http://microbiologiabrasil.blogspot.com.br/2009/01/prova-vermelho-de-metila-mr.html