Aula prática FUNGOS FITOPATOGÊNICOS

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FUNGOS FITIOPATOGÊNICOS CAUSADORAS DE INFECÇÕES EM SERES HUMANAS  
Professor: Seiji Igarashi
UEL – Londrina, PR.
Fone: (043) 9994-2673
Email: seigarashi@gmail.com
Aula Prática: - Laboratório de fitopatologia
SUMÁRIO: - Informações importantes que podem auxiliar na diagnose de doenças.
Processo de amostragem ? 
Como embalar e encaminhar as amostras ao laboratório ?
 => Culturas anuais ? => Culturas perenes – como proceder ???
Procedimentos após recebimento de mostras no laboratório: - cadastramento do produtor, histórico da área, diagnóstico preliminar (visual), situação da amostra .... 
 Análise microscópica preliminar – presença ou não de estrutura do patógeno.
 => Incubação em câmara úmida/isolamento direto em meio de cultura artificial (folhas, raízes, galhos e frutos, etc.);
 => Armazenamento de materiais incubados em ambiente controlado por x dias;
 => Análise microscópica: - resultados + (confecção de laudos) ou - Teste de patogenicidade.
 Procedimento quanto às consultas via Internet: ???
 => Envio de fotografias de plantas doentes anexando histórico ...
Confecção e envio de Laudos.
Cobranças (R$) ? 
 
“Clínica de plantas”
Fitopatologia: - Phyton = planta, pathos = doença e logos = estudo
Ptto, a fitopatologia é a ciência que estuda as doenças de plantas em todos os seus aspectos, desde a:
- Etiologia - causa da doença;
- Epidemiologia – ocorrência da doença de caráter violento;
- Diagnose – reconhecimento e ou a identificação da doença;
- Sintomatologia – estuda os sintomas e sinais da doença ; e
- Manejo – Incluindo todas as etapas do ciclo da cultura, desde o planejamento, implantação da cultura, condução, até a implantação da cultura na safra seguinte. 
CONCEITOS DE DOENÇAS
A doença é o mau funcionamento de células e tecidos do hospedeiro, que resulta da sua contínua irritação por agente patogênico ou fator ambiental, e que conduz ao desenvolvimento de sintomas. - Agrios (1988), 
A doença é uma condição envolvendo mudanças anormais na forma, fisiologia, integridade ou comportamento da planta. Tais mudanças podem resultar em dano parcial ou morte da planta ou de suas partes.
CONCEITO DE DOENÇAS
Segundo Lucas et al., 1992:
 - “Doença é qualquer distúrbio que impede o
 desenvolvimento normal de uma planta e
 reduz seu valor econômico ou estético”.
PRINCIPAIS DOENÇAS DE PLANTAS CULTIVADAS
Entre as doenças infecciosas ou bióticas, causadoras de dano econômico às plantas, podemos destacar a existência de vários microorganismos, tais como: 
 Fungos; 
 Bactérias; 
 Vírus; 
 Nematóides; 
 Micoplasmas; 
 Outros.
Esses Microorganimos, a exemplo de outros seres vivos, são nutricionalmente dependentes de substratos nutricionais (alimentos) para reprodução, crescimento e sobrevivência.
A maioria das doenças de plantas é causada por microorganismos parasitas, e esses, extraem os nutrientes do hospedeiro susceptível.
 
Entre esses, os fungos são os mais comuns, os quais, ao parasitarem os hospedeiros, produzem os sintomas e sinais das doenças, e dependendo da intensidade de ataque, interferem no processo reprodutivo.
 Numa lavoura, os patógenos procuram manter-se junto ao hospedeiro vivo, aos restos de cultura e nas sementes – fonte de alimento.
Fungos:
 - Vegetal sem clorofila, cujo talo é hifa.
Bactéria: - Organismos pertencentes ao grupo de seres inferiores de dimensões microscópicas, unicelulares, de forma variada, desde a esférica até a de bastonete, reproduz-se por fissão*, e são capazes de causar decomposição de tecido vegetal.
* Fissão = Tipo de multiplicação das células na qual o talo bacteriano se divide sumariamente em duas partes, dando origem a dois indivíduos. 
Vírus: - Partículas sub-microscópicas, de elevado peso molecular e que, quando em contato com o tecido vivo, causa moléstia com rapidez.
Nematóides: - São organismos aquáticos que vivem nas águas marinhas, águas doces e películas de água do solo. A maioria é de vida livre, alimentam-se de microorganismos bactérias, fungos, algas, protozoários, pequenas minhocas ou oligoquetas. Alguns são parasitos de plantas superiores, principalmente de órgãos subterrâneos (raízess rizomas, tubérculos, bulbos e fruto hipógeno) e outros são parasitos de órgãos aéreos (caules, folhas, flores, frutos e sementes). 
Micoplasmas: - São fungos formadores de plasmódio* junto ao protoplasma** da planta parasitada.
*Plasmódio: - Estrutura vegetativa, nua, multinucleada, móvel, viva, dos mixomicetos e Plasmophorales.
 
**Protoplasma: - Substância complexa, viva, de uma célula, incluindo o núcleo.
GROSSÁRIO
Abcisão das folhas e frutos: desfolha prematura e queda de frutos.
 
Anaeróbico: Não requer oxigênio para respiração (fermentativo).
 
Anamorfo: aspecto assexual de um fungo.
Doença: é uma alteração fisiológica da planta causada por agente biótico ou abiótico, através de um processo contínuo. 
 
Doença biótica: doença de causa parasitária,proveniente de ataque de patógenos
 
Doença abiótica: doença fisiológica: doença de causa não parasitária, oriunda de distúrbios fisiológicos, fatores nutricionais, condições adversas do ambiente e prática de manejo inadequado, etc.
 
Doença iatrogênica: doença que surge na cultura em conseqüência da ação ou interferência do homem.
Exemplo: anoxia = restrição ou ausência de oxigênio; estiolamento= baixa luminosidade; deficiência ou excesso nutricional; fitotoxicidez = efeito deletério de defensivos agrícolas e salinização.
 
Infecção: é o estabelecimento de um parasita na planta hospedeira.
 
Inóculo: é qualquer estrutura de um patógeno potencialmente infectiva.
 
 Germinação do Tubo Germinativo: processo no qual os esporos ao serem estimulados emitem o tubo germinativo.
 
 Penetração: transferência do protoplasma do patógeno da superfície para o interior dos tecidos do hospedeiro. 
 
Colonização: mecanismo de invasão de células, tecidos e órgãos do hospedeiro pelo micélio ou haustórios do patógeno juntamente com a extração de nutrientes. 
GROSSÁRIO
Sítio de Infecção: é o tecido susceptível do hospedeiro. 
 
Período de Incubação: tempo desde a deposição do inóculo no sítio de infecção ate o surgimento dos primeiros sintomas. 
 
Período Latente: tempo desde a penetração do patógeno ate sua esporulação em pústulas ou em lesões. 
Período Infeccioso: tempo em que uma lesão permanece produzindo inoculo ou esporulando. 
 
Inóculo Primário: estruturas do patógeno na fase de sobrevivência. 
 
Inóculo Secundário: inóculo produzido nas infecções que ocorrem durante a estação de crescimento do hospedeiro na planta doente. 
 
Ciclo de Vida: é um estágio ou os estágios sucessivos no crescimento e desenvolvimento de um organismo que ocorre entre o surgimento e o ressurgimento do mesmo estágio do organismo. 
 
Crescimento da Doença: aumento no tempo do número de indivíduos e de órgão atacados pelo patógeno, do número de lesões por órgão e da área das lesões individuais.
 
 Fitopatometria: é a quantificação de doenças de plantas. 
 
Ciclo da Doença: é uma série de eventos que ocorrem durante a relação de patogenicidade entre patógeno e hospedeiro que leva a doença.
 
 Ciclo das Relações Patógeno Hospedeiro: é a série de fases ou de eventos sucessivos que conduz a ocorrência da doença ou que faz parte de seu desenvolvimento, composto por sobrevivência, disseminação, infecção, colonização e reprodução. 
GROSSÁRIO
 
Ciclo Primário: é a primeira geração do patógeno recém introduzido na cultura, de onde vem o inóculo, fase de sobrevivência.
 
 Ciclo Secundário: é a segunda e demais gerações do patógeno no hospedeiro, do ciclo primário em diante. Doenças Monocíclicas/Juro Simples: 1 ciclo da doença em 1 ciclo da cultura (ex: Sclerotinia).
 
Curva de progresso da doença: é um modelo matemático, ou seja, uma representação gráfica de uma epidemia (Kranz,1974). Representa todas as interações que ocorrem entre o patógeno e o hospedeiro sob a influência do ambiente (Teng & Zadoks, 1980).
 
Doenças Policíclicas/Juro Composto:vários ciclos da doença em 1 ciclo da cultura (ex: Ferrugem Asiática).
Inóculo primário: é o inóculo responsável pelo início do ciclo primário das relações patógeno hospedeiro, ou seja, é o inóculo que inicia o processo da doença em cada ciclo da cultura.
 
Sanitização: são procedimentos adotados objetivando a redução do inoculo inicial. Podemos citar como exemplos o controle cultural, físico e o químico. 
Taxa de Progresso: são interações que ocorrem entre o patógeno e o hospedeiro sob a influência do ambiente, representando a taxa de desenvolvimento da doença em função do tempo. Representa a caracterização e intensidade de uma epidemia.
IMPORTÂNCIA DAS DOENÇAS
Entre vários fatores que limitam a obtenção de alimentos de qualidade e altos rendimentos, estão as doenças. 
Fungos
Os fungos são geralmente reconhecidos, primeiramente, pela sua capacidade de decompor a matéria orgânica. 
São capazes de iniciar uma infecção em um hospedeiro normal e são capazes de colonizar o hospedeiro, encontrar um nicho microambiental com substratos nutricionais suficientes, a fim de evitar ou destruir os mecanismos de defesa do hospedeiro, e se multiplicar dentro do nicho (espaço) microambiental.
EXEMPLO DE NUMERO DE DOENÇAS POR CULTURA - DESTAQUE
 
01- ARROZ – 20 doenças => Brusone (Pyricularia oryzae)
02- BATATA – 20 doenças => Requeima (Phytophthora infestans); 
03- FEIJÃO – 25 doenças => Antracnose (Colletotrichum gloeosporioides);
04- MILHO – 42 doenças => Mancha de feosféria (Phaeosphaeria maydis);
05- MORANGO – 15 doenças => Antracnose (Colletotrichum acutatum);
06- SOJA – 50 doenças => Ferrugem asiática (Phakopsora pachyrhizi); 
07- TOMATE – 28 doenças => Requeima ( Phytophthora infestans);
08- TRIGO – 25 doenças => Brusone (Magnaporthe grisea);	
09- UVA – 15 doenças => Míldio (Plasmopara viticola).
=> TOTAL = + DE 230 DOENÇAS.
 *Portanto, conclui-se que a doença é um dos principais fatores limitantes para a produção de alimentos no mundo.
Perdas causadas por doenças e pragas entre países em desenvolvimento e países desenvolvidos, segundo GCPF – “Global Crop Protection Association”
	ALVO 	País em desenvolvimento	Países desenvolvidos
	DOENÇAS	27%	14%
	PRAGAS	38%	9%
	TOTAL	65%	23%
Exemplo de danos Causados por doenças e pragas.
Ferrugem
Brusone
Antracnose
Mildio
Diabrótica
Lagarta 
Mancha alvo
Mofo branco 
Carvões
Ferrugem
Damping off (F. solani)
Ferrugem
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Fungos
Os fungos são geralmente reconhecidos, primeiramente, pela sua capacidade de decompor a matéria orgânica.
 
São capazes de iniciar uma infecção em um hospedeiro normal, aparentemente imunocompetente e são capazes de colonizar o hospedeiro, encontrar um nicho microambiental com substratos nutricionais suficientes, a fim de evitar ou destruir os mecanismos de defesa do hospedeiro, e se multiplicar dentro do nicho microambiental.
APLICAÇÕES DOS FUNGOS 
Indústria
 => Bebidas e alimentos
 => Biodegradação 
 => Biotecnologia (fermentação e produção de enzimas)
 => Corantes e tinturas (fungos liquenizados).
Ecológicas:
 => Decomposição de matéria orgânica (decompositores de lignina, celulose, reciclagem de nutrientes em florestas)
 => Associações ecológicas: Simbiose Mutualista (Liquens (algas) e micorrizas (raízes)) e Parasitismo (micose). 
Médica:
 => Micoses: Frieira, pano branco, impigem, sapinho, candidiase, blastomicose, histoplamose, tinhas; 
 => Fornecedores de químicos na produção de antibióticos (penicilina). 
SELEÇÃO DE FUNGOS CAUSADORES DE DOENÇAS 
– 
Categoria: Gênero/Espécie
Doença
Leveduras 
Cândida albicans
Cryptococcus neoformans
Estomatite, vaginite, infecção das unhas, infecção sistêmica criptococose(infecção pulmonar, meningite, etc).
Mofo 
Espécies de Aspergillus
Espécies de Mucor e Rhizopus e outras espécies de mofo do pão
Vários dermatófitos 
Aspergilose (infecção pulmonar, infecção sistêmica)
Mucormicose (infecção pulmonar, infecção sistêmica)
Infecções o por tinhas
SELEÇÃO DE FUNGOS CAUSADORES DE DOENÇAS 
Fungos 
Dimorfos 
Blastomyces dermatitidis
Coccidioides immitis
Histoplasma capsulatum
Sporothrix shenckii
Blastomicoses (principalmente doença pulmonar e cutânea)
Coccidioidomicose (infecção pulmonar, infecção sistêmica) 
Histoplasmose (infecção pulmonar, infecção sistêmica) 
Esporotricose (doença cutânea) 
Outros 
Pneumocytis jiroveci
Pneumonia por pneumocystis (PCP)
Aspergillus 
Espécies de Aspergillus, especialmente Aspergillus fumigatus, causam infecções na pele, nos olhos, nos ouvidos e em outros órgãos, bem como “bola fúngica” nos pulmões e aspergillus e alérgica broncopulmonar. 
Espécies de Aspergillus existem somente como fungos filamentosos; eles não são dimórfos. Possuem hifas septadas que formam ramificações (dicotomizadas) em forma de v. 
Transmissão 
Estes fungos filamentosos estão amplamente distribuídos na natureza. Eles crescem na vegetação em deterioração, produzindo cadeias de conídios. A transmissão se dá por conídios carregados pelo ar.
Tratamento e prevenção 
A aspirgilose invasiva é tratada com anfotericina B, mas os resultados podem ser insatisfatórios. 
A. Caspofungina pode ser eficaz em casos de aspergilose invasiva que não responde à anfotericina 
B. Pacientes com ABPA podem ser tratados com esteróides e agentes antifúngicos. Não há meios específicos de prevenção. 
Aspergillus é um gênero de fungos que apresenta coloração branca amarelada com formação de pedúnculos e uma ponta colorida. São importantes agentes decompositores de alimentos.
São utilizados na produção de alimentos e produção comercial de ácido cítrico, glucônico e gálico. Existem mais de 200 espécies encontradas na natureza. O Aspergillus foi catalogado em 1729 pelo padre italiano e biólogo Pietro Antonio Micheli. Observando o fungo no microscópio, Micheli lembrou-se da forma de um aspergillum (borrifador de água santa), e nomeou a espécie de acordo com o objeto. As espécies de Aspergillus são aeróbicas e encontradas em ambientes ricos em oxigênio, onde geralmente crescem na superfície onde vivem. As espécies de Aspergillus contaminam restos de comidas (como pães e batatas), e crescem em muitas plantas e árvores.
Cerca de 16-20 espécies podem infectar o homem causando morte, sendo as mais comuns A. fumigatus, A. flavus e A. niger. As manifestações clínicas vão desde reações de hipersensibilidade (aspergilose alérgica) até formas pulmonares e cerebrais (aspergiloma ou bola fúngica).
Espécies de aspergillus
Aproximadamente 200, incluindo:
Aspergillus caesiellus
Aspergillus candidus
Aspergillus carneus
Aspergillus clavatus
Aspergillus deflectus
Aspergillus flavus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus glaucus
Aspergillus nidulans
Aspergillus niger
Aspergillus ochraceus
Aspergillus oryzae
Aspergillus parasiticus
Aspergillus penicilloides
Aspergillus restrictus
Aspergillus sojae
Aspergillus sydowi
Aspergillus tamari
Aspergillus terreus
Aspergillus ustus
Aspergillus versicolor
Etc.
Aspergillus em tomate
Aspergillus em tomate
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O fungo Aspergillus flavus, é uma especime cosmopolito que desenvolve-se em vários tipos substratos, dentre os quais alimentos como grãos de amendoim, soja, castanha - do - brasil e outros, produzindo aflatoxinas , que são micotoxinas [metabolitos secundarios], responsaveis por grandes perdas economicas. 
É um fungo de grande importancia medica no que diz respeito a infecções oportunistas como a aspergilose (colonização das vias e do trato respiratorio) e alergias respiratorias.
Gênero: Aspergillus Espécie: A. flavus
Aspergillus flavus
Morfologicamente, pode apresenta hifas hialinas, estirpes e esporos rugosos, vesicula globulosa ou piriforme, esporos globulosos de cor verde oliva, pode ser uniseriado, apresentando métulas de onde originam se os esporos ou podem ser biseriados, possuindo metulas e fialides, os conidioforos originam se de uma estrutura chamada celula pé. 
Macroscopicamente possui textura pulvurulenta, micelio branco, com esporulação cuja a tonalidade varia de verde oliva à amarelado.Dependendo do meio de cultura pode ou não haver coloração no reverso da placa, sendo radiado em qualquer condição de cultivo em meio solido.
Possui grande valor do ponto de vista biotecnologico por ser um exelente produtor de enzimas de interesse alimentício, como pectinases utilazadas para clarificação de sucos de frutas, amilases para fabricação de xaropes e a produção do acido citrico assim como também é produtor de micotoxinas como as [aflatoxinas B1], [B2], [G1], [G2] e [M1] sendo esta ultima metabolito da aflatoxina B1.
Exemplo: CONTAMINAÇÃO DO AMENDOIM 
Na hora do arranquio o amendoim contém cerca de 40% de umidade ou mais. A partir deste momento ele começa a perder umidade numa velocidade que depende do clima (sol, chuvas, dias nublados, etc) e da maneira como a planta for disposta no chão para secar: se deitada ou embandeirada (com as vagens para cima). 
Enquanto a umidade estiver acima de 20-22% a atividade metabólica da vagem oferece resistência à penetração do fungo e o risco da contaminação é muito pequena. 
Abaixo de 11% (no amendoim e casca) não há umidade suficiente para os fungos crescerem e também não há perigo de contaminação. 
O intervalo de 22-20 até 11% de umidade é, portanto, o período crítico e se houver demora da secagem nesta fase, a probabilidade de contaminação do amendoim será muito grande. 
Desta forma, abaixo de 20% de umidade o amendoim deve ser seco o mais rapidamente possível até 11% e só então ser batido ou despencado e ensacado, para se evitar o desenvolvimento do Aspergillus flavus e, consequentemente, que haja contaminação com a aflatoxina. Nem sempre esta secagem rápida pode ser conseguida porque, na hora da colheita da safra de maior volume, que é chamada "das águas", e que ocorre nos meses de janeiro/fevereiro, às vezes chove muitos dias em seguida ou faz dias nublados o que impede uma secagem rápida. 
Outro fator que atrasa a secagem é a posição deitada em que muitos lavradores colocam o amendoim após a colheita: nesta posição o amendoim seca muito lentamente e favorece a contaminação. Além disso, as vagens podem ser enterradas pela chuva e, quando isso isto acontece, a probabilidade de contaminação é muito grande. Embandeirado o amendoim seca muito mais depressa, corre muito menos risco de ser contaminado, mesmo chovendo bastante, e quebra menos na batedura. 
A prática , amplamente empregada, de bater e ensacar o amendoim ainda úmido (cerca de 14-18%), é altamente prejudicial. Dentro do saco o amendoim demora muito tempo para secar e o calor gerado pela própria atividade do grão mais o ambiente úmido da sacaria, são extremamente favoráveis à contaminação. 
Da mesma forma, o amendoim que, embora seco, for mal armazenado pode, em época chuvosa (devido à elevada umidade relativa do ar), reumedecer-se e dar condições ao fungo de crescer, possibilitando a contaminação com aflatoxina
Mucor e Rhizopus 
Mucormicose (zigomicose, ficomicose) é uma doença causada por fungos saprófitos (ex. Mucor. Rhizopus e Absidia) encontrados abundantemente no meio ambiente. 
Eles não são dimórficos. Invadem tecidos de hospedeiros imunodeprimidos. 
Eles proliferam nas paredes dos vasos sanguíneos, particularmente nas cavidades paranasais, nos pulmões ou no intestino, resultando em necrose tecidual. 
Pacientes com cetoacidose diabética, queimaduras ou leucemias são particularmente suscetíveis. Uma espécie, Rhizopus oryzae, causa cerca de 60% dos casos de mucormicose. 
7.5 - Outros Fungos que também causam doenças infecciosas.
Mucor mucedo
Mucor é um género com cerca de 3000 espécies de bolores geralmente encontrados no solo, sistemas digestivos, superficies de plantas e material vegetal em ...
Mucor.mucedo
Rhizopus sp.
Mucor.mucedo
Rhizopus sp.
Outros Fungos que também causam doenças infecciosas.
Penicillium Marneffei
É um fungo dimórfico que causa uma doença semelhante à tuberculose em pacientes aidéticos, particularmente nos países do sudeste asiático.
Phialides and conidia of P. marneffei
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Fusarium Solani
É um fungo filamentoso que além de causar tombamento em algodoeiro, soja, etc., pode causar também doença a saúde humana, principalmente em pacientes neutropênicos ("déficite de células brancas no sangue“). 
Características mais comuns são: febre e lesão de pele. 
Pneumocystis 
Este é classificado como uma levedura com base na análise molecular, mas clinicamente é ainda considerado como um membro dos protozoários. 
Pneumocystis carinii é um fungo que causa pneumonias principalmente aos imunodeprimidos. 
(Imunodeprimidos = tem péssima resposta imunologica ao tratamento). 
(A)Microconidia, (B) macroconidia e 
(C) clamidosporos de Fusarium solani.
A
B
C
A
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Exemplo de Tombamento em algodoeiro pode ser causado pelos seguintes patógenos:
 Fusarium spp.; Pithium sp.; Colletotrichum gossypii; 
Rhyzoctonia solani; Macrophomina phaseolina; 
Thielaviopsis basicola; Gromerella gossypii e 
Botriodiplodia theobromae.
> Como amostrar corretamente:
 => Culturas perenes ?
 => Culturas anuais ?
Como identificar a doença à nível de campo ?
Quais os instrumentos necessários p/ identificação no campo?
Além da sintomatologia e dos sinais, existem alguns fatores que podem auxiliar na identificação correta da doença ? 
Exemplo de fatores adversos que podem dificultar a identificação da doença no campo ?
 É importante embalar as amostras corretamente antes de encaminhar ao Laboratório ? 
Como as amostras devem chegar ao laboratório p/ serem analisadas?
Planejamento das atividades – exemplificar sempre 
Planejamento das atividades - continuação
> O conhecimento da situação climática da região pode auxiliar na identificação da doença ?
 => Exemplifique
> O conhecimento etiológico e epidemiológico pode
 auxiliar na identificação da doença ?
=> Exemplifique
> A identificação precoce da doença é igualmente
 importante para todos os tipos de patógenos ?
 => Exemplifique
Diagnóstico de doenças conhecidas e já descritas:
- Observação dos sintomas e sinais;
- Comparação com a literatura;
- Informações sobre condições de cultivo;
- Exames laboratoriais (patógeno):
 => Isolamento/inoculação
 => Serologia (ELISA)
 => Métodos moleculares (PCR)
Testes utilizados na diagnose:
=> Biológico;
=> Físico - químico;
=> Sorológico;
=> Moleculares;
=> Postulado de Koch
=> Análise comparativa – literatura
Pneumocystis 
Este é classificado como uma levedura com base na análise molecular, mas clinicamente é ainda considerado como um membro dos protozoários. 
Referências bibliografias 
APOSTILA DE MICOLOGIA CLÍNICA. FACULDADE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS - UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
KONEMAM, E.W.; ROBERTS, G.D. - Micologia. Practica de laboratório . 3 ed. Buenos Aires, Panamericana, 1992. 
WARREN LEVINSON & ERNEST JAWETZ - Microbiologia Médica e Imunologia – 7º edição 2005 Artimed Editora S.A
Silva, P. Farmacologia. Ed. Guanabara-koogan / 7ªedição, Rio de janeiro-RJ, 2006.
Jacob L. S. Farmacologia - National medical series para estudo independente, 4ªedição. Tradução: Patrícia Josephine Voeux. Ed. Guanabara koogan, Rio de Janeiro – RJ, 1998.
FIM