Invertase: Enzima Sacarase

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INVERTASE
 Alexandre Valiatti do Prado
 7 CB (ICB – UPE)
> Introdução
Nome sistemático: β-fructofuranosídeofrutohidrolase.
É uma enzima sacarase, pois hidrolisa a sacarose, formando a mistura glicose + frutose, que recebe o nome de açúcar invertido, já que ela é um isômero óptico levógiro, ou seja, é capaz de desviar a luz plano polarizada no sentido anti-horário (L), ao contrário da solução aquosa de sacarose (o substrato da invertase).
A invertase é encontrada principalmente em leveduras da sp Saccharomyces cerevisiae, mas também pode ser encontrada em vários outros organismos, p. ex.: invertebrados, vertebrados, bactérias (p. ex. E coli), vegetais (em que quanto maior o grau de amadurecimento do fruto, maior a atividade da enzima, como acontece com o mamão papaya) e fungos (p. ex.: Penicillium chrysogenum).
Importância histórica
1ª das carboidrases a ser estudada, ainda no século XIX;
Uso como enzima-modelo para estudos da catálise enzimática (modelo cinético de Michaelis-Menten).
Aplicações bastante diversificadas
 Na forma solúvel: produção do xarope de açúcar invertido, a fabricação de bombons com centro liquefeito, a hidrólise de açúcares como a rafinose, gentianose e inulina, para obter, respectivamente, melibiose, gentiobiose e frutose, uso em produtos líquidos de higiene oral e remoção parcial da sacarose de resíduos líquidos (ex. melaço de cana-de-açúcar) para evitar a cristalização do açúcar no armazenamento do melaço ou para promover o enriquecimento de meios de cultura cujos microrganismos não fermentam sacarose.
 
Na forma insolúvel: em eletrodo enzimático de biossensores (associada a glicoseoxidase) e em biorreatores, para a produção de frutoligossacarídeos, xarope de açúcar invertido e efluentes açucarados com baixo teor de sacarose.
Grande importância a nível mundial, para as indústrias alimentícia e sucro-alcooleira.
O Brasil não a produz, apesar da enorme disponibilidade de biomassa residual nas indústrias.
Reações catalisadas
A invertase hidrolisa a ligação osídica (αβ) de glicídios que têm um radical β- fructofuranosil não substituído. Mecanismo da reação:
EH + ‎C12H22O11 EH-‎C6H12O6 + ‎C6H12O6 (glicose)
EH-‎C6H12O6 + H2O EH + ‎C6H12O6 + ‎OH−
pH ótimo de atuação: de 4,6 a 5;
Temperatura: entre 35 °C e 50 °C;
[ ] ótima de substrato: 120 g/L.
Quando a [ ] da solução de sacarose está acima desse valor (conseq. há diminuição da atividade de água -aw-), a invertase 
apresenta também atividade transferásica (formação de uma ligação osídica), como ilustrado pela reação abaixo: 
 EH-‎C6H12O6 + C12H22O11 EH + C18H32O16 + ‎OH−
Na ação hidrolítica da invertase, verifica-se que normalmente a energia de ativação da reação aumenta, em virtude do controle da velocidade de hidrólise pela difusão da sacarose no meio reacional.
Vantagens da hidrólise enzimática, em relação à ácida (HCl)
Não há a formação de produtos indesejáveis;
Menores gasto de energia e corrosão do equipamento, por demandar condições muito mais brandas de pH e temperatura
Rendimento mais elevado (> 70%);
Bem menos prejudicial à saúde dos operadores e ao meio ambiente;
Velocidade inicial de hidrólise muito maior que a enzimática.
 
Desvantagens da hidrólise enzimática
Quando a invertase está na forma solúvel no meio reacional (alta solubilidade à ele), tem que se operar o biorreator pelo modo batelada simples (descontínuo), o que implica em renovar a quantidade de enzima a cada nova catálise, encarecendo muito todo o processo, ao passo que o HCl é um reagente muito mais barato e a reação pode ser conduzida em biorreator tubular no modo contínuo;
Necessidade de se recuperar e reutilizar a enzima para torná-la competitiva;
Usá-la na forma insolúvel (imobilizada), que permite operar o reator em modo contínuo (batelada alimentada).
A invertase pode ser imobilizada em muitos suportes e por meio de todos os métodos conhecidos, com resultados satisfatórios nos seguintes suportes: alginato de cálcio, quitina de Krill, polietileno de baixa densidade, etc...
Pequena diferença em relação à ΔG da energia global da reação catalisada pela invertase imobilizada em relação à forma solúvel (cerca de 10% para + ou para -). 
Obtenção, extração e purificação
A invertase é obtida principalmente via fermentação realizada por Saccharomyces cerevisiae, que produz duas formas da enzima: a externa, que fica na parede celular e associada a manana e a interna, localizada livre no citoplasma;
A invertase externa (principal tipo quanto à atividade) sofre um processo de glicosilação (inserção de dez unidades de manana p/ cada enzima), o que lhe confere proteção contra a ação de outras enzimas da levedura e possibilita a fixação da enzima na parede celular.
Deve haver a otimização da fermentação em relação aos parâmetros operacionais, modo de cultivo e mosto.
Mosto ideal: melaço de cana-de-açúcar.
Processo fermentativo: descontínuo-alimentado (controla a concentração de açúcares redutores no meio de cultivo, ameniza a repressão catabólica e economiza tempo).
Ao cumprimento de cada hora da fermentação (dura em média 4 h), deve-se retirar amostras do conteúdo do biorreator para 
Determinação de: concentração de células, atividade da invertase e concentração de açúcares redutores. 
- Finalizada a fermentação, as células são separadas por centrifugação do caldo e lavadas com água destilada estéril 
- Para extração:
 - Realiza-se suspensão: suspende-se as células em solução aquosa de bicarbonato de sódio 0,154 M, sob agitação por 24 h e a 45 ºC.
Ultrafiltração: a suspensão é filtrada e o vol. filtrado é recolhido e tratado com solução de ácido pícrico 0,13 M, por 3 h.
A invertase está no preciptado formado que é recolhido e seco a 40 ºC em estufa à vácuo.
Nesta etapa, tem-se a enzima no grau de pureza da maioria de suas aplicações. 
- Para obtenção de invertase com maior grau de pureza, deve-se dissolver o pó em solução tampão acetato 0,001 M e passar a solução em uma coluna com resina aniônica. Em seguida, elui-se a enzima com solução tampão acetato 0,1 M, recolhendo-se o 
fracionado e deixando-o em repouso por 6 h. 
A invertase está no preciptado, que é separado e deixado secar à 40 ºC em estufa á vácuo.
Para se prolongar a vida útil da enzima, utiliza-se uma técnica de secagem: liofilização.
Propriedades
pH ótimo de atividade: de 4,5 a 5.
Temperatura ótima de atividade: 55 ºC.
Velocidade de hidrólise da enzima é proporcional ao grau de associação das moléculas de invertase no meio reacional.
Aplicações
Hidrólise da sacarose, para obtenção de xarope de açúcar invertido (por ter teor de dulçor 20% > sol. de sacarose de mesma concent. e por seus componentes não cristalizarem, é um produto muito utilizado nas indústrias de confeitaria e panificação).
Umectante para impedir o ressecamento de produtos. 
Componente de produtos de higiene oral, para evitar a formação de placa bacteriana.
Em biosssensores enzimáticos e amperométricos.
Em estudos de termoestabilidade.
Indicador de eficiência de operação unitária de conservação de alimentos; p. ex.: pasteurização de cerveja. 
 Preparado comercial 
 à base de invertase 
 Referências bibliográficas
- SAID, S.; PIETRO, R. C. L. R. Invertase (Cap.12). In: Michele Vitolo. Enzimas como agentes biotecnológicos. Ribeirão Preto: Ed. Legis Summa, 2004. Pág. 207-221.