ENZIMAS_EM_MEDICAMENTOS_E_DIAGNOSTICOS

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ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNÓSTICOS
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ENZIMAS EM MEDICAMENTOS
E DIAGNÓSTICOS
Maria Eugénia M. Cruz, Maria Bárbara Martins,
Maria Luísa Corvo, Maria Manuela Gaspar,
Edna Maria Morais Oliveira e Maria Antonieta Ferrara
SUMÁRIO
O uso terapêutico de enzimas remonta ao final do século 19, quando preparações bru-
tas de enzimas pancreáticas de origem suína já eram empregadas no tratamento de de-
sordens gastrointestinais. Atualmente, existe no mercado uma ampla variedade de me-
dicamentos à base de enzimas para aplicação como auxiliares digestivos, antiinflamató-
rios, tratamento de coágulos sangüíneos, câncer, fibrose cística, gota e deficiências me-
tabólicas, dentre outras. Como exemplos podem ser citados o uso de estreptoquinase
como agente antitrombótico, de asparaginase no tratamento de leucemia e de glicoce-
rebrosidase no controle da doença de Gaucher. Outro importante uso terapêutico das
enzimas é na ativação seletiva de pró-fármacos, uma alternativa de superação da
toxicidade de determinados quimioterápicos.
O desenvolvimento de novas estratégias de formulação envolvendo o confinamento
em sistemas de transporte e direcionamento, como os lipossomas, ou conjugação quími-
ca com moléculas de baixo peso molecular ou poliméricas, como o polietilenoglicol, per-
mite contornar limitações relacionadas à instabilidade dos biocatalisadores, suscetibilida-
de ao ataque de proteases, dificuldade de acesso ao órgão alvo e antigenicidade.
O grande desenvolvimento experimentado pela terapia enzimática nos últimos
anos deve-se à identificação, purificação e caracterização de enzimas e metabólitos rele-
vantes e ainda ao advento das técnicas de DNA recombinante e de processos de produ-
ção em larga escala que possibilitam a produção de enzimas em grandes quantidades e
com custos mais convenientes.
1ª prova
305
13
Da mesma forma, o uso de enzimas em diagnósticos foi facilitado pelos avanços
recentes e, atualmente, muitos enzimas com elevada especificidade ao substrato fo-
ram desenvolvidas e são empregadas como catalisadores em diagnósticos em três cate-
gorias: métodos enzimáticos de ensaio para análises clínicas, enzimas marcadoras em
imunodiagnóstico e enzimas cujos níveis são avaliados para diagnósticos clínicos de
doenças.
Novos usos terapêuticos e em diagnósticos, ainda em fase de pesquisa, represen-
tam um potencial que pode repercutir de maneira ainda mais significativa no mercado
mundial destas enzimas, estimado em mais de um bilhão de dólares por ano.
INTRODUÇÃO
A alta especificidade e eficiência catalítica das enzimas são características importantes
que alicerçam sua aplicação como agentes terapêuticos. Assim sendo, a relevância do
uso de enzimas como medicamento relaciona-se ao fato de que pequenas quantidades
do catalisador biológico podem produzir efeitos bastante específicos em condições
fisiológicas.
O grande desenvolvimento experimentado pela terapia enzimática nos últimos
anos deve-se principalmente à identificação, purificação e caracterizaçãode enzimas e
metabólitos relevantes e ainda ao advento das técnicas de DNA recombinante e de pro-
cessos de produção em larga escala, que possibilitam a obtenção de elevados
rendimentos, em larga escala e com custos relativamente baixos.
Da mesma forma, o uso de enzimas em diagnósticos foi facilitado pelos avanços re-
centes e, atualmente, muitas enzimas com elevada especificidade ao substrato foram de-
senvolvidas e são empregadas como catalisadores em diagnósticos.
USO DE ENZIMAS COMO MEDICAMENTOS
As primeiras preparações enzimáticas industrialmente produzidas e comercializadas ti-
veram a finalidade de atuar como auxiliares digestivos. Assim é que, já antes da Primeira
Guerra Mundial, Takamine comercializou uma preparação enzimática denominada
“Takadiastase”, que era produzida por fermentação semi-sólida pelo fungo Aspergillus
oryzae. Este produto, que ainda hoje é comercializado, contém hidrolases como
amilases e proteases, sendo utilizado como auxiliar digestivo (BURKE, 2003).
Atualmente, existe no mercado uma ampla variedade de medicamentos à base de
enzimas (HAMMER, 2001) para aplicação como auxiliares digestivos, antiinflamatóri-
os, anti-sépticos, na reposição de enzimas hemostáticas, na inibição da coagulação, na
prevenção de lesões de reperfusão, no tratamento da icterícia neonatal, no tratamento
de fibrose cística, na reposição de enzimas metabólicas e na terapia do câncer. A tabela
13.1 relaciona algumas enzimas com importantes atividades terapêuticas.
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO306
1ª prova
Tabela 13.1 Exemplos de enzimas terapêuticas (TRAMPER e POULSEN, 2000; CHAPLIN, 2002,
MARSHALL et alii, 2003;WALSH, 2003)
Enzima Número EC Reação
Uso/indicação
terapêutica
Asparaginase* 3.5.1.1 L-asparagina + H2O �
L-aspartato + NH3
Leucemia
Colagenase 3.4.24.3 Hidrólise de colágeno Úlceras de pele
Fator VII 3.4.21.21 Plasminogênio � plasmina Coágulo sangüíneo
Hialuronidase 3.2.1.35 Hidrólise do hialuronato Ataque cardíaco
Lisozima 3.2.1.17 Hidrólise da parede celular
bacteriana
Antibiótico
Rodanase 2.8.1.1 S2O32- + CN- � SO32- +
SCN-
Envenenamento com
cianeto
Ribonuclease 3.1.26.4 Hidrólise de RNA Antiviral
�-lactamase 3.5.2.6 Penicilina � peniciloato Alergia a penicilina
Estreptoquinase 3.4.22.10 Plasminogênio � plasmina Coágulo sangüíneo
Tripsina 3.4.21.4 Hidrólise de proteína Inflamação
Uricase* 1.7.3.3 Urato + O2 � alantoína Gota
Uroquinase 3.4.21.31 Plasminogênio � plasmina Coágulo sangüíneo
Superóxido dismutase 1.15.1.1 Radical superóxido �
peróxido de hidrogénio + O2
Inflamação
�-glucocerebrosidade* 3.2.1.45 Terapia de reposição
enzimática
Doença de gaucher
Galactosidase* 3.2.1.23 Terapia de reposição
enzimática
Doença de Fabry
Catalase 1.11.1.6 peróxido de hidrogénio �
H2O + O2
Inflamação / stress
oxidativo
* aprovadas para uso clínico
A terapia enzimática apresenta, entretanto, algumas limitações relacionadas com a
instabilidade dos biocatalisadores, suscetibilidade ao ataque de proteases, dificuldade
de acesso ao órgão alvo e antigenicidade. Esta última está associada à presença de uma
proteína estranha ao organismo, o que pode causar resposta imune, provocando rea-
ções alérgicas severas, particularmente com o uso contínuo.
Diversas estratégias de formulação têm sido desenvolvidas no sentido de contornar
essas limitações. Dentre elas podem ser citadas a incorporação da enzima em sistemas
de transporte/direcionamento, como os lipossomas e a conjugação química com molé-
culas de baixo peso molecular ou poliméricas, como o polietilenoglicol.
CAPÍTULO 13 � ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNÓSTICOS 307
1ª prova
Ao contrário das enzimas de uso industrial, as enzimas terapêuticas são requeridas
em quantidades relativamente pequenas, devendo apresentar, entretanto, elevado
grau de pureza, alta especificidade, baixa antigenicidade e estabilidade em condições fi-
siológicas. Com relação às propriedades cinéticas, a constante de Michaelis (Km) deve
ser baixa e a velocidade máxima (vmax) elevada, de forma a se obter máxima eficiência
mesmo em condições de concentrações muito baixas de enzima e substrato.
As fontes de obtenção das enzimas terapêuticas devem ser selecionadas de forma a
se evitar qualquer possibilidade de contaminação indesejada. De acordo com a finalida-
de, as formulações que contêm enzimas podem ser administradas por via tópica, oral ou
parenteral. As enzimas administradas por via parenteral devem apresentar grau de pu-
reza especialmente elevado, o que se reflete no custo. As preparações enzimáticas de
uso terapêutico são em geral liofilizadas e contêm sais tamponantes biocompatíveis e
manitol como excipiente.
Aplicações
Enzimas digestivas
Desde o final do século 19, preparações brutas de enzimas pancreáticas de origem suína
vêm sendo empregadas no tratamento de desordens gastrointestinais (TRAMPER e
POULSEN, 2000). Atualmente, existe no mercado uma ampla variedade de medica-
mentos à base de enzimas para problemas digestivos. Estes medicamentos podem con-
ter em sua formulação, além de proteases, amilases, lipases, celulases, sais biliares e
outros.
Enzimas em doenças inflamatórias
As enzimas proteolíticas também são amplamente empregadas como agentes antiinfla-
matórios. A redução de inflamação e edema é atribuída à dissolução de fibrina e à elimi-
nação de fragmentos protéicos presentes em exudatos inflamatórios. Como exemplos,
a papaína produz redução significativa de inflamação e inchamento obstétricos e de
edema pós-cirúrgico dental; colagenase, enzima que hidrolisa seletivamente colágeno,
é utilizada para tratamento de úlceras dérmicas e queimaduras; tripsina e quimiotripsi-
na vêm sendo empregadas no tratamento de trauma pós-operatório, ferimentos espor-
tivos, e ciática (BICKERSTAFF, 2003); enzimas proteolíticas (bromelina, papaína, trip-
sina e quimotripsina) administradas por via oral apresentam efeito analgésico e
antiinflamatório em pacientes com problemas reumáticos (LEIPNER, 2001).
Em adição, as doenças inflamatórias das articulações têm sido intensamente estu-
dadas no que diz respeito ao possível envolvimento de situações de stress oxidativo (de-
sequilíbrio entre a produção de formas reativas de oxigênio e os respectivos sistemas de
defesa) (HALLIWELL, 1995, HENROTIN et alii, 1992; MERRY et alii, 1989, MAPP et
alii, 1995). O envolvimento destas situações de stress está na base da chamada terapia
antioxidativa, que utiliza agentes antioxidantes, entre os quais enzimas antioxidantes,
como agentes terapêuticos (MATES et alii, 1999).
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO308
1ª prova
Uma das enzimas propostas como agente terapêutico para inúmeras doenças nas
quais as formas reativas de oxigênio têm um papel importante é a superóxido dismutase
(SOD). Diversos estudos têm sido conduzidos para tentar esclarecer o possível papel be-
néfico desta enzima na redução de danos de tecidos em doenças inflamatórias crônicas,
nas quais se inclui a artrite reumatóide (REGNAULT et alii, 1996). A proposta do uso de
SOD baseia-se na hipótese de que um aumento da concentração extracelular da enzima
diminuiria a quantidade de superóxido produzido por neutrófilos ativados, impedindo
deste modo quer possíveis danos provocados por este radical, quer a sua possível ativida-
de quimiotática (BARET et alii, 1984). As limitações potenciais para o uso de SOD
como agente terapêutico são a sua rápida eliminação do sangue por filtração glomeru-
lar (GREENWALD, 1991; Dowling et alii, 1993; TAKAKURA et alii, 1994) e o seu tempo
de meia-vida muito reduzido (SOD de origem bovina - 6 min no rato (HUBER et alii,
1977) e 30 min em humanos (HUBER et alii, 1980)).
Enzimas em oncologia
Uma importante estratégia para o combate ao câncer consiste em explorar as diferen-
ças bioquímicas entre as células normais e as células neoplásicas. Estas últimas apresen-
tam alterações substanciais em seus perfis metabólicos que estão relacionadas ao au-
mento da síntese de proteínas e dos ácidos nucléicos e à eliminaçãoou limitação da sín-
tese de moléculas conhecidas como “blocos construtores”, como os aminoácidos, por
exemplo, levando à dependência do suprimento externo destas substâncias. As enzi-
mas podem ser empregadas para esgotar o organismo de um determinado nutriente,
privando, seletivamente, as células neoplásicas do nutriente, sem afetar células e tecidos
normais.
A L-asparaginase, por exemplo, é uma enzima muito eficaz no combate a leucemi-
as linfocíticas (linfomas) porque esgota os estoques de asparagina circulante, metabóli-
to essencial para as células tumorais em contraposição às células normais, que são capa-
zes de sintetizar este aminoácido. Um grande impulso na terapia enzimática do câncer
surgiu da observação de Broome (1961), que identificou como sendo a asparaginase o
fator antilinfoma presente no soro de porquinhos da Índia. Subseqüentemente, foram
identificadas fontes bacterianas e vegetais da enzima (MÜLLER e BOOS, 1998;
WRISTON e YELLIN, 1973).
A asparaginase foi introduzida no mercado em 1978. As formulações Elspar, da
Merck, e Erwinase da Speywood, preparadas a partir de enzimas bacterianas produzida
por Escherichia coli e Erwinia carotovora, respectivamente, são utilizadas por via intra-
venosa, geralmente associadas a agentes alquilantes e outros antagonistas metabólicos
(MULLER e BOOS, 1998; NARTA, et alii, 2007). No Brasil, tem-se conhecimento de
que somente o Elspar está em uso.
Apesar de efetiva, a asparaginase apresenta limitações como o baixo tempo de
meia-vida e o risco de provocar reações imunológicas. Adicionalmente, o paciente pode
desenvolver resistência ao medicamento. Assim, a utilização da asparaginase está restri-
ta ao ambiente hospitalar com acompanhamento médico rigoroso. Em 1994, a FDA
CAPÍTULO 13 � ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNÓSTICOS 309
1ª prova
aprovou o uso da L-asparaginase modificada com polietilenoglicol (PEG). Esta modifi-
cação da enzima foi positiva porque aumentou a meia-vida do antineoplásico e reduziu
consideravelmente os efeitos imunogênicos, ampliando ainda mais o espectro de ativi-
dade contra linfomas previamente resistentes. No entanto, as reações imunogênicas
não foram completamente eliminadas e quando ocorrem são de longa duração e,
portanto, mais difíceis de controlar.
Outras enzimas capazes de decompor aminoácidos vêm sendo testadas para o tra-
tamento de diversos tipos de tumores: L-glutaminase-L-asparaginase, L-metionina-�-lia-
se, L-fenilalanina amonialiase, L-arginase, L-tirosinase, L-serina dehidratase, L-treonina
desaminase e indolil-3-alcano hidroxilase (BICKERSTAFF, 2003). Esta relação vem
crescendo de forma notável tendo em vista as novas técnicas de clonagem e expressão
de enzimas e à identificação de metabólitos relevantes.
Outro tipo de enzima oncolítica, ainda em fase experimental, é a toxina da difte-
ria, cuja ação interrompe a síntese protéica. A sensibilidade das células tumorais a esta
toxina é de 100 a 10.000 vezes maior em relação às células normais (AYESH et alii, 2003;
BICKERSTAFF, 2003).
As enzimas que degradam macromoléculas (polissacarídeos de membrana, prote-
ínas estruturais e funcionais ou ácidos nucléicos), como neuramidase, ribonuclease e
carboxipeptidase, são também promissoras para o tratamento de neoplasias (AYESH et
alii, 2003; BICKERSTAFF, 2003).
Enzimas como anticoagulantes
O uso de enzimas no tratamento de doenças tromboembólicas iniciou-se com o conhe-
cimento de que a lise da fibrina pode ser efetuada in vivo através de um processo que en-
volve a conversão de plasminogênio a plasmina e de que ativadores do plasminogênio
podem produzir fibrinólise enzimática controlada. A primeira geração de agentes anti-
trombóticos inclui a estreptoquinase bacteriana e a uroquinase de urina humana. A
crescente incidência de doenças troboembólicas tem estimulado a busca, utilizando a
tecnologia do DNA recombinante, de novos agentes capazes de estimular, com maior
especificidade, os sistemas fibrinolíticos naturais (PIDRARD e BOLLEN, 1990;
BICKERSTAFF, 2003).
Terapia de reposição enzimática
O tratamento de deficiências enzimáticas, particularmente as decorrentes de erros ina-
tos do metabolismo, é um campo de aplicação dos mais relevantes para as enzimas tera-
pêuticas. Como exemplos, podem ser citados o uso da glicocerebrosidase para o contro-
le da doença de Gaucher, da alfagalactosidase para doença de Fabry, do fator VIIa para
hemofilia, da pegademase para imunodeficiência intensa (doença do menino bolha) e
da sacarosidase para deficiência congênita de sacarase e isomaltase (NOTHENBERG,
1999; BRADY, 2003; BRADY e SCHIFFMA, 2004).
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO310
1ª prova
Enzimas ativadoras de pró-fármacos
Um dos principais obstáculos ao emprego de quimioterápicos no cãncer é a limitação
de dose devida à toxicidade dos fármacos. Esta toxicidade é causada pela baixa seletivi-
dade dos agentes, que se tornam lesivos para as células neoplásicas e também para as
células normais.
Uma alternativa para superar essas limitações é a estratégia denominada ADEPT
(antibody-directed enzyme prodrug therapy). A metodologia ADEPT compreende a
administração de profármacos, formas quimicamente inativas de moléculas antineo-
plásicas, e sua posterior conversão na forma ativa in vivo, exclusivamente nas proximida-
des do local de ação. Para isso, administra-se previamente ao paciente uma enzima ca-
paz de promover a ativação da droga. Esta enzima é direcionada para as células tumora-
is através da associação com um anticorpo específico para os componentes superficiais
das células antineoplásicas. A enzima conversora do antineoplásico se fixa ao tumor e só
então promove a ativação do fármaco, minimizando assim os efeitos colaterais.
Alguns artigos relatam ensaios ADEPT empregando as enzimas carboxipeptidase
G2, carboxipeptidase A, beta-glicuronidase, fosfatase alcalina, nitroredutase, citosina
desaminase, beta-lactamase e penicilina V amidase, dentre outras. Para o sucesso da
aplicação da metodologia ADEPT, é fundamental que os pró-fármacos sejam projeta-
dos para resistir ao ataque das enzimas do organismo do paciente.
Outros sistemas análogos em estudo são: PDEPT (polymer-directed enzyme-pro-
drug therapy), GDEPT (gene-directed enzyme-prodrug therapy), VDEPT (virus-direc-
ted enzyme-prodrug therapy), GPAT (genetic prodrug activation therapy) e TEPT,
(Targeted Enzyme Prodrug Therapy).
Na ativação seletiva de profármacos, têm sido utilizadas enzimas microbianas, o
que pode acarretar reações alérgicas. Assim, também está em estudo o uso de enzimas
“humanizadas”. Esses novos usos terapêuticos, que ainda se encontram em fase de pes-
quisa, apresentam potencial que pode repercutir de maneira muito significativa no
mercado mundial de enzimas de uso farmacêutico (BLAU et alii, 2006;
NICULESCU-DUVAZ e SPRINGER, 1997; NOTHENBERG, 1997; NAYLOR e
THOMSON, 2003).
Estratégias de formulação para fins terapêuticos
Lipossomas como veículos de transporte in vivo
Diversas estratégias podem ser utilizadas com o objetivo de melhorar o índice terapêuti-
co de enzimas. Uma delas é a associação a sistemas que possam transportá-las em orga-
nismos vivos, de tal modo que haja aumento da dose eficaz média e /ou redução da
dose tóxica média. Um dos sistemas de transporte mais utilizado são os lipossomas, en-
tendidos como microesferas constituídas por lipídios organizados em bicamadas
concêntricas e separadas por compartimentos aquosos (figura 13.1).
Os lipossomas podem incorporar praticamente qualquer tipo de substância, inde-
pendentemente do peso molecular (desde moléculas de baixo peso molecular a macro-
moléculas); da carga elétrica (moléculas carregadas ou neutras); e da solubilidade (par-
CAPÍTULO 13 � ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNÓSTICOS 311
1ª prova
tículas hidrofílicas, que se incorporam nos espaços internos aquosos - figura 13.1-A; par-
tículas hidrofóbicas, que se incorporam na bicamada lipídica - figura 13.1-B; e partículas
anfifílicas, que se distribuem entre os dois meios). Os lipossomasforam preparados
pela primeira vez em 1965 por Bangham para uso como modelos de membranas
(BANGHAM et alii, 1965) e, posteriormente, como transportadores de agentes bioati-
vos in vivo (GREGORIADIS e RYMAN, 1972). Atualmente, é possível preparar
lipossomas com características bem definidas e adaptadas para cada objetivo em vista,
como por exemplo, o órgão alvo.
De acordo com suas características e comportamento in vivo após a administração
intravenosa, os lipossomas, podem ser classificados em quatro grupos (CRUZ, 1997;
LASIC e PAPAHADJOPOULOS, 1998; WOODLE e STORM, 1998; TORCHILIN e
WEISSIG, 2003):
� Lipossomas convencionais, caracterizados por uma captura rápida pelas células
do sistema mononuclear fagocitário (SMF) apresentando, por isso, reduzidos
tempos de circulação na corrente sanguínea.
� Lipossomas de longo tempo de circulação, que contendo determinadas molécu-
las (como gangliosídeos) ou polímeros (como polietilenoglicol - PEG), apresen-
tam tempos de circulação na corrente sanguínea prolongados;
� Lipossomas catiônicos, contendo fosfolipídios carregados positivamente e ade-
quados para o transporte de material genético.
� Lipossomas direcionadas, contendo ligantes à superfície capazes de reconhecer
especificamente determinadas células e, portanto, apropriados para um
direcionamento específico.
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO312
1ª prova
Figura 13.1 Representação esquemática de um lipossoma e localização de enzimas no espaço
lipossomal de acordo com as suas propriedades. Enzimas hidrossolúveis no espaço interno aquoso
(A); enzimas lipopossolúveis na bicamada lipídica (B).
Hidrófila
Hidrófoba
Enzima
Figura 1 - A
Figura 1 - B
Atualmente, existem diversas formulações lipossomais no mercado. A primeira de-
las foi comercializada em 1990 nos EUA, contendo anfotericina B e utilizada no trata-
mento de infecções sistêmicas fúngicas e infecções parasitárias, como a leishmaniose.
Conforme já mencionado, a administração terapêutica de enzimas na forma livre
pode apresentar graves limitações, como reações imunogênicas severas; dificuldade de
acesso ao órgão alvo, vida média curta e rápida inativação após administração. Na forma
lipossomal este panorama é alterado porque ocorrem modificações nas propriedades
farmacocinéticas e de biodistribuição das enzimas, ocorrendo redução da sua toxicida-
de e aumento da eficácia (CRUZ et alii, 1993; JORGE et alii, 1994; GASPAR et alii, 1996,
CORVO et alii,1999).
Após incorporação em lipossomas, a localização da enzima no interior da vesícula
depende da sua solubilidade: as enzimas hidrossolúveis localizam-se no espaço interno
aquoso e as lipossolúveis, na matriz lipídica. O mecanismo de ação das enzimas incorpo-
radas depende de sua localização no lipossoma. Assim, as enzimas hidrossolúveis só po-
dem degradar os substratos após a ruptura dos lipossomas (figura 13.1-A); enquanto
que as lipossolúveis, capazes de expor o centro ativo para o exterior do lipossoma, po-
dem exercer a sua atividade enzimática (efeito terapêutico) independentemente da
ruptura do lipossoma (figura 13.1-B).
Modificação química de enzimas terapêuticas
A modificação química de enzimas tem sido uma das estratégias utilizadas para contor-
nar algumas limitações apresentadas pela terapia enzimática, tais como reduzidos tem-
pos em circulação, degradação proteolítica, toxicidade e reações adversas do sistema
imune. A modificação química permite alterar as propriedades físico-químicas de enzi-
mas terapêuticas, especialmente por interferência ao nível da biodistribuição ou do
reconhecimento da macromolécula no organismo.
Diversos tipos de moléculas podem ser utilizadas com este objetivo (FUJITA et alii,
1992; IGARASHI et alii, 1992; VERONESE, 1994), destacando-se a conjugação com po-
límeros de diferentes comprimentos de cadeia e cuja presença permite camuflar a ma-
cromolécula na circulação sanguínea (ABUCKOSKI e DAVIS, 1981; VERONESE,
1994). A modificação de enzimas por conjugação com moléculas hidrofóbicas, para au-
mentar a afinidade pelas bicamadas lipídicas de lipossomas ou de membranas celulares,
tem sido também utilizada (MARTINS et alii, 1990, 1996; TORCHILIN, 1991).
A modificação por reações químicas possibilita a introdução de alterações nas pro-
priedades de uma enzima por atuação direta na estrutura da molécula nativa. São méto-
dos particularmente úteis quando se pretende introduzir substituintes que não podem
ser inseridos por via genética, por exemplo, aminoácidos dextrógiros, análogos ou deri-
vados de aminoácidos inexistentes na natureza, oligosídeos, sondas radioativas, sondas
de fluorescência, polímeros, resíduos de ácidos graxos ou outras moléculas.
A modificação química de uma enzima resulta da reação entre determinados rea-
gentes químicos e alguns grupos laterais de resíduos de aminoácidos, com formação, na
maior parte dos casos, de ligações covalentes. Essas reações foram, durante muitos anos,
CAPÍTULO 13 � ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNÓSTICOS 313
1ª prova
utilizadas para a identificação e localização de aminoácidos em estruturas de enzimas
(MEANS e FEENEY, 1971) e no esclarecimento da relação entre a atividade catalítica e
os aminoácidos existentes no centro ativo (EYZAGUIRRE, 1987). Só no final do século
passado é que se assistiu a um crescente interesse pela modificação de enzimas com o
objetivo de alterar suas propriedades (GEISOW, 1993).
Dada a grande complexidade estrutural das enzima e a dificuldade de predizer as
conseqüências funcionais das modificações introduzidas, as técnicas de alteração de
propriedades de enzimas através de reações químicas são freqüentemente utilizadas de
um modo iterativo. A extensão da modificação química é uma função da reatividade
quer do reagente quer do grupo lateral do resíduo de aminoácido, bem como das
alterações que a reação de modificação induziu na conformação da molécula.
Ao envolver a ligação aleatória com grupos reativos da enzima, a modificação quí-
mica pode dar origem a alterações no centro ativo ou na conformação da macromolé-
cula, com a conseqüente alteração de suas características. As enzimas podem conter vá-
rias centenas de resíduos de aminoácidos, mas apenas alguns destes estão diretamente
envolvidos na sua ação catalítica (PAGE, 1984a). O principal papel do grande conjunto
de resíduos de aminoácidos de uma enzima é o da formação de uma estrutura tridimen-
sional com rigidez suficiente para maximizar a energia de ligação entre o substrato e a
enzima (PAGE, 1984b). O meio envolvente também pode induzir alterações na estrutu-
ra tridimensional da molécula. A intervenção em qualquer destes níveis pode afetar as
características de uma proteína e tem conseqüências particularmente críticas quando
afeta a atividade catalítica. É dada preferência às reações de conjugação em que são
unicamente modificados grupos distantes do centro ativo, o que pode afetar
consideravelmente as propriedades da enzima, sem, contudo, alterar a atividade
específica.
A preservação das propriedades catalíticas de uma enzima modificada pode ser al-
cançada através da utilização de um adequado estabilizante da estrutura da enzima.
Alguns solventes (TIMASHEFF e ARAKAWA, 1993) e sistemas micelares naturais ou
sintéticos, capazes de afetar a velocidade de muitas reações químicas quer in vivo quer
in vitro, são usados como estabilizadores.
O polietilenoglicol (PEG) é um polímero bastante investigado para a modificação
covalente de macromoléculas biológicas visando aplicações farmacêuticas. Seu uso é
uma prática aceita na formulação terapêutica aprovada pelo FDA (Food and Drug
Administration). As primeiras enzimas modificadas com PEG colocadas no mercado fo-
ram a pegademase bovina, utilizada no tratamento de imunodeficiência intensa e a
L-asparaginase, para o tratamento de leucemia (ROBERTS et alii, 2002).
O efeito da modificação química dos grupos å- NH2 da lisina na atividade e na esta-
bilidade da molécula de L-asparaginase foi investigado por alguns autores (SADANA e
Henley, 1988). Estudossobre a ligação covalente de cadeias acila a grupos reativos da
enzima mostraram retenções de atividade entre 10% e 75% (CLASSEN e ROOIJEN,
1983; KITO, 1986; SADANA e HENLEY, 1988).
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO314
1ª prova
A figura 13.2 apresentada esquematicamente a modificação de uma enzima por liga-
ção a cadeias hidrofóbicas, a inserção de uma enzima modificada numa bicamada lipídi-
ca e um exemplo de conjugação por intermédio da reação covalente entre o grupo carbo-
nilo de um cloreto de acilo e os grupos laterais ��- NH2 dos resíduos de lisina da enzima.
Com o objetivo de aumentar o caráter hidrofóbico da enzima, outros autores estu-
daram a reação de modificação da L-asparaginase por ligação a cadeias acila utilizando
o reagente de modificação convenientemente disperso em micelas. (MARTINS e
CRUZ, 1988; MARTINS et alii, 1990, 1996; MARTINS, 1998; CRUZ et alii, 2005).
O efeito da presença de substrato no meio reacional, adicionado para proteger o
centro ativo da enzima durante a reação de modificação, e da relação cloreto de acilo:en-
zima, para uma reação em meio heterogêneo, é apresentado na figura 13.3. Os resultados
do estudo demonstraram que é possível aumentar o grau de modificação até ser atingido
um percentual de grupos modificados máximo, sem alterar a atividade catalítica da enzi-
ma Acil-L-asparaginase. Foi ainda avaliado o efeito de meios heterogêneos nos parâme-
tros cinéticos do bioconjugado e realizado um estudo comparativo de propriedades da
enzima modificada e da enzima nativa, tais como a mobilidade eletroforética, potencial
zeta a determinados valores de pH, perfis de pH e de temperatura, estabilidade em soro
humano e estabilidade ao armazenamento (MARTINS et. alii, 1996).
Estudos semelhantes de otimização da reação de modificação com cloreto de pal-
mitoílo e de caracterização da enzima modificada foram realizados para as enzimas uri-
case, superóxido dismutase e catalase (Martins, 1998; Aguiar et alii, 1998). No caso da
superóxido dismutase e da catalase, estudou-se o efeito dos comprimentos de cadeia de
cloretos de acila no grau de modificação das enzimas. Os resultados obtidos para a
enzima superóxido dismutase podem ser observados na figura 13.4.
CAPÍTULO 13 � ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNÓSTICOS 315
1ª prova
Figura 13.2 Representação esquemática da ligação de cadeias hidrófobas à superfície da enzima,
com a conseqüente alteração de afinidade por bicamadas lipídicas (A) Exemplo de conjugação por
intermédio da reação covalente entre o grupo carbonilo de um cloreto de acilo e os grupos laterais
�-NH2 dos resíduos de lisina da enzima (B).
A B
proteína nativa
(hidrófila)
proteína
modificada
bicamada
lipidica
afinidade para
bicamadas
-NH
2
-N
H 2
-N
H
2
+
-N
H
2
Enzima nativa
(hidrófila)
Enzima
modificada
cloreto de acilo
Estabilizavel em meio
aquoso
ultra-sons
micelas de tensioactivo
pH > pKa
-NH2
-NH
2
-N
H 2
-N
H
2
O
C
Cl
+
-N
H
2
insolúvel em água (C>10)
instável em água
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO316
1ª prova
Figura 13.3 Efeito da relação molar cloreto de acilo:enzima no grau de modificação e na retenção
de atividade da enzima, quer na ausência de substrato quer na presença de substrato no meio
reacional.
modificação na ausência de substrato:
0
20
40
60
80
100
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
Razão molar (CIP:P)
% modificação
retenção de actividade
retenção de actividade
% modificação
p
e
rc
e
n
ta
g
e
m
(%
)
modificação em presença de substrato:
Figura 13.4 Evolução do grau de modificação da enzima superóxido dismutase em função da razão
molar cloreto de acila /proteína e do comprimento da cadeia acílica.
0
5
10
15
20
25
30
35
0 100 200 300 400 500 600
C 8
C14
C16
C18
G
ra
u
d
e
m
o
d
if
ic
a
ç
ã
o
(%
)
Razão molar cloreto de acilo/proteína
retenção de actividade > 70%
A figura 13.5 mostra esquematicamente a incorporação destas enzimas na estrutu-
ra de um lipossoma multilamelar e a destruição da estrutura lipossomal com liberação
gradual da enzima incorporada nas bicamadas.
As enzimas L-asparaginase e superoxido dismutase modificadas com cadeias de
palmitoílo foram incorporadas em lipossomas, tendo-se observado um aumento de afi-
nidade destas enzimas para a bicamada dos lipossomas (CRUZ et alii, 1990; 1991;
MARTINS et alii, 1992, GASPAR et alii, 2003). Resultados de atividade biológica dos sis-
temas constituídos por enzimas modificadas incorporadas em diferentes tipos de
lipossomas são apresentados no próximo item.
Terapia enzimática via lipossomas
A seguir são apresentados exemplos de melhoria do desempenho de duas enzimas com
atividade terapêutica, L-asparaginase e superóxido dismutase, e respectivas formas aci-
ladas após incorporação em lipossomas.
L-asparaginase e acil L-asparaginase incorporadas em lipossomas e
testadas em modelos animais
Conforme já mencionado, a enzima L-asparaginase é usada na terapia da leucemia, mas
existem inconvenientes como o reduzido tempo de residência na corrente sanguínea e
elevada toxicidade.
Com o objetivo de contornar essas limitações, foram desenvolvidos estudos de for-
mulações lipossomais de L-asparaginase visando à seleção das composições lipídicas ca-
pazes de manter a atividade enzimática e simultaneamente maximizar a eficácia de en-
capsulação e as concentrações intralipossomais da enzima (CRUZ et alii, 1993; GASPAR
et alii, 1996). Foi também testada a incorporação em lipossomas de um derivado desta
CAPÍTULO 13 � ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNÓSTICOS 317
1ª prova
Figura 13.5 Representação esquemática de enzima hidrofobizada e incorporada em lipossoma
multilamelar (A). Representação esquemática da destruição gradual do lipossoma e da enzima
incorporada (B).
Estabilidade em soro humano
lipossoma multilamelar
enzima
soro soro
enzima obtido por ligação de cadeias de ácido palmítico aos grupos amina da enzima
(Ac-L-asparaginase). A utilização de derivados acilados teve como finalidade a obtenção
de uma nova entidade enzimática com caráter hidrofóbico e maior afinidade pelas bica-
madas lipídicas dos lipossomas contrariamente à L-asparaginase nativa, de caráter hi-
drofílico (JORGE et alii, 1994).
A composição lipídica dos lipossomas tem um efeito importante não só na eficácia
de encapsulação das enzimas, mas também na retenção da atividade enzimática. Assim,
observou-se que alguns lipídios como o dicetilfosfato (DcP) reduziram a atividade cata-
lítica da enzima, enquanto que outros lipídios, como o fosfatidilinositol (PI), a estearila-
mina (SA) e os gangliosídeos (GM1), conservaram quase 100% da atividade e permiti-
ram a encapsulação da enzima com alta eficácia e elevadas concentrações intraliposso-
mais. A tabela 13.2 apresenta, a título de exemplo, a caracterização físico-química de
formulações lipossomais de L-asparaginase e Acil L-asparaginase para o caso da compo-
sição lipídica contendo SA.
Tabela 13.2 Caracterização físico-química de formulações lipossomais de L-asparaginase e
Acil-L-asparaginase
Enzima Incorporada Proteína final /
Proteína inicial
(%)
Eficácia de
encapsulação
(%)
Atividade enzimática
dos lipossomas
intactos (%)
L-Asparaginase 31 ± 1 52 ± 2 < 5
Acil-L-Asparaginase 43 ± 15 74 ± 12 74 ± 11
Composição lipídica – fosfatidilcolina: colesterol: estearilamina. Cruz et alii, 1993; Jorge et alii, 1994.
Conforme mencionado acima, as enzimas hidrossolúveis, localizadas no espaço in-
terno aquoso dos lipossomas, só podem degradar os substratos após ruptura dos liposso-
mas; enquanto que as lipossolúveis, localizadas na matriz lipídica, podem exercer sua ati-
vidade enzimática independentemente da ruptura do lipossoma. Assim, quando a forma
hidrofóbica da enzima, L-asparaginase acilada, foi incorporada em lipossomas, a princi-
pal característica foi à possibilidade da expressão da atividade enzimática na forma intacta
dos lipossomas, ao contrário das formulações lipossomais da enzima nativa.
Estudos in vitro de citotoxicidade em célulasde ovário de hamster chinês demons-
traram que a L-asparaginase encapsulada em lipossomas foi menos tóxica para as célu-
las normais em cultura do que a enzima na forma livre (CRUZ et alii, 1993). Uma vez
que a enzima encapsulada em lipossomas é liberada lentamente das vesículas, a degra-
dação de asparagina é também mais lenta, o que dá às células mais tempo para se recu-
perar dos danos resultantes do contato da enzima com seu substrato.
De acordo com a composição lipídica e o tipo de lipossomas, os parâmetros farma-
cocinéticos da enzima variam: em lipossomas com diâmetro inferior a 0,2 µm, obser-
vou-se um aumento do tempo de meia-vida da enzima nativa de 2h (enzima livre) para
9h (lipossomas convencionais) ou 29 h (lipossomas de longo tempo de circulação)
(GASPAR et alii, 1996). A enzima acilada apresentou um tempo de meia-vida de 3h, que
após incorporação em lipossomas foi aumentado para 24 h (JORGE et alii, 1994).
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO318
1ª prova
Foi estudada a toxicidade com vistas à avaliação da segurança imunológica das for-
mulações lipossomais de L-asparaginase e acil-L-asparaginase após sensibilização dos
animais por via intra muscular e desafio (challenge) por via intra venosa. Verificou-se
que a encapsulação da enzima nativa em lipossomas impediu a indução de anticorpos
anti-asparaginase uma vez que não ocorreu morte nos grupos de animais pré-sensibili-
zados que receberam a enzima na forma de lipossoma. Por outro lado, todos os animais
sensibilizados com L-asparaginase na forma livre e tratados com enzima livre sofreram
choque anafilático e 17% dos animais morreram. No caso da acil-L-asparaginase, embo-
ra esta enzima se encontre parcialmente exposta para o exterior, os lipossomas
conseguiram mascarar as reações imunogênicas. (tabela 13.3).
Tabela 13.3 Toxicidade aguda in vivo: influência da formulação utilizada de L-asparaginase e
Acil-L-asparaginase
Sensibilização (i.m.) “Challenge (i.v.)
Animais c/ choque
anafilático (%)
Animais mortos (%)
L-Asparaginase
Livre Livre 100 17
Livre Lipossomas 0 0
Lipossomas Livre 100 0
Lipossomas Lipossomas 0 0
Acil-L-Asparaginase
Livre Livre 66 17
Livre Lipossomas 0 0
Lipossomas Livre 0 0
Lipossomas Lipossomas 0 0
i.m. – via intramuscular; i.v. – via intravenosa
Dose administrada para as formulações de L-asparaginase e acil-L-asparaginase: 2000 U/kg. (Gaspar et alii,
1996; Jorge et alii, 1994)
A atividade terapêutica das formulações de L-asparaginase nativa e modificada foi
avaliada em um modelo animal de linfoma após administração subcutânea de células
P1534. Observou-se que a enzima acilada livre e as formas lipossomais da enzima nativa
e modificada têm efeito terapêutico superior à forma comercial. A atividade terapêutica
foi estimada através do número de animais curados e do índice de sobrevivência (razão
entre o tempo de sobrevivência dos animais tratados e os animais controle). Verifi-
cou-se que tanto as formas lipossomais quanto a enzima modificada têm um índice de
sobrevivência superior a 700 e um número de animais curados de 7 em 10. Para a forma
comercial, o índice de sobrevivência é 400 e o número de animais curados, de apenas 2
em 10 (figura 13.6).
CAPÍTULO 13 � ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNÓSTICOS 319
1ª prova
Concluindo, tanto a modificação química quanto a incorporação em lipossomas ou
a associação de ambas as estratégias promoveram a redução da toxicidade, o aumento do
tempo de circulação na corrente sanguínea e conseqüente aumento da atividade tera-
pêutica, resultando num aumento substancial do índice terapêutico da enzima L-aspara-
ginase. Estas formas poderão constituir uma alternativa à forma comercial da enzima.
Superoxido-dismutase e acil superoxido-dismutase incorporadas em
lipossomas e testadas em modelos animais
A enzima superóxido dismutase, com atividade antioxidante, apresenta, como já men-
cionado, limitações terapêuticas devido essencialmente à sua rápida eliminação da cor-
rente sanguínea. Uma estratégia para contornar este inconveniente e melhorar o po-
tencial terapêutico é a sua incorporação em sistemas de transporte/direcionamento
(STONE e SMITH, 2004). É possível prever três vantagens do uso de lipossomas como
transportadores de superóxido dismutase:
�O aumento da disponibilização da enzima nos locais de artrite provoca uma au-
mento correspondente da atividade terapêutica.
� A cinética de liberação controlada da enzima dos lipossomas pode reduzir a dose
a ser administrada, bem como o número de administrações necessárias à eficácia
terapêutica.
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO320
1ª prova
Figura 13.6 Atividade terapêutica de formulações de L-asparaginase e Ac-L-asparaginase nas
formas livre e lipossomal em um modelo animal de linfoma. Dose administrada 800 U/kg. (JORGE et
alii, 1994; GASPAR et alii, 1996).
Comercial
L - ASNase
8
6
4
2
0
Lipossomas
Ac -L - ASNase
Semi -
L - ASNase
sintética
Ac -
Lipossomas
L - ASNase
0
800
600
400
200
10
T
ra
ta
d
o
s
/
C
o
n
tr
o
le
(%
)
A
n
im
a
is
c
u
ra
d
o
s
- Tratados / Controle (%) - Animais curados
�No caso da forma modificada da enzima (superóxido dismutase acilada), as for-
mulações lipossomais podem exercer atividade terapêutica antes de sua destrui-
ção, resultando em efeito terapêutico mais rápido.
A enzima superóxido dismutase nativa e um derivado obtido por ligação de cadei-
as de ácido palmítico a grupos amina da enzima foram incorporados em lipossomas. A
seguir, foram efetuados estudos de caracterização das formulações, de farmacocinética
e biodistribuição e de atividade in vivo usando como modelo a artrite adjuvante de rato.
A utilização de derivados acilados de superóxido dismutase teve como finalidade a ob-
tenção de uma nova entidade enzimática com caráter hidrofóbico e por isso com maior
afinidade para as bicamadas lipídicas dos lipossomas contrariamente à enzima nativa,
de características hidrofílicas. As formulações lipossomais com superóxido dismutase
nativa e acilada foram de dois tipos: lipossomas convencionais contendo estearilamida
(SA) (CORVO, 1997) e de longo tempo de circulação revestidos com polietilenoglicol
(LCL) (CORVO, 1999, 2002). Em todos os estudos comparativos realizados in vivo, as
formulações lipossomais foram preparadas com razões proteína/lipídeo iniciais entre
12 a 15 �g de enzima nativa ou acilada (concentrações intralipossomais de proteína)
por µmol de lipídeo. Os resultados obtidos são relatados a seguir.
A eficácia de encapsulação da superóxido dismutase em lipossomas variou com a
composição lipídica, o tipo de lipossomas e o tamanho, podendo ir até 80% em liposso-
mas SA (0,2 �m). No entanto, todas as formulações apresentaram valores de retenção
de atividade enzimática superiores a 90%.
Os valores mais elevados de eficácias de incorporação observados para superóxido
dismutase acilada resultam da maior afinidade desta pela bicamada lipídica dos liposso-
mas contrariamente à superóxido dismutase nativa (localizada no espaço interno aquo-
so). Estes resultados estão de acordo com o valor de coeficiente de partição em octa-
nol/água da enzima modificada, 20 vezes superior ao obtido para a nativa (3,13 contra
0,15, respectivamente) (MARTINS et alii, 1994).
Os lipossomas de superóxido dismutase nativa e modificada apresentaram ativida-
des enzimáticas na forma intacta bastante diferentes evidenciando a diferente localiza-
ção destas duas entidades enzimáticas no espaço lipossomal. Para os lipossomas da enzi-
ma acilada, 40 a 47% da enzima encontrava-se parcialmente exposta à superfície do li-
possoma, enquanto que para os lipossomas da forma nativa, este valor era inferior a 5%,
confirmando a sua localização no espaço interno aquoso.
Para os estudos de farmacocinética e biodistribuição, os lipossomas com superóxi-
do dismutase nativa e acilada foram marcados radioativamente através da co-encapsula-
ção do complexo 111In-DTPA e administrados intravenosamente. A monitoração do
seu comportamento in vivofoi realizada numa câmara �. A análise das imagens obtidas
(figura 13.7) mostra que no caso das formulações lipossomais LCL e SA no tempo zero,
o contorno do fígado, baço e região cardíaca eram visíveis. No entanto, após 24 h, no
caso da formulação SA, a região do coração já não era visível, evidenciando o desapare-
cimento da formulação do sangue, enquanto que para a formulação LCL, esta região
ainda era visível, mostrando que uma alta percentagem da dose injetada ainda se en-
CAPÍTULO 13 � ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNÓSTICOS 321
1ª prova
contrava em circulação. De fato, após 48 h, ainda se detectou em circulação 23% da
dose administrada, enquanto que para as outras duas formulações após 24 h só se obser-
vou cerca de 10% da dose administrada (CORVO et alii, 1999).
Os perfis sanguíneos obtidos para as diferentes formulações lipossomais de supe-
róxido dismutase em ratos com artrite adjuvante, após administração intravenosa das
formulações enzimáticas, mostraram que o revestimento dos lipossomas com polietile-
noglicol associado a seu pequeno tamanho são fatores favoráveis para a obtenção de
longos tempos de circulação da enzima.
Em termos de acumulação nos locais de inflamação em ratos com artrite adjuvan-
te, o resultado mais importante observado foi a acumulação muito superior (10 vezes)
observada na pata inflamada comparativamente à pata normal obtida com lipossomas
LCL (figura 13.7).
Os estudos de farmacocinética e biodistribuição das formulações lipossomais com
a enzima modificada demonstraram que a presença da enzima na superfície dos lipos-
somas não se traduziu em alterações no comportamento in vivo dos lipossomas, isto é,
na acumulação nos locais de inflamação, que seguiram o perfil observado para as
formulações da enzima nativa.
Para a avaliação do efeito terapêutico das diferentes formulações de superóxido
dismutase nativa, foi calculada a regressão do edema provocado no final do esquema de
tratamento. Realizaram-se estudos do efeito da dose (dose única de 33, 198 e 363 �g) e
da freqüência de tratamento (1 a 11 administrações de 33 �g de enzima por animal).
Ambas as formulações lipossomais mostraram um efeito terapêutico significativamente
superior quando comparados com a enzima não encapsulada para as doses estudadas.
No entanto, só a formulação LCL apresentou efeito terapêutico significativamente dife-
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO322
1ª prova
Figura 13.7 Imagens obtidas com uma câmara �, às 0 h e 24 h, para os lipossomas SA e lipossomas
LCL (Corvo et alii, 1999).
t = 0h
t = 24h
SA 200nm LCL 110 nm
rente para a dose mais baixa. Comparando os dois sistemas lipossomais, o efeito tera-
pêutico da formulação LCL foi superior em todas as doses relativamente aos lipossomas
SA. Observou-se ainda que com 6 administrações, apenas, a formulação LCL já apresen-
tava o seu efeito máximo (CORVO et alii, 2002).
Deste estudo pode-se concluir que o tipo de lipossomas, seu tamanho, dose e nú-
mero de administrações são fatores importantes. O revestimento de lipossomas com po-
lietilenoglicol confere superioridade a estes sistemas no transporte de superóxido dis-
mutase para os locais de inflamação, sendo o seu tamanho (aproximadamente de 0,10
µm) um fator crítico.
O efeito terapêutico comparativo das formulações lipossomais, quer LCL quer SA,
de superóxido dismutase nativa e acilada, foi avaliado através do diâmetro da pata infla-
mada, que mede o inchaço da articulação, e do volume da pata, que relaciona a intensi-
dade do edema na articulação e nos tecidos moles. O esquema de tratamento utilizado
foi constituído por uma injeção única das diversas formulações lipossomais com uma
dose de 363 µg de SOD por rato. Observou-se redução mais rápida do volume da pata
inflamada para os lipossomas de superóxido dismutase acilada 4 dias após a injeção das
formulações comparativamente aos lipossomas da forma nativa (GASPAR et alii, 2007)
A presença de superóxido dismutase acilada nas superfícies dos lipossomas permite que
estes exerçam o seu efeito terapêutico mesmo antes do rompimento das vesículas. Esta
é uma vantagem em relação aos lipossomas da enzima nativa, nomeadamente em
situações de isquemia seguida de reperfusão.
Os exemplos de terapia enzimática envolvendo a modificação química e posterior-
mente associação a lipossomas podem ser utilizados para a incorporação de outras enzi-
mas de características hidrofóbicas.
USO DE ENZIMAS EM DIAGNÓSTICOS
Durante muito tempo, o diagnóstico clínico utilizou principalmente métodos quími-
cos. Recentemente, diversas enzimas com excelente especificidade pelo substrato fo-
ram desenvolvidas e são empregadas como catalisadores em diagnósticos. Da mesma
forma que as enzimas de uso terapêutico, o uso de métodos de ensaio enzimáticos para
diagnósticos foi facilitado pelos avanços das áreas bioquímica e biomédica que permiti-
ram a identificação e caracterização de enzimas/metabólitos relevantes e pelo desen-
volvimento da biologia molecular, que tornou possível a produção de enzimas em gran-
des quantidades com custos mais convenientes. O mercado de diagnósticos pode ser di-
vidido em três categorias principais (GOLDBERG, 2005; KOPETZKI et alii, 1994;
MUROOKA e YAMASHITA, 2001):
Métodos enzimáticos em análises clínicas
Através do uso de enzimas, é possível analisar uma substância específica a partir de
amostras biológicas sem necessidade de isolamento, o que simplifica o processo e dimi-
nui o tempo de ensaio. As enzimas utilizadas em análises clínicas são usadas como insu-
mos em kits de reagentes. Estes kits reagentes são empregados em instrumentos alta-
CAPÍTULO 13 � ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNÓSTICOS 323
1ª prova
mente automatizados que analisam amostras biológicas e servem de auxiliares para o di-
agnóstico e tratamento de doenças. Exemplos de enzimas empregadas para este fim são
apresentados na tabela 13.4.
Tabela 13.4 Exemplos de enzimas empregadas em análises clínicas
Enzima Substrato avaliado
álcool desidrogenase álcool
álcool oxidase álcool
aldeído desidrogenase indicador p/ reações que produzem acetaldeído
catalase/aldeído desidrogenase ácido úrico
colesterol oxidase/peroxidase colesterol
colesterol oxidase colesterol total
creatinase creatinina e creatina
creatininase creatinina
Glicose-6-P desidrogenase/hexoquinase glicose e ATP
glicose oxidase (/peroxidase) glicose
�-glicosidase �-amilase
�-glicosidase � -amilase
�-glucuronidase esteróides
glutamato desidrogenase/urease uréia
glicerol-3-P desidrogenase triglicérides e glicerol, indicador em ensaios de
aldolase, triose-P isomerase e glicerol quinase
lactato desidrogenase indicador em ensaios de GPT
lactato desidrogenase/piruvato quinase indicador em reações em que ADP, ATP ou
piruvato são produtos
lipase/glicerolquinase/glicerol-3-P
oxidase/peroxidase
triglicérides e glicerol
malato desidrogenase oxaloacetato e malato
malato desidrogenase/fosfoenolpiruvato
carboxilase
CO2/carbonato
maltose fosforilase �- amilase
mutarotase/glicose oxidase/peroxidase glicose
sarcosina oxidase creatinina e creatina
sacarose fosforilase fosfato inorgânico
urease uréia
uricase/peroxidase/aldeído desidrogenase ácido úrico
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO324
1ª prova
Enzimas marcadoras em imunodiagnósticos
Enzimas para imunodiagnósticos são usadas como marcadores em sistemas ELISA, por
exemplo, e são ligadas a um anticorpo para testar de forma bastante específica a presen-
ça da substância alvo. Exemplos: fosfatase alcalina, peroxidase e uréase.
Enzimas avaliadas em diagnósticos clínicos de doenças
Alterações em sistemas enzimáticos estão envolvidas em muitas doenças. Assim, a avalia-
ção dos níveis enzimáticos em amostras biológicas vem sendo cada vez mais empregada
em diagnósticos clínicos de doenças. A tabela 13.5 apresenta exemplos de enzimas
utilizadas com este fim.
Tabela 13.5 Exemplos de enzimas empregadas em diagnósticos clínicos de doenças
Enzima avaliada Doença alvo
Fosfatase ácida Câncer de próstata,doença de Gaucher
Alanina aminotransferase Problemas hepáticos
Fosfatase alcalina Problemas hepatobiliares e ósseos
Amilase Pancreatite aguda
Enzima conversora angiotensina Doença de Gaucher, leprose, cirrose biliar
Aspartato aminotransferase Tecidos danificados (coração, fígado, rim)
Colinesterase Exposição a organofosfatos
Creatinina quinase Problemas cardíacos/musculares
Gama glutamiltransferase Problemas hepáticos
Lactato desidrogenase Infarto do miocárdio, câncer de testículo
Renina Hiperaldoteronismo
PERSPECTIVAS
O desenvolvimento de aplicações de enzimas como medicamentos e em diagnósticos
tem sido considerável nos últimos anos, refletindo a magnitude da potencialidade des-
tes catalisadores biológicos. Este é um setor com perspectiva de crescimento acentuado
impulsionado pelos avanços em biologia molecular, genômica, proteômica e engenha-
ria de proteínas. O crescente conhecimento das doenças em nível molecular permite o
desenvolvimento de terapias mais específicas, portanto mais eficientes e menos sujeitas
a efeitos colaterais, e diagnósticos mais precisos. Adicionalmente, com os conhecimen-
tos adquiridos, é teoricamente possível expressar qualquer proteína ouenzima de inte-
resse, proveniente de qualquer fonte, em células microbianas, vegetais ou animais, pos-
sibilitando a produção de enzimas com rendimentos e custos mais convenientes. É es-
perada também uma grande contribuição das novas estratégias de formulação, como
CAPÍTULO 13 � ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNÓSTICOS 325
1ª prova
por exemplo, a conjugação com moléculas como polietilenoglicol e o uso de sistemas
de transporte/direcionamento, como os lipossomas, para aprimorar o uso terapêutico
das enzimas. Grandes avanços também são esperados no campo de proteínas artificiais
com atividade catalítica.
Novos usos terapêuticos e em diagnósticos, ainda em fase de pesquisa, represen-
tam um potencial que pode repercutir de maneira ainda mais significativa no mercado
mundial destas enzimas, estimado em mais de um bilhão de dólares por ano.
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