Aula 6 reagentes marcados - técnicas

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Reagentes Marcados
Detectam / quantificam diretamente a ligação Ag – Ac
Pro. Fernando Ananias
DOSAGEM HORMONAL
Radioimunoensaio
e Eletroquimioluminescência
ELETROQUIMIOLUMINESCÊNCIA 
OU
QUIMIOLUMINESCÊNCIA ELETROGERADA
transferência elétron na superfície de um eletrodo com geração de
composto instável (excitado) que emite um fóton de luz. Ocorre como uma
reação de oxidação-redução em ciclo. Utiliza-se o rutênio Ru(bpy)3 2+
em presença da tripropilamina (TPA).
Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA
substrato 
(incolor)
 Qualitativos
 Quantitativos
 Direto = Ag
 Indireto = Ac
Ac marcados 
com Enzimas + + = CORAg
Fosfatase alcalina
Peroxidase
B-galactosidase
ELISA
http://www.netria.co.uk/images/elisa2.jpg
Imunofluorescência
luz

Ac + fluorocromo Ac + 
Fluorocromo

r
ght
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
Reagentes secundários:
Anticorpo secundário marcado com fluorocromo
proteína A marcada com fluorocromo = porção Fc das IgGs
Isotiocianato de fluoresceína (FITC) VERDE 
Ficoeritrina (FE) VERMELHA
Aplicações:
• Identificar subpopulações de linfócitos
• Identificar espécies bacterianas
• localização de hormônios
• Detecção complexos ag-ac em doenças auto-imunes
•Detecção anticorpos anti-DNA
• Teste qualitativo e quantitativo
Reação de Imunofluorescência Indireta utilizando-se antígeno de formas 
amastigotas de Leishmania infantum chagasi. 
(A) Amostra não reagente; (B) Amostra reagente.
Treponema Treponema pallidumpallidum
Pneumocystis cariniiPneumocystis carinii
Tripanosoma cruziTripanosoma cruzi
Giardia lambliaGiardia lamblia
 Tamanho
 Granulosidade 
 Fluorescência
CD4
CD8
CD20
Aplicações:
 Determinar o tipo e no de 
céls. sanguíneas brancas 
 isolar populações celulares
 distribuição de céls de acordo 
com a densidade dos Ag
 o tamanho celular.
 Uso de múltiplos anticorpos fluorescentes
HIV , Leucemias
Citometria de Fluxo
 Separação de células ativadas por fluorescência
 Anticorpos contra moléculas de membrana ou 
Antígenos do Conjunto de Diferenciação (CD)
 Cada Ac é marcado com um fluorocromo diferente
 Teste qualitativo e quantitativo
CD 4
CD 18
CD 125
CD 147
Eletroforese (SDS-PAGE)
• Gel poliacrilamida (acrilamida e bis-acrilamida)
• Azul de Coomassie (Coomassie Brilliant Blue) ou a Coloração de Prata (Silver Staining)
2) Transferência para membrana de nitrocelulose 
Transferência
Papel filtro
Gel/ membrana/ filtro
Tampão 
( +)
( - )
Gel
Membrana transferência
preenchimento
suporte
5) Revelação
Western Blotting
• Eletroforese de proteínas
• Diferença de tamanho (PM)
• Mobilidade da proteína
• Detecção Ag ou Ac