Bioquímica Clínica - Eletroforese

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ELETROFORESE
PROFA ANA CAROLINA ROCHA
O que é?
Refere-se à migração de solutos ou partículas carregadas 
dentro de um meio líquido sob a influência de um campo 
elétrico.
Fatores importantes:
- Carga elétrica líquida do soluto ou partículas;
- Tamanho e forma da molécula;
- Intensidade do campo elétrico
- Propriedades do meio de suporte
- Temperatura da operação
Esquema de um aparelho de eletroforese
placa
p
la
ca
eletrodos
tampa
suporte
ca
p
ila
r
cap
ilar
Fonte de energia:
Corrente constante ou 
tensão constante
Cuba eletroforética
Horizontal
Vertical
Tipos de meios de suporte
O gel de amido foi o primeiro material a ser
usado como um meio de suporte para
eletroforese. Ele foi usado para separar
macromoléculas de acordo com suas
cargas superficiais e seus tamanhos. Como
o preparo de um gel de amido reprodutível
é difícil, este meio é agora raramente
usado no laboratório clínico.
Gel de amido
Tipos de meios de suporte
As membranas do acetato de celulose são
filmes secos, opacos e quebradiços feitos
por tratamento da celulose anidrido
acético. Devem ser clareadas e amolecidas
antes do uso.
Acetato de celulose
Tipos de meios de suporte
Gel de Agarose
Ela é usada em eletroforese em gel de 
agarose (AGE) para a separação de vários 
analitos, incluindo (1) proteínas do soro, da 
urina e do fluido cerebrospinal (CSF), (2) 
variantes de hemoglobina, (3) isoenzimas e 
(4) lipoproteínas.
Tipos de meios de suporte
Gel de Poliacrilamida
O gel de poliacrilamida é termoestável,
transparente, durável e relativamente
inerte quimicamente, além disso, não
possuem carga, evitando a endosmose, e
são preparados em diferentes tamanhos de
poros.
Etapas da eletroforese
1. SEPARAÇÃO
1. Montagem da cuba com tampão
2. Suporte hidratado (gel)
3. Adicionar a amostra
4. Realização da separação por meio de 
corrente ou tensão elétrica constante
Etapas da eletroforese
2. DETECÇÃO DE COLORAÇÃO
1. Remoção do suporte 
2. Secar e usar um fixador
3. Coloração
4. Lavar
5. Secar
Etapas da eletroforese
TIPO DE SEPARAÇÃO CORANTE
Proteínas séricas Amido Black B
Azul Brilhante Cromassie
Ponceau S
Isoenzimas Azul de nitrotetrazólio
Lipoproteínas Fat Red
Óleo vermelho
Preto Sudan
DNA Brometo de etídeo
Proteínas do LCR Nitrato de prata
Tipos de eletroforese
ELETROFORESE DE ZONA
As técnicas de eletroforese de zona 
produzem zonas de proteínas, que 
são heterogêneas e fisicamente 
separadas uma das outras.
Suportes usados:
1. Gel de agarose (AGE)
2. Gel de acetato de celulose (CAE)
3. Gel de poliacrilamida (PAGE)
AAT, α1-antitripsina; 
ALB, albumina; 
AMG, α2-macroglobulina; 
BLP, β-lipoproteína; 
C3, complemento 3; 
FIB, fibrinogênio; 
Gamma, γ-globulina; 
HP, haptoglobina; 
TRF, transferrina
Tipos de eletroforese
ELETROFORESE EM 
PLACA DE GEL
Técnica que usa gel retangular 
independentemente da espessura, 
separa mais de uma amostra 
simultaneamente em uma mesma 
corrida.
Suportes usados:
1. Gel de agarose (AGE)
2. Gel de acetato de celulose (CAE)
3. Gel de poliacrilamida (PAGE)
Horizontal
Vertical
Tipos de eletroforese
ELETROFORESE EM
DISCO
Capilar de vidro
Tampão eletrostático
Gel
Gel de separação
Membrana semipermeável
Sifão
Técnica utilizada para provocar uma 
espécie de ”peneira” molecular.
Utiliza-se então um gel de separação com 
porosidade menor que o gel selecionado 
para correr a amostra. Neste sistema, 
quando a eletroforese começa, todos os 
íons da proteína migram facilmente pelos 
poros maiores e se acumulam sobre o gel 
de separação em uma zone muito fina, 
concentrando os componentes proteicos 
na borda, muito usado em materiais com 
baixo teor de proteínas (LCR).
Tipos de eletroforese
ELETROFORESE POR 
FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA
A Eletroforese por Focalização 
Isoelétrica (IEF) separa com 
resolução aumentada compostos 
anfotéricos, tais como proteínas, 
em um meio possuindo um 
gradiente de pH estável. A proteína 
migra para uma zona em que o pH 
do gel corresponde ao seu pI. Neste 
ponto, a carga da proteína se torna 
zero e a sua migração cessa.
Tipos de eletroforese
ELETROFORESE
BIDIMENSIONAL
A eletroforese bidimensional (2-D) é 
amplamente usada para (1) estudar 
famílias de proteínas, (2) pesquisar 
diferenças genéticas ou de doenças e (3) 
estudar o conteúdo proteico de células 
de vários tipos. 
Esta técnica usa IEF dependente de carga 
na primeira dimensão e a eletroforese 
dependente do peso molecular na 
segunda dimensão.
AMOSTRA
AMOSTRA
Separação 1ª 
dimensão
(carga)
Separação 1ª 
dimensão
(carga)
Focalização 
isoelétrica 
(IEF)
Aplicação do gel 
na 2ª etapa
Separação 2ª 
dimensão
(tamanho)
Eletroforese
Tipos de eletroforese
ELETROFORESE
BLOTTING
O Northern blotting é realizado exatamente da mesma forma que o 
Southern blotting, exceto por uma sonda marcada de RNA que é usada para 
a hibridização. O Western blotting é usado para (1) separar, (2) detectar e 
(3) identificar uma ou mais proteínas em uma mistura complexa. Ele 
envolve primeiramente a separação de proteínas individuais em gel de 
poliacrilamida e, então, a transferência, ou blotting, para uma tira de 
nitrocelulose ou uma membrana de nitrocelulose por blotting elétrico. A 
tira ou a membrana reage, então, com um reagente que contém um 
anticorpo produzido contra a proteína de interesse.
ELETROFORESE
BLOTTING PROTEINAS 
TRANSFERIDAS
1º ANTICORPO
MEMBRNA 
BLOQUEADORA
2º ANTICORPO COM ENZIMA
SUBSTRATO
COLORAÇÃO POR REAÇÃO ENZIMÁTICA
AZUL / VIOLETA
MARCADORES
Tipos de eletroforese
ELETROFORESE
CAPILAR
Na eletroforese capilar (CE), as 
técnicas clássicas de eletroforese 
são realizadas em um pequeno 
calibre, tubo capilar de sílica 
fundida que normalmente é 
revestido com uma fina capa 
(exterior) polimérica (poli-imida).
ELETROFORESE
CAPILAR
Eletroforese 
capilar em zona
Eletroforese 
IEF capilar
Eletroforese 
capilar em gel
capacidade de separar 
espécies carregadas 
eletroforeticamente
sem uma matriz do tipo 
peneira
diretamente comparável 
com a eletroforese em tubo 
ou placa, porque os 
mecanismos de separação 
são os mesmos.
Ela difere da IEF 
convencional na medida 
em que é realizada 
usando uma solução livre 
de anfólitos ou um gel 
pré-moldado.
Tipos de eletroforese
ELETROFORESE
EM MICROCHIP
Semelhante em princípio a CE, mas os 
microchips diferem dos capilares porque os (1) 
canais de separação, (2) os canais de injeção de 
amostra e (3) os reservatórios são todos 
fabricados no mesmo substrato planar usando-
se um processo fotolitográfico definido pela 
indústria microeletrônica. Além disso, (1) o 
preparo da amostra e/ ou reatores pré e pós-
coluna, (2) detectores e (3) as fontes de 
excitação também têm sido integrados aos 
chips.
ELETROFORESE 
PARTE II
ELETROFORESE DE PROTEÍNAS
As proteínas são macromoléculas compostas por aminoácidos, com 
ligações covalentes entre si, podem ser polares ou apolares, de acordo 
com o pH, devido à distribuição elétrica resultante das ligações 
covalentes ou iônicas de seus grupos estruturais.
ELETROFORESE DE PROTEÍNAS
Consiste em aplicar a amostra do soro em um meio sólido e submetê-
la a um potencial elétrico. As proteínas percorrem distâncias 
diferentes, formando bandas denominadas: 
Albumina
Alfa-1-globulina
Alfa-2-globulina
Betaglobulina
Gamaglobulina.
Corrida eletroforética normal
• Síntese prejudicada (cirrose hepática e viral)
• Aumento do catabolismo (infecção bacteriana grave, neoplasias, insuficiência 
cardíaca congestiva, doenças inflamatórias e infecciosas crônicas)
• Ingestão protéica inadequada (desnutrição)
• Perdas (glomérulos renais e intestinos) 
Hipoalbuminemia
GAMA GLOBULINAS
ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA
Em pH 8,0 – 9,0 a hemoglobina 
é uma proteína carregada 
negativamente, migrando em 
direção ao polo positivo. Esse 
método identifica as 
hemoglobinas normais e grande 
parte das variantes.
ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA
O emprego da eletroforese em 
ágar pH 6,2 é específico para 
diferenciar algunstipos de 
hemoglobinas mais lentas do que 
a Hb A, quais sejam: Hb S da Hb D
e Hb C da Hb E, que migram em 
posições similares em 
eletroforeses alcalinas.
Tipos de Hemoglobinas
Tipo de Hb Níveis aceitáveis Indicação
Hemoglobina A1 
12,1 a 16,3 g/dL
90% do total de Hb
Níveis baixos sugerem anemia por 
hemorragia
Hemoglobina A2 1,5 a 3,5 % do total Níveis aumentados indicam talassemia
Hemoglobina F
50 a 90% em neonatos
0 a 1% em adultos
Se estiver alto em adultos, indica 
talassemia
Hemoglobina S Sua presença é anormal Indica anemia falciforme
Plasma
5 mg/dL Níveis aumentados indicam anemia 
hemolítica
Hemoglobinas Variantes
Hemoglobina 
Variante
Manifestações clínicas
Hemoglobina S Anemia falciforme
Hemoglobina C Anemia hemolítica
Hemoglobina E Variante da cadeia beta, anemia hemolítica branda, 
microcitose, traço talassêmico beta
Hemoglobina F Talassemia beta, leucemias, distúrbios mieloproliferativos
Hemoglobina H Talassemia alfa
Hemoglobina de Bart Fetos com alfa talassemia. Alta afinidade com oxigênio, 
causando morte fetal ou poucos dias de vida.
HEMOGLOBINAS EM ELETROFORESE
AGAROSE ÁCIDAAGAROSE ALCALINA
ELETROFORESE DE LIPOPROTEÍNAS
1- Ano: 2014 Banca: INSTITUTO AOCP Órgão: UFGD Prova: Biomédico
A eletroforese de hemoglobina é utilizada para detecção de hemoglobinopatias. Assinale a 
alternativa que indica para que serve o emprego da eletroforese em Agar ácido.
a) A eletroforese em Agar ácido é específco para diferenciar alguns tipos de hemoglobinas 
mais lentas do que a Hb A.
b) A eletroforese em Agar ácido é utilizada para identifcar as hemoglobinas normais e grande 
parte das variantes
c) A eletroforese em Agar ácido é específca para diferenciar alguns tipos de hemoglobinas 
com propriedades diferentes de solubilidade.
d) A eletroforese em Agar ácido é utilizada para identifcar as variações nas frações e 
diferenciar as paraproteínas
e) A eletroforese em Agar ácido é específca para identifcar as variações de izoenzimas que 
representam a expressão de alguns tipos de hemoglobinas.
Gabarito A
https://www.qconcursos.com/questoes-de-concursos/provas/instituto-aocp-2014-ufgd-biomedico
2- Ano: 2010 Banca: FGV Órgão: FIOCRUZ Prova: Tecnologista em Saúde - Proteômica
Com relação às limitações da técnica de eletroforese bidimensional, assinale a 
alternativa incorreta.
a) É impossível se analisar todas as proteínas de uma amostra biológica em um único gel, 
devida a tremenda variação em abundância das proteínas.
b) Caso seja aumentada a quantidade proteínas visando a detecção de proteínas menos 
abundantes, o gel é sobrecarregado pelas proteínas de maior abundância e a resolução é 
perdida.
c) É necessário encontrar uma estratégia de solubilização e separação que atenda a todas as 
proteínas de uma amostra.
d) Proteínas de alto peso molecular (maiores que 200kDa) podem não migrar eficientemente 
no gel.
e) Proteínas muito pequenas (menores que 10kDa) se sobrepõem, devido a sua alta 
mobilidade no gel da primeira dimensão, o que resulta em perda de resolução.
Gabarito E
https://www.qconcursos.com/questoes-de-concursos/provas/fgv-2010-fiocruz-tecnologista-em-saude-proteomica
3- Ano: 2014 Banca: INSTITUTO AOCP Órgão: UFC Prova: Biomédico
Sobre eletroforese de proteína plasmática, assinale a alternativa que indica a substância 
que funciona como marcador nesta técnica.
a) Etanol.
b) Lugol.
c) Formol.
d) Vermelho de cresol.
e) Ácido acético.
Gabarito D
https://www.qconcursos.com/questoes-de-concursos/provas/instituto-aocp-2014-ufc-biomedico
4- Ano: 2016 Banca: IBFC Órgão: EBSERH Prova: Biomédico (HUAP-UFF)
Assinale a alternativa correta. A eletroforese de proteínas separa as proteínas séricas em
cinco frações. A fração em que se encontram a IgM e a IgG é:
a) Albumina
b) Alfa 1 globulinas
c) Alfa 2 globulinas
d) Beta globulinas
e) Gama Globulinas
Gabarito E
https://www.qconcursos.com/questoes-de-concursos/provas/ibfc-2016-ebserh-biomedico-huap-uff
5- Ano: 2016 Banca: IBFC Órgão: EBSERH Prova: Biomédico (HUAP-UFF)
Assinale a alternativa correta. Em um indivíduo adulto, saudável, sem doenças hemolíticas
ou hemoglobinopatias, a hemoglobina que deve aparecer em maior quantidade em uma
eletroforese de hemoglobina é a:
a) A1
b) A2
c) F
d) S
e) C
Gabarito A
https://www.qconcursos.com/questoes-de-concursos/provas/ibfc-2016-ebserh-biomedico-huap-uff