Diagnóstico de amebas

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Helena Lúcia Carneiro Santos 
 
 
 
 
 
Diagnóstico diferencial da amebíase: aplicação de métodos 
moleculares para a detecção e diferenciação de espécies de 
entamoeba spp. Em fezes humanas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Orientadores: Dr. José Mauro Peralta/UFRJ 
Dr. Alexandre Januário da Silva/CDC 
 
 
 
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO 
INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA 
PROF. PAULO DE GÓES 
 
 
 
 
RIO DE JANEIRO 
Agosto/2010
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação 
em Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo 
de Góes, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte 
dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em 
Ciências Biológicas (Microbiologia) 
 
 
 
 
 
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Santos, Helena Lúcia Carneiro 
Diagnóstico diferencial da amebíase: aplicação de métodos moleculares para 
a detecção e diferenciação de espécies de Entamoeba spp. em fezes 
humanas/Helena Lúcia Carneiro Santos – Rio de Janeiro, 2010. 
XXI, 176 
Tese Doutorado em Ciências (Microbiologia) 
Universidade Federal do Rio de Janeiro/Instituto de Microbiologia Prof. Paulo 
de Góes, 2010. 
 
Orientadores: Dr. José Mauro Peralta e Dr. Alexandre Januário da Silva 
Referências bibliográficas: f 102 
1. Entamoeba 2. PCR 3. Diagnóstico molecular 4. Luminex 5. 
Sequenciamento I. José Mauro Peralta II. UFRJ, Instituto de Microbiologia 
Prof. Paulo de Góes, Doutorado em Ciências (Microbiologia). III. Diagnóstico 
diferencial da amebíase: aplicação de métodos Moleculares para a detecção 
e diferenciação de espécies de Entamoeba spp em fezes humanas. 
 
iii 
 
 
 
 
 
Helena Lúcia Carneiro Santos 
 
 
 
 
DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DA AMEBÍASE: APLICAÇÃO DE MÉTODOS 
MOLECULARES PARA DIFERENCIAÇÃO DE ENTAMOEBA SPP. 
ENCONTRADAS EM FEZES HUMANAS 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro, 19 de agosto de 2010 
 
 
 
José M. Peralta, Ph.D., Universidade Federal do Rio de Janeiro (Orientador) 
 
 
 
Maria Aparecida Gomes, Ph.D., Universidade Federal Minas Gerais 
 
 
 
Adeilton Alves Brandão, Ph.D., Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ 
 
 
 
Marcio Neves Bóia, Ph.D., Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ 
 
 
 
Walter Oelemann, Ph.D., Universidade Federal Rio de Janeiro (Revisor) 
 
 
 
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O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Diagnóstico Imunológico e 
Molecular de Doenças Infecciosas, Departamento de Imunologia, Instituto de 
Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Centro de Ciências da Saúde (CCS), 
Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação do Prof José Mauro 
Peralta e no Laboratório de Parasitologia Molecular do Centers for Disease 
Control & Prevention (CDC) sob a orientação do Dr. Alexandre J. da Silva. 
 
 
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Não devemos nos embriagar pelas grandes alegrias e 
nem nos deixar abater pelas grandes frustações. 
Porque tudo na vida é passageiro!!! 
“Autor desconhecido” 
 
 
 
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AGRADECIMENTOS 
A Deus, meu grande amigo, que em todos os momentos me guia pelos 
melhores caminhos, restabelece minhas esperanças e sonhos, dá vida a minha 
vida e está sempre presente em meus problemas, necessidades, nos meus 
desafios e nas minhas alegrias. Tu és maravilhoso. 
À minha irmã América, minha maior torcida e pela sempre disposição em 
me ajudar. Muito, muito obrigada!!!!! 
Aos meus mais sinceros agradecimentos ao Dr. José Mauro Peralta pela 
orientação, pela confiança, pelos conselhos e incentivos nas dificuldades. 
Obrigada Peralta! 
Ao Dr. Alexandre Januário da Silva pela oportunidade de estagiar e me 
orientar durante onze mEses (doutorado sanduíche) no Centers for Disease 
Control and Prevention, onde grande parte deste trabalho se realizou. Obrigada 
pela acolhida, pelos ensinamentos e pela inestimável força durante este período. 
Você foi dez. Valeu !!! 
À Rebecca Bandea pelo acolhimento, carinho e pelas inumeráveis ajudas. 
Foi muito bom ter convivido com você. 
À Giliane Trindade, Isabel Mcauliffe, Marcos, Michael Omandi, pelos bons 
momentos de convivios e pelas inúmeras ajudas. Acho que eu deveria ter clonado 
vocês. 
Ao grupo do lab. 027, Filomena, Fabíola, Camille, Felipe Piedade, Felipe 
Cruz, Vânia, Giselle pelo convívio harmonioso. Em especial, a Jacqueline meu 
muito obrigada por sempre me receber com um sorriso e por ter quebrado meus 
galhos. 
A Drª Lúcia Teixeira por me receber sempre tão bem em seu laboratório e 
pelo exemplo de profissionalismo. Agradeço, ainda, pela atenção e cuidado que 
teve comigo durante o período do doutorado sanduíche. Meu muitissímo 
obrigada. 
Ao professor Walter Oelemann por sempre manter as portas de seu 
laboratório abertas para qualquer ajuda e por ter revisado a tese. O seu coração é 
infinitamente maior do que o seu tamanho. Muito obrigada!!! 
Aos meus amigos do grupo dos surtados da acrilamida: Laurinha, 
Margareth, Diva, Tiana, Jorge, Mauro “Jr’’, Didio, Bruna, Fadinha e Nathália pelas 
trocas de ideias, risadas, encontros, por me fazerem sentir sempre “em casa” e 
tornarem o meu cotidiano muito mais divertido. Espero que a chama da nossa 
amizade, solidariedade e do bem em comum do nosso grupo permaneça sempre 
acessa. Valeu!!!! 
Ao Carlos, gente muito fina que aturou todas as minhas bagunças no 
laboratório, pelo apoio técnico realizado nos bastidores, mas crucial para o 
andamento do trabalho. Você é dez!!!!! 
Ao Thiago Guimarães, que se tornou um anjo e está fazendo conexão 
direta com Deus. Obrigada por ter compartilhado comigo os momentos de 
estresse e sufoco durante os cultivos das amebas! Você deixou muita saudade. 
vii 
Ao Setor de Pesquisa Clínica do HUAP por ter autorizado e cedido a 
utilização do equipamento LUMINEX. E ao Santiago por sempre estar disposto a 
me ajudar. 
À Bruna de Paula Fonseca do LATED de Biomanguinho/FIOCRUZ pela 
sua simpatia, cordialidade e pela troca de experiência na utilização do 
equipamento LUMINEX 200. Muito obrigada!!! 
À minha chefe e amiga, Maria Conceição do IFF/FIOCRUZ, por ter me 
concedido a licença integral durante todo o período do doutorado. 
Ao CNPq, pelos quatro anos de bolsa (incluindo a bolsa swe). 
À coordenação da pós-graduação do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo 
de Góes, na pessoa da Profª Ana Paula Vieira Colombo. 
Ao Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, na pessoa da Profª 
Agnes Marie de Sá Figueiredo. 
A todos que ajudaram, de qualquer forma, mas não foram citados aqui por 
falha minha. 
A todos vocês, minha eterna gratidão. 
 
 
 
“Cada pessoa que passa em nossa vida, 
passa sozinha, mas não vai só, nem nos deixa só; 
leva um pouco de nós mesmos, 
deixa um pouco de si mesma”. 
 Muito obrigada. 
 
 
viii 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dedico este trabalho aos meus pais Jair Santos (in 
memorian) e Luzia Carneiro Santos por ter me 
ensinado a caminhar na estrada da vida. 
 
ix 
RESUMO 
 
 
Helena Lúcia Carneiro Santos 
 
DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DA AMEBÍASE: APLICAÇÃO DE MÉTODOS 
MOLECULARES PARA A DETECÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DE ESPÉCIES DE 
ENTAMOEBA SPP. EM FEZES HUMANAS 
 
Orientadores: Dr. José Mauro Peralta e Dr. Alexandre Januário da Silva 
 
Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências 
(Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de 
Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Doutor em Ciências 
(Microbiologia). 
 
 
O gênero Entamoeba contém seis espécies que podem ser encontradas nas fezes humanas (E. 
histolytica, E. dispar, E. poleckii, E. moshkovskii, E. coli e E. hartmanni). Todas as espécies devem 
ser relatadas quando evidenciadas na amostra clínica. Porém, somente E. histolytica é capazde 
causar quadros de amebíase intestinal e extraintestinal, enquanto que as outras espécies são 
consideradas não patogênicas. E. histolytica, E. dispar, E. moshkovskii, E. poleckii e E. hartmanni 
são morfologicamente semelhantes, mas podem ser diferenciadas por métodos moleculares. Nos 
últimos anos, a reação em cadeia da polimerase (PCR) tem sido aplicada na diferenciação entre 
E. histolytica e E. dispar. Recentemente, houve uma crescente difusão na literatura sobre as 
técnicas do tipo multiplex incluindo a PCR em tempo real e a PCR seguida da reação de 
hibridação multianalítica em meio líquido utilizando microesferas fluorescente como suporte sólido 
associada a citometria de fluxo, sistema Luminex (PCR/Luminex). Estas técnicas visam detectar, 
simultaneamente, diferentes fragmentos de DNA em uma única amostra clínica e em um único 
tubo de reação. Este trabalho tem como objetivo aplicar técnicas moleculares inovadoras e do tipo 
multiplex no diagnóstico diferencial entre as espécies de ameba. Para tal foi utilizado a PCR 
seguido por sequenciamento, PCR em tempo real e a PCR/LUMINEX. Um total de 45 amostras de 
fezes positivas para uma ou mais espécies de Entamoeba na microscopia óptica foram 
identificadas na PCR/sequenciamento. Destas, seis amostras foram identificadas como E. 
histolytica, 29 como E. dispar, nove como E. hartmanii, uma como E. moshkovskii e cinco como E. 
coli. As sequências de rDNA das espécies de Entamoeba obtidas neste estudo foram alinhadas e 
utilizadas no desenho de oligonucleotídeos iniciadores, sondas específicas para cada espécies de 
Entamoeba e sondas grupo especifica (E. histolytica, E dispar, E. moshkovskii e E. hartmanni). 
Estes iniciadores e sondas foram empregados na padronização da PCR/Luminex. Na 
padronização da reação de hibridação multianalítica em meio líquido, utilizando microsferas 
fluorescente como suporte sólido, associada a citometria de fluxo foram desenhados sete 
oligonucleotídeos iniciadores e 23 sondas ao todo para as seguintes espécies: E. histolytica, E. 
dispar, E. hartamanni, E. coli, E. moshkovskii, e sondas grupo especificas. Observamos alto sinal 
de fluorescência na reação de hibridação em meio líquido, quando utilizamos produto amplificado 
x 
biotinilado obtido a partir de DNA clonado de E. dispar, E.coli, E. hartmanni e E. moshkovski. No 
entanto, a sonda para E. histolytica apresentou uma intensidade de fluorescência média. Um total 
de 34 amostras clínicas foram utilizadas na PCR/Luminex e os resultados mostraram que o teste 
foi capaz de identificar especificamente E. histoltyica, E. dispar, E hartmanni, E. coli e E. 
moshkovskii. Estes resultados preliminares sugerem que este método pode ser útil na 
identificação de amebas entéricas. 
 
 
Palavras-chave: Amebíase, métodos moleculares, citometria de fluxo empregando 
microsesferas fluorescentes, sequenciamento, PCR, Entamoeba spp. 
 
 
Rio de Janeiro 
Agosto de 2010 
 
xi 
ABSTRACT 
 
 
Helena Lúcia Carnerio Santos 
 
DIFFERENTIAL DIAGNOSIS OF AMEBIASIS: APPLICATION OF 
MOLECULAR METHODS FOR DETECTION AND DIFFERENTIATION OF 
SPECIES OF ENTAMOEBA SPP. IN HUMAN FECES 
 
Advisers: José Mauro Peralta and Alexandre Januário da Silva 
 
Summary of thesis submitted to the Graduate Program in Science (Microbiology), Institute of 
Microbiology Prof. Paulo de Góes, Federal University of Rio de Janeiro, as part of the requirements 
for obtaining the title of Doctor of Science (Microbiology). 
 
 
The genus Entamoeba comprises six species which can be found in human feces (E. histolytica, E. 
dispar, E. poleckii, E. moshkovskii, E. coli and E. hartmanni). All species should be reported when 
detected in clinical samples. However, only E. histolytica can cause intestinal amebiasis and extra-
intestinal, while other species are considered nonpathogenic. E. histolytica, E dispar, E. 
moshkovskii, E. poleckii and E. hartmanni are morphologically similar but can be differentiated by 
molecular methods. In recent years, polymerase chain reaction (PCR) has been applied to 
differentiate E. histolytica and E. dispar. Recently, there has been a growing spread in the literature 
on multiplex assays such as real time PCR and PCR followed by multi-analytical hybridization 
using fluorescent microspheres as solid supports coupled with flow cytometry, Luminex 
(PCR/Luminex system). These techniques aim to detect different DNA fragments simultaneously in 
a single clinical specimen and in a single reaction tube. This work aims to apply molecular 
techniques and innovative multiplex in the differential diagnosis of the species of amoeba. We used 
the PCR/sequencing, real-time PCR and PCR/System LUMINEX. A total of 45 stool samples 
positive for one or more species of Entamoeba in optical microscopy were identified by PCR/ 
sequencing. Of these, six were identified as E. histolytica, 29 as E. dispar, nine as E. hartmanii , 
one as E. moshkovskii and five as E. coli. The sequences of the rDNA species of Entamoeba 
obtained in this study were aligned and used to design oligonucleotide primers, probes specific for 
each species group and Entamoeba (E. histolytica, E. dispar, E. moshkovskii and E. hartmanni) 
specific probes. These primers and probes were used in the standardization of PCR/Luminex. In 
the standardization of the hybridization reaction of multi-analysis in liquid medium using fluorescent 
microspheres as solid support, coupled with flow cytometry were designed seven primers, 23 
probes for the following species: E. histolytica, E. dispar, E. hartamanni, E. coli, E. moshkovskii, 
and group specific probes. A strong fluorescence signal was observed in the reaction of 
hybridization in liquid medium when using biotinylated amplified product obtained from DNA cloned 
from E. dispar, E. coli, E. hartmanni and E. moshkovski in PCR. However, the probe for E. 
histolytica showed mean fluorescence intensity. A total of 34 clinical samples were used in 
PCR/Luminex and the results showed that the test was able to specifically identify E. histoltyica, E. 
xii 
hartmanni, E. moshkovskii, E. coli and E. dispar. These preliminary results suggest that this 
method may be useful in identifying enteric amoebae. 
 
 
Key Words: Amebiasis, molecular methods, flow cytometry using fluorescent 
microspheres, sequencing, PCR, Entamoeba spp. 
 
 
Rio de Janeiro 
August of 2010 
 
xiii 
LISTA DE ABREVIATURAS 
% Porcentagem 
 °C Graus Celsius 
µg Micrograma 
µl Microlitro 
µM Micro Molar 
Bp Pares de base 
CDC Centers for Diseases Control and Prevention 
cm Centímetro 
cols Colaboradores 
CT “Cycle treshold” (limiar de detecção) 
DNA Ácido desoxiribonucleico 
dNTP Desoxinucleotídeos 
E. hart Entamoeba hartmanni 
E. moshki Entamoeba moshkovskii 
E. coli Entamoeba coli 
E. disp Entamoeba díspar 
E. hist Entamoeba histolytica 
EDC (N-(3-dimetil aminodipropil)-N’etilcarbodiimida) 
EDTA Acido etilenodiamino tetra-acético 
ELISA “Enzyme Linked Imunosorbent Assay” (Ensaio imuno-
enzimático) 
EPF Exame Parasitológico de Fezes 
EUA Estados Unidos da América 
FAM 6-carboxifluoresceína 
Fig Figura 
FRET “Fluorescence Ressonance Energy” (Transferência de 
energia por ressonância de fluorescência) 
HBV Vírus da Hepatite B 
HCV Vírus da Hepatite C 
HEX Hexaclorocarbonilfluoresceína 
HIV Vírus da imunodeficiência adquirida 
HPV Papiloma Vírus Humano 
Kb Kilobases 
xiv 
kDa Kilodaltons 
LB Luria Bertani 
LSSP-PCR Low Stringency single primer (PCR em baixa 
estringência, usando um único iniciador) 
M Molar 
Mabs Anticorpos monoclonais 
MIF Intensidade de fluorescência mediana 
ml Mililitro 
mM Milimolar 
N Número de amostras 
NBLAST Nucleotide Basic Local Allignment Search Tool 
OMS Organização Mundial da Saúde 
PBS Solução Tampão Salina- Fosfato 
PCR Polymerase chain reactions (Reação em Cadeia da 
Polimerase) 
PCR/Luminex PCR seguida da reação de hibridação multianalítica em 
meio líquido utilizando microesferas fluorescentecomo 
suporte sólido associada a citometria de fluxo 
pH Potencial hidrogeniônico 
pmol Picomol 
PPS Solução de Precipitação de proteínas 
PVA Álcool polivinilico 
PVP Polivinilpirilidona 
RAPD Randomly Amplified Polimorphic DNA (DNA polimórfico 
amplificado ao acaso) 
RAP-PCR RNA Arbitrarily Primed-PCR (RNA amplificado aleato-
riamente) 
rDNA DNA ribossômico 
RFLP Perfis dos fragmentos obtidos por endonucleases de 
restrição 
Rpm Rotação por minuto 
S Segundos 
SA-PE Streptavidina-R-Ficoeritrina 
SDS Dodecil sulfato de sódio 
Spp Espécies 
ß-galactosidase Beta-galactosidase 
xv 
SSU-rDNA Subunidade menor do DNA ribossômico 
TaqDNA DNA Polimerase Termoestável 
TBE Tris Borato EDTA 
TE Tris –EDTA 
TMAC Cloreto de tetrametilamonio 
Tris Hidroxi-metil-amino-metano 
Tris-HCl Tris-ácido clorídrico 
tRNA RNA transportador 
U Unidades 
UFF Universidade Federal Fluminense 
V Volts 
v/v Volume por volume 
x Concentração 
Χg Vezes o valor da gravidade 
 
xvi 
LISTA DE QUADROS 
Quadro 1. Características utilizadas na diferenciação de trofozóitos de 
amebas encontrados no intestino grosso humano 3 
 
Quadro 2. Características utilizadas na diferenciação de cistos maturos 
de amebas encontrados no intestino grosso do humano 3 
 
Quadro 3. Sequência alvo e oligonucleotideos iniciadores utilizado na 
PCR convencional descritos na literatura 18 
 
 
 
xvii 
LISTA DE FIGURAS 
Figura 1. Representação esquemática das etapas realizadas neste 
trabalho 32 
 
Figura 2. Mapa do vetor de clonagem pCR 2.1 TOPO (Invitrogem) 43 
 
Figura 3. Representação esquemática da microesfera de poliestireno 
de 5,6 µm recoberta por grupamentos carboxila e da sonda 
ligada a um espaçador de carbono e um grupamento amina 46 
 
Figura 4. Gel de agarose a 2%. Amplificação de DNA de Entamoeba 
spp. usando o par de oligonucleotideo JVF/DSPR2 52 
 
Figura 5. Gel de agararose a 1,5 %. Amplificação utilizando o par de 
iniciador JVF/DSRP2 para confirmar a presença do inserto 
durante o processo da clonagem molecular 57 
 
Figura 6. Análise dos clones obtidos em eletroforese de gel de agarose 
2 % através da digestão com a enzima de restrição EcoRI 58 
 
Figura 7. Gel de agarose a 2%. Amplificação de DNA de Entamoeba 
spp. 63 
 
Figura 8. Árvore filogenética obtida a partir da análise de sequências 
parcial do gene que codifica para o SSU-rRNA das espécies 
de Entamoeba identificadas neste estudo 119 
 
Figura 9. Representação esquemática do loca de hibridação das 
sondas com as suas respectivas sequências alvos 121 
 
 
xviii 
LISTA DE TABELAS 
Tabela 1. Frequências das parasitoses intestinais nas amostras 
proveniente do Serviço de Saúde Pública dos EUA 50 
Tabela 2. Frequências das parasitoses intestinais nas amostras 
proveniente de Ilhéus na Bahia 51 
Tabela 3. Resultados obtidos nas amostras de cultura padrão, pela 
PCR em tempo real e na PCR/Sequenciamento 53 
Tabela 4. Resultados obtidos no exame parasitológico de fezes, na 
PCR em tempo real e na PCR/ Sequenciamento nas 
amostras de fezes oruindas do Serviço de Saúde Pública 
da Geórgia, EUA 54 
Tabela 5. Resultados obtidos no exame parasitlógico de fezes, na 
PCR em tempo real e na PCR/Sequenciamento das 
amostras de fezes de indivíduos moradores de Ilhéus na 
Bahia, Brasil 56 
Tabela 6. Sondas de captura do tipo grupo e espécie específica 
utilizadas no ensaio multi-analítico em meio líquido na 
PCR/Luminex 61 
Tabela 7. Oligonucleotídeos iniciadores desenhados e utilizados na 
PCR/Luminex 62 
Tabela 8. Novos Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na PCR e 
sondas na reação de hibridação multianalitica 66 
Tabela 9. Relação das sondas que apresentaram sinais específicos 
de fluorescência na PCR/Luminex 70 
Tabela 10. Resultados das mif obtidas na PCR/sistema Luminex em 
12 amostras clínicas amplificadas com o par de iniciador 
JVF/Entarev390b 72 
Tabela 11. Resultados das MIF obtidas na PCR/Sistema Luminex de 
oito amostras clínicas amplificadas com o par de iniciador 
JVF/Enta417A-B 73 
Tabela 12. Comparação entre os resultados da PCR/Luminex com a 
PCR em tempo real, PCR/sequenciamento e com a análise 
microscópica de amostras clínicas 74 
Tabela 13. Resultados da PCR/Luminex e da PCR em tempo real em 
15 amostras clínicas 75 
 
 
 
xix 
LISTA DE GRÁFICOS 
Gráfico 1. Resultados dos ensaios de hibridação multianalítica 
realizada a 46º C/1h com diferentes combinações de 
sondas, para a detecção e diferenciação de espécies de 
Entamoeba spp. 64 
 
Gráfico 2. Resultados dos ensaios de hibridação multianalítica 
realizada a 41º C/1h com diferentes combinações de 
sondas, para a detecção e diferenciação de espécies de 
Entamoeba spp. 67 
 
Gráfico 3. Resultados dos ensaios de hibridação multianalítica 
realizada a 43º C/1h com diferentes combinações de 
sondas, para a detecção e diferenciação de espécies de 
Entamoeba spp. 68 
 
Gráfico 4. Resultados dos ensaios de hibridação multianalítica 
realizada a 46º C/1h com diferentes combinações de 
sondas, para a detecção e diferenciação de espécies de 
Entamoeba spp. 68 
 
Gráfico 5 Resultados dos ensaios de hibridação multianalítica 
realizada a 48º C/1h com diferentes combinações de 
sondas, para a detecção e diferenciação de espécies de 
Entamoeba spp. 69 
 
 
 
xx 
SUMÁRIO 
Lista de Abreviaturas 
Lista de Quadros 
Lista de Figuras 
xiii
xvi
xvii
Lista de Tabelas xviii
Lista de Gráficos xix
 
1. INTRODUÇÃO 1
 
2. OBJETIVOS 31
 2. 1 Geral 31
2. 2 Específicos 31
 
3. MATERIAL E MÉTODOS 32
3. 1 Amostragem 33
3. 2 Amostras Controles 33
3. 3 Exame Parasitológico de Fezes (EPF).. 33
 3. 3.1 PARATEST® 34
 3. 3.2 Método de Richtie modificado 34
3. 4 Extração do DNA 35
3. 5 PCR em Tempo Real (Sistema TaqMan). 37
3. 6 PCR/Sequenciamento 38
 3. 6.1 Análise do produto amplificado 38
 3. 6.2 Purificação do produto amplificado 39
 3. 6.3 Reação de sequenciamento 39
 3. 6.4 Purificação dos produtos sequenciados 40
 3. 6.5 Sequenciamento dos produtos 40
 3. 6.6 Análise das sequências 41
3. 7 Análise Filogenética 41
3. 8 Clonagem Molecular 42
3. 9 Extração do DNA Plasmidial de E. coli (Minipreparação) 44
3.10 Reação de hibridação em meio líquido utilizando microesferas
fluorescente como suporte sólido associada a citometria de fluxo, 
sistema Luminex 44
3.10.1 Desenho dos oligonucleotídeos utilizados na PCR/Luminex 45
3.10.2 PCR/Luminex 47
3.10.3 Ligação das sondas de DNA amino modificadas á superfície 
das microesferas carboxiladas 47
3.10.4 Reação de hibridação multianalítica em meio líquido utilizando 
microesferas fluorescente como suporte sólido associada a 
citometria de fluxo, sistema Luminex® 48
 
4. RESULTADOS 50
4. 1 Exame parasitológico de fezes 50
4. 2 PCR/Sequenciamento 51
4. 3 Clonagem Molecular 57
4. 4 Análise das Sequências 59
xxi 
4. 5 Reação de hibridação multianalítica em meio líquido, utilizando
microesferas fluorescentes como suporte sólido associado a 
citometria de fluxo, sistema Luminex 60
 
5. DISCUSSÃO 76
6. CONCLUSÃO 101
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 102
ANEXOS 117
Anexo 1. Árvore filogenética obtida a partir da análise da sequência 
parcial do gene que codifica a SSU-rRNA das espécies de 
Entamoeba identificadas neste estudo 118
Anexo 2. Representação esquemática do local de hibridação das 
sondas com as suas respectivas sequências alvos 120
Anexo 3. Alinhamento das sequências parciais de referências do 
GenBank utilizando o programa Clustal W inserido no pacote 
do programa GeneStudio suite 122
Anexo 4. Alinhamento da sequência parcial do gene SSU-rRNA de E. 
moshkovskii 126
Anexo 5. Regiões polimórficas presente no gene SSU-rRNA de E. 
hartmannii obtidas a partir do alinhamento das sequências 
deste estudo 128
Anexo 6. Regiões polimórficas presente no gene SSU-rRNA de E.coli 
obtidas a partir do alinhamento das sequências deste estudo 131
Anexo 7. Alinhamento múltiplo entre as sequências parciais do geneSsu-rRNA de Entamoeba obtidas neste estudo 136
Anexo 8. SANTOS, H.L.; BANDEA, R.; MARTINS, L.A. et al. 
Differential identification of Entamoeba spp. based on the 
analysis of 18S rRNA. Parasitol Res 106(4): 883-8, 2010 157
Anexo 9. OLIVEIRA, L.M.; SANTOS, H.L.C.; GONÇALVES, M.M.L.; 
BARRETO, G.M.; PERALTA, J. M. 2010. Evaluation of PCR 
as an alternative tool for the diagnosis of low-intensity 
Schistosoma mansoni infection. Diagn Microbiol and Infect 
Disease, 2010 164
 1
1. INTRODUÇÃO 
O gênero Entamoeba é composto por protozoários que se locomovem 
e incorporam os alimentos através da emissão de pseudópodes. Este gênero 
encontra-se largamente distribuído nos hospedeiros vertebrados e pertence ao filo 
Sarcomastigophora, família Endamoebidae e classe Lobosea (LEVINE et al., 
1980). Possui um ciclo de vida simples que consiste de um estágio cístico 
infectante e um estágio de trofozoíto responsável pela perpetuação do parasito. 
Cada espécie do gênero Entamoeba tende a produzir a forma cística que, quando 
madura, contém um número definido de núcleos. Baseado nesta característica, o 
gênero foi dividido em quatro grupos distintos: amebas com núcleo único, com 
quatro núcleos, com oito núcleos e ameba com forma cística desconhecida (REY, 
2008). 
Várias espécies de amebas que constituem o gênero Entamoeba 
podem naturalmente habitar o trato intestinal humano, tais como: Entamoeba coli, 
Entamoeba hartmanni, Entamoeba histolytica, Entamoeba histolytica, Entamoeba 
polecki e Entamoeba moshkovskii que é considerada como uma ameba de vida 
livre, amplamente encontrada em diferentes coleções hídricas. Nota-se ainda, que 
E. moshkovskii tem sido encontrada parasitando o intestino humano (ALI et al., 
2003; PARIJA & KHAIRNAR, 2005; FOTEDAR et al., 2007). Por sua vez, E. 
polecki é uma espécie encontrada no intestino de porco e macaco, fortuitamente 
pode parasitar o intestino humano (DESOWITZ & BARNISH, 1986). As espécies 
E. dispar, E. moshkovskii, e E. histolytica são morfologicamente semelhantes na 
microscopia óptica, mas podem ser diferenciadas uma das outras por meio de 
análise do perfil de isoenzimas, por anticorpos monoclonais, pelo polimorfismo do 
tamanho dos fragmentos de restrição e através da técnica da reação em cadeia 
da polimerase (PCR – Polymerase Chain Reaction). As formas evolutivas de E. 
hartmanni apresentam dimensões menores o que possibilita a sua diferenciação 
 2
através da análise morfométrica de cistos e trofozoíto. Cistos imaturos de E. coli 
apresentam caracterírticas morfológicas bastante semelhante aos cistos maduro 
tetranucleados (HECKENDORN et al., 2002). 
Sabe-se que Endolimax nana e Iodamoeba butschlii são amebas que 
não pertencem ao gênero Entamoeba. Estas espécies colonizam o intestino 
humano, vivendo na condição de organismos comensais, aos quais não se 
atribuíu, até o momento, ação patogênica. Em 1918, a espécie Dientamoeba 
fragilis foi originalmente descrita como uma espécie de ameba. Recentemente, 
algumas evidências sugerem que este parasito é um flagelado que pertence 
ordem Trichomonadida e ao gênero Dientamoeba (STARK et al., 2006). 
Tradicionalmente, o diagnóstico das amebas intestinais inclui métodos 
parasitológicos que identificam o parasito através da microscopia óptica. Embora, 
largamente utilizado, a diferenciação entre as espécies de amebas pelas análises 
morfológicas, de modo geral, não é uma tarefa fácil. Visto que um dos principais 
critérios de identificação baseia-se no número de núcleos presente no cisto 
maduro, na disposição da cromatina distribuída em torno da membrana nuclear, 
na localização e tamanho do cariossoma, no formato do corpo cromatóide quando 
presente nos cistos e nas dimensões de ambas formas evolutivas. A seguir, os 
quadros mostram um resumo das características morfológicas de trofozoítos e 
cistos utilizados na diferenciação entre espécies de amebas que parasitam o 
intestino humano. 
 
 3
QUADRO 1. Características utilizadas na diferenciaç ão de trofozoítos de amebas 
encontrados no intestino grosso humano 
Espécies e 
Diâmetros 
Núcleo Citoplasma 
*Cromatina 
Periférica 
*Cariossoma Aspecto Inclusões 
E. histolytica, 
E dispar e 
E. moskovskii 
10 – 60 µm 
Grânulos 
Delicados com distri-
buição uniforme 
Pequeno e central, 
às vezes 
excêntrico 
Granuloso 
Hemácias e 
pode conter 
bactérias 
E. hartmanni 
5 – 12 µm 
Similar a 
E. histolytica 
Pequeno e central, 
às vezes excêntrico Granuloso Bactérias 
E. coli 
10 – 50 µm 
Grânulos grosseiros 
com distribuição 
irregular 
Discreto, grande 
e excêntrico 
Granuloso e 
vacuolizado 
Bactérias e 
fungos 
E. polecki 
10 – 25 µm 
Grânulos finos com 
distribuição uniforme, 
às vezes com aspecto 
de placas ou crescente 
Pequeno, 
excêntrico e 
às vezes grande 
difuso ou irregular 
Grosseiro, 
granuloso e 
similar a E. coli 
e com vários 
vacúolos 
Bactérias 
e fungos 
E. nana 
5 – 10 um Ausente 
Grande e 
irregular 
Granuloso e 
vacuolizado Bactérias 
I. butschlii 
5 – 20 um 
Ausente Grande e 
usualmente central 
Granuloso e 
vacuolizado 
Bactérias e 
fungos 
*Colorações tricrômica ou hematoxilina férrica. 
**Adaptado de FOTEDAR e cols. (2007) e GARCIA (2007). 
 
QUADRO 2. Características utilizadas na diferenciaç ão de cistos maturos de amebas 
encontrados no intestino grosso do humano 
Espécies 
e Diâmetros 
Núcleo Citoplasma 
Número 
Cromatina 
periférica 
Cariossoma *Corpos cromatóides 
*Vacúolo de 
glicogênio 
E. histolytica, 
E. dispar e 
E .moshkovvskii 
10 – 20 µm 
4 núcleos; 
1 e 2 
(cisto imaturo) 
Delicada com 
distribuição 
regular 
Pequeno 
e 
central 
Bastonetes 
com extremidade 
arredondadas 
Difuso ou 
ausente em 
cistos maturo 
E. hartmanni 
5 – 10µm 
4 núcleos; 
1 e 2 
(cisto imaturo) 
Similar a 
E. histolytica 
Similar a 
E. histolytica 
Similar a 
E histolytica 
Similar a 
E. histolytica 
E. coli 
10 – 35 µm 
8 núcleos; 
2 ou + 
(cisto imaturo) 
Grosseira com 
distribuição 
Irregular 
Grande excên- 
trico, às vezes 
central 
Aspecto de 
lasca 
ou irregular 
Difuso; bem 
definido em 
cisto imaturo 
E. polecki 
9 –18 µm 
1 núcleo 
raramente 
2 núcleos 
Delicada com 
distribuição 
regular 
Pequeno e 
excêntrico 
Extremidade 
angular ou pon-
tiaguda 
Pequeno e 
difuso 
E. nana 
5 – 10 µm 4 núcleos Ausente 
Grande e 
usualmente 
irregular 
Massa 
pequena 
oval 
Difuso 
I. butschlii 
5 – 20 µm 
1 núcleo Ausente 
Largo 
usualmente 
excêntrico 
Similar a 
Entamoeba 
Compacto 
e bem 
definido 
*Colorações tricrômica e hematoxilina férrica. 
** Adaptado de FOTEDAR e cols. (2007) e GARCIA (2007). 
 4
Vale ressaltar que a presença de características sobrepostas nas 
diferentes amebas dificulta a identificação do parasito, sendo necessária a análise 
de várias formas evolutivas e de estruturas internas bem preservadas (LEBER & 
NOVAK, 2005), o que nem sempre é possível observar em amostras de fezes má 
acondicionadas, colhidas sem conservantes e observadas sem métodos de 
coloração. Nota-se ainda que, a sutileza da morfologia, a percepção microscópica 
aliada ao conhecimento, a experiência profissional, a qualidade óptica e o nível de 
parasitemia na amostra fecal são fatores que afetam os resultados e que nem 
sempre constituem um processo inteiramente fidedigno. 
Existe um consenso geral e conceitual, entre os pesquisadores, de que 
a amebíase é uma parasitose humana causada pelo protozoário E. histolytica. Em 
1997, a Organização Mundial de Saúde anuiu que E. histolytica e E. dispar eram 
duas espécies morfologicamente idênticas à microscopia óptica, formando o 
complexo E. histolytica/E. dispar, sendo a primeira patogênica e invasiva no 
organismo humano e a segunda se limitando ao lúmen do intestino (WHO, 1997). 
Mas, recentemente, vários pesquisadores têm mencionado a inclusão de E. 
moshkovskii como parte deste complexo, em decorrência dos casos de infecções 
parasitáriasconcomitantes destas espécies e da elevada frequência de E. 
moshkovskii em algumas populações estudadas na região de Dhaka na Índia, 
Sidney na Austrália, Bangkok na Tailândia e Tanzânia na África (ALI et al., 2003; 
PARIJA & KHAIRNAR, 2005; HAMZAH et al., 2006; FOTEDAR et al., 2007; BECK 
et al., 2008). Este achado sugere que esta espécie não é simplesmente uma 
espécie de vida livre, mas um parasito próprio da espécie humana. Estes estudos 
utilizaram a PCR na diferenciação e detecção de rDNA destas espécies. 
Entre as espécies de amebas entéricas, somente E. histolytica é 
reconhecidamente capaz de invadir o organismo humano e causar doença em 
determinadas condições (TANYUKSEL & PETRI, 2003). As demais espécies são 
consideradas como comensais e não invasivas. Porém, a identificação destas 
 5
espécies é uma condição essencial pela possibilidade de serem confundidas com 
E. histolytica. Ademais, o conhecimento epidemiológico das amebas é de suma 
importância, já que os dados epidemiológicos contribuem de forma consistente 
nas questões e resoluções relacionadas a problemas de saúde pública. Assim 
sendo, é necessário realizar o diagnóstico diferencial entre as espécies de 
amebas que habitam o intestino humano, a fim de orientar a conduta terapêutica, 
evitar o tratamento empírico e obter dados epidemiológicos. Os sintomas da 
amebíase, de uma maneira geral, são variados. Em torno de 90%, as infecções 
são assintomáticas, constituindo o hospedeiro um vasto reservatório do parasito. 
Neste caso, E. histolytica na luz intestinal se comporta como um simples 
comensal, não existindo nenhuma evidência de infecção, a não ser a eliminação 
de cistos nas fezes. Estes indivíduos, a qualquer momento da sua vida, podem 
desenvolver as formas clínicas da doença que variam de colite não disentérica, 
disenteria amebiana e amebíase extraintestinal (TANYUKSEL & PETRI, 2003). A 
colite não disentérica apresenta sintomas vagos, que muitas vezes passam 
despercebidos. Manifesta-se por evacuações diarreicas, podendo conter sangue 
ou muco, embora alguns pacientes nem apresentem diarreia. Cólicas e 
desconforto abdominal podem surgir e, raramente, observa-se febre. Esta 
infecção é caracterizada por períodos silenciosos alternados por manifestações 
clínicas (HAQUE et al., 2003; TANYUKSEL & PETRI, 2003). Já na disenteria 
amebiana, o quadro clínico geralmente se instala de forma insidiosa, com dor 
abdominal, flatulência, diarreia com evacuações muco sanguinolentas e febre 
moderada. Pode ocorrer de oito a dez evacuações diárias. As complicações da 
amebíase intestinal resultam da confluência das úlceras e necrose do cólon e são 
muito variáveis, podendo atingir cerca de 4% dos casos. As mais comuns são: 
perfurações intestinais com peritonite, hemorragia, colites pós-disentéricas e 
estenoses. O ameboma é encontrado no ceco, geralmente como uma lesão 
única, formada por massas granulomatosas que podem ser confundidas com 
 6
neoplasia (HAQUE et al., 2003). Na amebíase extraintestinal a manifestação 
clínica mais comumente encontrada é a necrose liquefativa do fígado (abscesso 
hepático). O lobo direito do fígado é frequentemente mais afetado do que o 
esquerdo. O parasito provoca um processo inflamatório difuso, degeneração 
celular e necrose liquefativa do parênquima, em consequência da ação 
enzimática dos trofozoítos. O indivíduo apresenta dor no hipocôndrio direito, febre 
intermitente e irregular, hepatomegalia e fraqueza geral. Se houver infecção 
bacteriana concomitante ocorre o agravamento do quadro clínico (TANYUKSEL & 
PETRI, 2003). De 2% a 20% dos indivíduos sintomáticos evoluem para doença 
grave, como: formação de abscesso hepático, perfuração intestinal, peritonite, 
ameboma, podendo ainda com menor frequência, desenvolver lesões em outros 
órgãos como pulmão, cérebro e região cutânea (AQUINO, 2001; RIGOTHIER et 
al., 2002; STANLEY, 2003). 
De acordo com as normas estabelecidas pela OMS, o tratamento da 
amebíase deverá ser adotado somente nos casos que E. histolytica for 
especificamente confirmada devido à possibilidade de se desenvolver resistência 
ao Metronidazol (CLARK, 1998; WASSMANN et al., 1999). O tratamento com este 
fármaco permanece efetivo no combate à doença, mas as taxas de reinfecção 
são altas (CARRERO et al., 2007). Há relatos de pacientes que não respondem 
ao tratamento, o que pode ser devido a uma resistência dos trofozoítos expostos 
a múltiplas drogas ou ao aparecimento de uma cepa resistente (ABD-ALLA et al., 
2006). Segundo CLARK (1998), para se diferenciar as amebas intestinais e 
reduzir o uso desnecessário de agentes antiparasitários, são necessários testes 
diagnósticos precisos. 
A amebíase é amplamente distribuída no mundo. Cerca de 10% da 
população mundial encontra-se infectada por E. histolytica, sendo que 90% dos 
indivíduos parasitados não apresentam sintomatologia clínica (STANLEY, 2003). 
Estima-se que 50 milhões de pessoas desenvolvem amebíase intestinal, e que 
 7
10% dos indivíduos com colite amebiana desenvolverão abscesso hepático 
(RIGOTHIER et al., 2002). Em uma escala global, as formas graves da amebíase 
determinam cerca de 40 a 110 mil mortes por ano. No entender de Ximenez e 
cols. (2009), a estimativa da taxa de infecção por E histolytica no mundo pode não 
refletir a situação real, visto que, estes dados foram obtidos através da análise 
morfológica e/ou sorologia como descrito por Walsh (1986). Segundo Pritt & Clark 
(2008) os dados epidemiológicos relatados sobre a amebíase, ao longo dos 
últimos anos, foram ambíguos porque foram baseados principalmente na análise 
morfológica. 
A presença de E. histolytica nos países desenvolvidos está confinada a 
agregados populacionais, sendo que os principais grupos acometidos são os 
viajantes de áreas endêmicas, imigrantes, homossexuais masculinos e indivíduos 
internados em instituições coletivas (asilos, orfanatos e manicômio) (TANYUKSEL 
& PETRI, 2003). O contato direto entre o indivíduo infectado por E. histolytica e o 
indivíduo sadio certamente constitui a mais importante fonte de infecção em 
gregados populacionais com elevado grau de promiscuidade e baixo nível 
higiênico. Segundo Evangeloupos e cols. (2000), a detecção e diferenciação entre 
E. histolytica e E. dispar é de grande importância, tanto para o diagnóstico, quanto 
para os estudos epidemiológicos. Inúmeros estudos têm sido realizados depois do 
reconhecimento de E. dispar como uma nova espécie de Entamoeba 
morfologicamente semelhante a E. histolytica, visando à distinção entre as 
espécies e o melhor entendimento da incidência e prevalência da doença. 
Na Grécia, Evangelopoulos, Legakis & Vakalis (2001) realizaram um 
estudo epidemiológico para estimar a prevalência de E. histolytica e E. dispar, 
através da análise por técnicas de microscopia e de ELISA para detecção de 
antígenos e PCR. Os resultados mostraram uma baixa prevalência destes 
parasitos na Grécia. A PCR foi o método de escolha para o diagnóstico da 
amebíase quando comparado com o teste de ELISA. Posteriormente, Antoniou e 
 8
cols. (2002) realizaram um estudo epidemiológico utilizando métodos sorológicos, 
observando uma soroprevalência de 2,5% na Grécia. 
O Japão é um dos poucos países desenvolvidos onde os casos de E. 
histolytica são autóctones. Entretanto, no Japão, a amebíase é prevalente 
somente em populações restritas: homossexuais masculinos e residentes de 
instituições mentais (HAGHIGHI et al., 2002). 
Tanyuksel & Petri (2003), relataram que nos países desenvolvidos 
como a Itália, Japão e Estados Unidos, a prevalência de E. histolytica na 
população de homossexuais masculino está entre 4 a 21%, mas a maioria das 
infecções é causada por E. dispar, a qual não requer tratamento. 
Em relação a prevalência da amebíase, algumas regiões da África, 
Ásia, América Central e do Sul se destacam no cenário mundial, devido aos 
baixos níveis sócio-econômicose higiênico-sanitários da população (TANYUKSEL 
& PETRI, 2003). 
O México é um dos países do mundo que mais sofre com a 
enfermidade amebiana, onde 15% dos casos de disenteria aguda em crianças, 
que requerem hospitalização, estão associados a infecção por E. histolytica 
(GUTIERREZ, 1986). Palacio-Sanchez e cols. (1997) realizaram um estudo 
epidemiológico na cidade de Chihuahua, no México e observaram uma frequência 
de 16% quando utilizaram a pesquisa de antígenos de E. histolytica nas fezes. 
Na cidade de Bangladesh, Haque e cols. (1997), realizaram um estudo 
com 1049 crianças com diarreia e 987 crianças assintomáticas, observando que a 
prevalência de E. histolytica e de E. dispar era quase a mesma nas crianças com 
diarreia. Entretanto, nas crianças assintomáticas da área rural, a infecção por E. 
dispar foi sete vezes mais comum. 
Em 2003, Verweij e cols. encontraram alta prevalência do complexo E. 
histolytica/E. dispar pelo EPF em amostras fecais oriundas de uma área rural de 
Ghana, porém quando utilizaram a “PCR em tempo real”, identificaram somente 
 9
um caso de E. histolytica e uma alta frequência de E. dispar (VERWEIJ et al, 2003 
b). Posteriormente, Kebede e cols. (2004), observaram diferentes percentuais de 
prevalência na Etiópia quando compararam seus resultados obtidos pela técnica 
de PCR com o do exame parasitológico de fezes. 
No Brasil, o número de indivíduos infectados por E. histolytica oscila de 
região para região, apresentando percentuais extremamente variáveis. Observa-
se alta prevalência na região norte e baixa prevalência na região nordeste, 
sudeste e sul. Na região amazônica, os casos de amebíase intestinal e 
extraintestinal são mais frequentes e graves do que nas demais regiões (GOMES 
et al., 2000b). Contudo, ainda não existe uma real estimativa da prevalência da 
amebíase no território Brasileiro. A presença do Complexo E. histolytica/E. dispar 
tem sido relatada em vários estados como Pará (SILVA et al., 2005), Rondônia 
(ORLANDI et al., 2001), Pará (MIRANDA et al., 1998), São Paulo (LUDWIG et al., 
1999; MARTINS et al., 2007), Bahia (SANTOS, SANTOS & SOARES, 2007), Rio 
Grande do Sul (ASSIS et al., 2003); Santa Catarina (ANDRADE et al., 2008) 
Minas Gerais (ROCHA et al., 2000) Piauí (ALVES et al., 2003); Ceará (BRAGA et 
al., 1998; 2001) e Rio de Janeiro (SANTOS et al., 2007). 
Um estudo realizado em Manaus por Menezes (1986), identificou 
vários casos de amebíase hepática e demonstrou a predominância de casos 
sintomáticos (65,2%) sobre os assintomáticos. Porém, as formas de colite não 
disentérica foram as mais comuns entre os indivíduos sintomáticos. Em 2000, 
Póvoa e cols. relataram que 29% das amostras analisadas de indivíduos 
moradores da região metropolitana de Belém, Pará, foram positivas para E. 
histolytica quando utilizaram a detecção de antígeno nas fezes. Posteriormente, 
Silva e cols. (2005) encontraram uma prevalência de 29,35% de indivíduos 
infectados por E. histolytica na grande Bélem/Pará, quando empregaram o 
conjunto de diagnóstico Entamoeba histolytica test II da TechLab. 
 10
Por sua vez, Benetton e cols. (2005) encontraram na cidade de 
Manaus uma prevalência de 21,5% de indivíduos infectados por E. histolytica/E. 
dispar e destes apenas 1,5% foram positivos por E. histolytica. 
Em 2001, Braga e cols. realizaram um estudo em uma favela no 
Estado de Ceará/Fortaleza, Nordeste do Brasil, através de EPF e detecção de 
antígenos nas fezes (ELISA). Observaram que 25% das amostras eram positivas 
para o complexo E. histolytica/E. dispar. Neste estudo a prevalência de E. 
histolytica foi de 15% quando empregaram a pesquisa de antígeno nas fezes. 
Na cidade de Recife, em Pernanbuco, Pinheiro e cols. (2004), 
realizaram um estudo sobre a prevalência de E. histolytica, observando somente 
a presença de E. dispar quando utilizaram a PCR e a pesquisa de antígeno nas 
fezes. 
Santos e cols. (2007), utilizaram a técnica de Multiplex-PCR para 
diferenciar o complexo E. histolytica/E. dispar descrita previamente por Nunez e 
cols. (2001). O teste foi empregado para avaliar a ocorrência e o perfil da 
amebíase em duas comunidades do Estado do Rio de Janeiro. Os resultados 
mostraram uma discrepância entre o EPF e a Multiplex-PCR, que pode estar 
relacionada com diferenças de sensibilidade e especificidade dos métodos. Um 
número significativo de amostras fecais que apresentavam o complexo E. 
histolytica/E. dispar pelo EPF, foi negativo para as duas espécies na PCR. Assim, 
os autores sugeriram que esta discrepância poderia estar refletindo a presença de 
outras amebas comensais que não fazem parte do complexo E. histolytica/E. 
dispar. 
Vale ressaltar que é bem provável que a verdadeira prevalência e 
incidência de E. histolytica seja hiperestimada, devido à presença de outras 
espécies morfologicamente semelhantes em nosso meio, associada às 
dificuldades encontradas na diferenciação destas espécies e à falta de dados 
epidemiológicos contundentes. 
 11
Sabe-se que as prevalências de amebas intestinais comensais em 
nosso meio são escassas, principalmente em relação as espécies, E hartmanii e 
E. moshkovskii. Infelizmente, os estudos sobre prevalência, em sua maioria, 
utilizaram diferentes métodos de diagnóstico, bem como diferentes peculiaridades 
locais e características das populações selecionadas, o que dificulta uma análise 
comparativa destes dados relativos à frequência de amebas. 
O diagnóstico clínico é raramente uma circunstância com margem de 
segurança satisfatória nas parasitoses, como sucede na maioria das doenças. Os 
indivíduos com amebíase apresentam sintomas não específicos que podem ser 
confundidos com os de outras doenças, tais como: criptosporidiose, salmonelose, 
shigelose, rotavirose, adenovirose, doença inflamatória intestinal, carcinoma, 
colite isquêmica, diverticulite, fazendo com que o diagnóstico laboratorial seja 
uma ferramenta vital para confirmar ou descartar a suspeita da infecção por E. 
histolytica (TANYUKSEL & PETRI, 2003; PRITT & CLARK, 2008). Para tal fim, é 
indispensável um método preciso, sensível, específico para a determinação do 
diagnóstico etiológico com adoção de medidas preventivas e de controle da 
doença. 
O diagnóstico laboratorial da amebíase atualmente pode ser feito 
através de uma variedade de técnicas, utilizadas individualmente ou em conjunto, 
como o exame parasitológico de fezes (EPF) e métodos moleculares como a 
pesquisa de antígenos e de DNA nas fezes (HAQUE et al., 2003; STANLEY, 
2003). 
O exame parasitológico de fezes é baseado em critérios morfológicos 
das formas evolutivas do parasito presente nas fezes. Nas fezes diarreicas 
predominam os trofozoítos, sendo recomendada a realização do método direto 
em fezes recém emitidas. Já nas fezes pastosas encontramos as formas císticas, 
sendo empregados métodos de concentração. Estes métodos são baseados em 
dois princípios: a flutuação dos parasitos em solução de alta densidade por 
 12
centrifugação, como a solução de sulfato de zinco e a sedimentação espontânea 
ou por centrifugação. 
Os métodos coproscópicos têm sido largamente utilizados na detecção 
de amebas intestinais. Todavia, estes métodos não são capazes de diferenciar o 
complexo E. histolytica/E. dispar, nem as outras espécies de amebas 
morfologicamente semelhantes. Assim, a análise morfológica não é 
suficientemente informativa para o diagnóstico preciso das espécies, exceto 
quando se evidencia a presença de eritrócitos fagocitados no interior do 
trofozoítos, característica esta restrita a E. histolytica (PETRI & SINGH,1999; 
STANLEY, 2003). Este achado é extremamente raro em amostras de fezes 
diarreicas recém emitidas. Ademais, as formas císticas são eliminadas nas fezes 
intermitentemente, podendo o seu número variar de dia para dia. Assim, o exame 
parasitológico de fezes realizado em fezes coletadas em dias alternados, dentro 
deum período de 10 dias, como geralmente recomendado, aumenta a 
sensibilidade do EPF. 
É indispensável que o microscopista seja capaz de distinguir as formas 
evolutivas de artefatos presente nas fezes, tais como: células epiteliais, 
leucócitos, macrófagos, leveduras. Ainda assim, vale ressaltar, que os métodos 
de concentração empregados na análise de cistos apresentam uma variação 
substancial em relação à sensibilidade quando comparados entre si. Já está bem 
estabelecido que o método de flutuação por centrifugação, utilizando sulfato de 
zinco a 33% com uma densidade 1,18 (FAUST et al., 1938) é o mais indicado 
para o diagnóstico de ameba intestinais (TOBIE et al., 1951; BARRETO, 1962; 
REY, 2008). Em geral, na rotina laboratorial para a visualização e identificação 
direta de trofozoítos utiliza-se o corante temporário lugol, da mesma forma que 
em amostras previamente concentradas. Entretanto, na maioria das vezes, é 
necessário utilizar as técnicas de colorações permanentes, tais como: tricrômica 
 13
ou hematoxilina férrica, pois permite uma melhor visualização das características 
morfológicas mencionadas nos quadros 1 e 2. 
A caracterização de padrões isoenzimáticos é um método bioquímico 
pioneiro para diferenciar E. histolytica de E. dispar e outras espécies de amebas. 
Este método é considerado “padrão ouro”, cujo princípio reside na mobilidade 
eletroforética das isoenzimas da via glicolítica (hexoquinase, fosfoglicomutase, 
malato desidrogenase e fosfoisomerase) de trofozoítos de cultura destas amebas 
(SARGEAUNT et al.,1978; ORTNER, et al.,1997). Estas isoenzimas foram 
agrupadas em padrões eletroforéticos (zimodemas) capazes de diferenciar as 
espécies. O comportamento eletroforético da isoenzima hexoquinase é 
considerado marcador de patogenicidade (BLANC & SARGEAUNT, 1991; 
ACKERS, 2002). No entanto, a eficácia deste método apresenta certas restrições, 
como a necessidade de uma cultura prévia, por um período de 7 a 14 dias, que 
não positivam em aproximadamente 30% das amostras de fezes positivas para 
cistos (ACKERS, 2002), tornando o método inviável para a rotina laboratorial. 
Sendo assim, os cultivos de amebas são de valor para estudos bioquímicos e 
imunológicos, produção de antígenos e anticorpos, estudos diferenciais entre 
cepas patogênicas e não-patogênicas (zimodemos), triagem de novos 
medicamentos in vitro, infecção de animais de laboratório como modelo 
experimental em estudos de patogenia e para conhecimento da organização do 
parasito em nível ultraestrutural (VISVESVARA & GARCIA, 2002). 
A cultura é considerada um método de detecção menos sensível do 
que a detecção de antígenos nas fezes e a detecção de anticorpos no soro. 
Sabemos que o índice de positividade da cultura varia de acordo com a forma 
clínica da doença. Em amostras de indivíduos assintomáticos, a cultura mostrou-
se menos sensível do que a detecção de antígenos nas fezes (ABD-ALLA et al., 
2000). Por sua vez, Sheehan e cols. (1979), relataram que a detecção de 
anticorpos anti-E. histolytica no soro de indivíduos com evidências clínicas de 
 14
amebíase mostrou-se mais sensível que os resultados obtidos pela cultura. Parija 
& Rao (1995) recomendaram o uso da cultura no diagnóstico da amebíase, após 
ter realizado um estudo de comparação entre a cultura de E. histolytica com o 
método direto e de concentração utilizando formol–éter. 
Segundo Evangelopoulos e cols. (2000), em amostras com infecção 
mista por amebas, não podemos excluir que uma espécie possa suprimir o 
crescimento da outra. Ademais, em regiões que apresentam uma alta prevalência 
de Blastocystis hominis é frequentemente encontrado uma associação com E. 
histolytica e E. dispar no cultivo poliaxênico. O crescimento exacerbado B. 
hominis no meio, se sobrepõe muitas vezes o da ameba, impedindo a 
manutenção destas em cultura (GONÇALVES et al., 2007). 
O diagnóstico definitivo de um processo infeccioso é a demonstração 
do patógeno nos tecidos ou fluídos biológicos do hospedeiro. Porém, nem sempre 
possível, devido à ausência do agente infeccioso, pela falta de sensibilidade dos 
métodos utilizados ou por falhas técnicas (FERREIRA & ÁVILA, 2001). 
O diagnóstico imunológico tem sido utilizado para a pesquisa de 
antígeno e de anticorpo. Em áreas endêmicas, um dos maiores problemas 
encontrados nos métodos imunológicos que detectam anticorpo é a incapacidade 
de distinguir entre os indivíduos portadores de infecção recente ou passada, uma 
vez que os títulos de anticorpos permanecem elevados por vários meses após a 
cura da infecção. Entretanto, a detecção de anticorpo anti-E. histolytica tem valor 
diagnóstico nos casos da amebíase extraintestinal, como no abscesso hepático, 
onde altos títulos de anticorpos podem ser observados (SANCHEZ-GUILLÉN et 
al., 2002). 
 Os testes sorológicos detectam anticorpos específicos para E. 
histolytica em aproximadamente 95% dos pacientes com amebíase 
extraintestinal, 70% dos pacientes com amebíase intestinal invasiva e em 5% dos 
portadores assintomáticos (PETRI & SINGH, 1999; AQUINO, 2001). 
 15
Kraoul e cols. (1997) realizaram um estudo comparativo entre testes 
sorológicos para a detecção de anticorpos anti-E. histolytica. Nesse estudo 
utilizaram 143 amostras de soro, oriundas de indivíduos com quadro de abscesso 
hepático amebiano, de indivíduos com outras doenças hepáticas e de indivíduos 
saudáveis. Os autores mencionaram que a hemoaglutinação indireta possui uma 
sensibilidade de 97,6% e uma especificidade de 97%, enquanto que o teste de 
ELISA possui uma sensibilidade de 93% e uma especificidade de 100%. 
Os anticorpos monoclonais (MAbs) vêm sendo empregados, ao longo 
dos anos, com sucesso no laboratório clínico, através da identificação de 
estruturas de diferentes moléculas de superfície celular e de organismos 
patogênicos. Representa uma ferramenta, que apresenta especificidade para um 
único determinante antigênico. Porém, reações cruzadas podem ser observadas, 
uma vez que os micro-organismos apresentam epítopos homólogos em sua 
estrutura antigênica. A aplicação de MAbs no imunodiagnóstico da amebíase vem 
sendo utilizada na pesquisa de antígenos nas fezes. O conjunto de diagnóstico, E. 
histolytica test (TechLab Inc., Blacksburgh, VA) é um teste de ELISA tipo captura, 
amplamente utilizado. Este teste utiliza MAbs que reconhecem epítopos 
altamente conservados presentes na proteína de adesão GAL/GALNac 
encontrada na superfície de trofozoítos de E. histolytica. Segundo o fabricante é 
possível detectar no mínimo 1000 trofozoítos em cada amostra analisada 
(TELLEZ-SIERRA et al., 1992; GARCIA, SHIMIZU & BERNARD, 2000). A 
primeira geração deste teste, o “Entamoeba Test’’, detectava lectina de aderência 
GAL/GALNac de E. histolytica e E. dispar. Já o conjunto de diagnóstico Merlin 
Optimun Kit (Merlin Diagnostika Bornheim-Hersel, Alemanha) utiliza Mabs que 
reconhecem o antígeno de superfície rico em serina. Este teste requer pelo 
menos 100 trofozoítos de E. histolytica na amostra analisada. Contudo, apresenta 
reação cruzada na presença de alta concentração de antígenos de E. dispar 
(MIRELMAN, NUCHAMOWITZ & STOLARSKY, 1997). Outros conjuntos de 
 16
diagnóstico, Alexon (ProspectT test, Alexon-Trend Ransey MN) e ENZYMEBA 
Test utilizam anticorpos policlonais que reconhecem epítopos antigênicos de 
E.histolytica e E. dispar (LUACES et al., 1993; MIRELMAN, NUCHAMOWITZ & 
STOLARSKY, 1997; PILLAI et al., 1999). 
Sabemos que quando os métodos tradicionais não são suficientes ou 
definitivos para estabelecer o diagnóstico, os métodos moleculares são utilizados 
como um método suplementar por serem eficientes e sensíveis. 
Faz pouco mais de duas décadas que as técnicas de biologia 
molecular têm sido utilizadas na área de diagnóstico de doenças parasitárias. 
Presumivelmente, ainda na era pré-PCR, o uso de sondas específicas de DNA, 
utilizada na detecção de E.histolytica pela técnica de “Dot blot” foi uma das 
primeiras aplicações no diagnóstico molecular. Garfinkel e cols. (1989) 
descreveram as sondas P145 e B133, obtidos a partir de fragmentos de DNA 
digerido com enzimas de restrição. Estas sondas hibridizavam com DNA de cepas 
de E. histolytica isoladas de pacientes sintomáticos e assintomáticos, sendo 
consideradas como uma ferramenta em potencial para o diagnóstico. No mesmo 
período, o grupo de pesquisa de Samuelson e cols. (1989), identificaram a 
mesma sequência descrita por Garfinkel e a utilizou como sonda, que hibridizava 
com DNA de E. histolytica, extraído de cistos concentrados diretamente do 
material fecal. Posteriormente, estas sequências foram utilizadas por Bacha e 
cols. (1990), num ensaio de hibridação realizado com DNA não amplificado 
isolado diretamente de trofozoítos de cultura, oriundos de material fecal. Os 
autores concluíram que o ensaio não apresentou sensibilidade suficiente para a 
visualização de DNA em amostras clínicas com quantidades diminutas de 
parasito. 
Pouco tempo depois, surgiram os primeiros trabalhos utilizando a PCR 
no diagnóstico de E. histolytica. Em 1991, Tachibana e cols. diferenciaram E 
histolytica de isolados de indivíduos assintomático e sintomático através da PCR. 
 17
Os pares de iniciadores P1, P2, P3 e P4 utilizados codificavam parte do gene de 
uma proteína de 30 kDa e o produto amplificado foi visualizado em gel de 
agarose. Também, no ano seguinte, Clark e Diamond (1992), utilizaram a técnica 
de perfil dos fragmentos obtidos por endonucleases de restrição (RFLP) para 
diferenciar produtos amplificados do gene da SSU-rRNA em isolados 
provenientes de pacientes sintomáticos e assintomáticos. Posteriormente, estes 
autores utilizaram a PCR, tendo como alvo o gene SSU-rRNA para o diagnóstico 
diferencial entre E. histolytica e outros protozoários intestinais. No entanto, além 
dos iniciadores PsP5/PsP3 específicos para E. histolytica e o NPsp5/NpSP3 para 
E. dispar utilizaram oligonucleotídeos iniciadores universais, RD5/RD3. O produto 
amplificado utilizando os iniciadores universais foi incubado com enzimas de 
restrição, mostrando fragmentos de restrição distintos para E. nana, E coli, E. 
histolytica, E. hartmanni, E. moshkovskii e Blastocystis hominis (CLARK & 
DIAMOND, 1992). No mesmo ano, Romero e cols. (1992) utilizaram iniciadores 
que amplificava as sequências P145 e B 133 descritas por Garfinkel e cols. 
(1989), sendo os produtos amplificados detectados através da técnica de “Dot 
Blot”, utilizando as sondas P145 e B133 não radioativas. Neste trabalho, a PCR 
detectou 42 das 45 amostras positivas para E. histolytica, onde 60% das amostras 
eram oriundas de crianças com quadro de disenteria. 
O primeiro estudo epidemiológico utilizando a PCR para o diagnóstico 
diferencial entre E. histolytica e E. dispar foi o de Acuna-Soto et al. (1993). Neste 
trabalho, os autores utilizaram a sequência descrita por Garfinkel e cols. (1989) e 
amostras de fezes fixadas com formalina, oriundas de moradores de uma 
comunidade rural no México. O produto amplificado foi visualizado em gel de 
agarose corado com brometo de etídeo e também pela técnica de “Dot blot”. A 
especificidade e sensibilidade da PCR foi de 96% e 98%, respectivamente. 
Desde então, a PCR convencional tem sido amplamente utilizada na 
detecção e na diferenciação entre E. histolytica e E. dispar ao longo dos últimos 
 18
anos. Várias publicações utilizando diferentes estratégias de amplificação de 
DNA, baseado na PCR convencional, principalmente para o diagnóstico de E. 
histolytica, E. dispar e algumas para E. moskovskii estão sumarizadas no quadro 
3, onde destaca-se os principais alvos e oligonucleotídeos iniciadores publicados 
ultimamente na literatura. 
Entre as sequências gênicas descritas e que têm sido alvo da PCR na 
diferenciação entre E. histolytica e E. dispar, destacam-se o gene SSU-rDNA e a 
sequência repetitiva em tandem, presente em múltiplas cópias no DNA extra-
cromossômica, sendo estimado cerca de 200 cópias no genoma destas espécies 
(BHATTACHARYA et al.,1989). Segundo ACKERS (2002), a utilização de 
sequência alvo de múltiplas cópias propicia um aumento na sensibilidade da PCR. 
Ademais, estudos sobre tipagem gênica no tocante da epidemiológica 
molecular de E. histolytica têm sido extensivamente investigado, sendo menos 
estudado com relação ao E. dispar. Os principais alvos moleculares destes 
estudos são: o gene SREHP que codifica um antígeno de superfície (GHOSH et 
al., 2000; HAGHIGHI et al., 2003; ZAKI et al., 2003; RIVERA et al., 2006), o gene 
da quitinase (GHOSH et al., 2000; HAGHIGHI, et al., 2003), região intergênica 
localizada entre o gene da actina e o da superóxido desmutase (GHOSH et al., 
2000), a região repetitiva no locus 1/2 e 5/6 de microsatélite (ZAKI & CLARK, 
2001; ZAKI et al., 2002; HAGHIGHI, et al., 2003; PINHEIRO et al., 2005) e a 
sequência repetitiva em tandem que flanqueia os genes do tRNA (ALI, ZAKI & 
CLARK, 2005). 
 
 
 19
QUADRO 3. Sequência alvo e oligonucleotídeos inicia dores utilizado na PCR 
convencional descritos na literatura 
Sequência 
Gene alvo 
Tamanho do 
produto 
amplificado 
Iniciadores Referência(s) 
Proteína/ 
30 kDa 
100 bp 
101 bp 
 
 
374 bp 
P11 /P12 (E.h) 
P13 / P14 ( E.d) 
 
 
HF/HR (Eh/Ed) 
Sanuki et al.,1997; Rivera et al., 1998; 
Haghighi et al., 2002; Pinheiro et al., 
2004 e 2005; Tachibana et al., 1992, 
2000 e 2001. 
Hooshyar et al., 2004 
Hemolisina 256 bp Eh6F/Eh6R Zindrou et al., 2001 
Actina 300 bp ActF/Act R Freitas et al.,2004 
Cisteino 
protease 
242 bp Ehcp6F/ Ehcp6R Freitas et al., 2004 
M17 482 pb P1-S17/P1 As20 
Tannich & Burchard, 1991; Gomes et 
al., 1997; 1999; Valle et al., 2000 
SSU-rRNA 
876 bp 
 
 
 
 
880 bp 
 
 
135 bp 
 
900 bp 
 
 
 
600 pb 
 
1950 bp 
 
Nested-PCR 
1076 bp 
427 bp/195 bp 
 
260 pb 
 
166 bp 
752 bp/580pb 
Psp F/PspR (E.h) 
NPspF/NPspR (Ed) 
 
 
Eh5/Eh3 e Ed3/Ed5 
 
Eh1/Ed1e Eh2 
 
Eh1/Eh2 (Ed/Eh) 
EHP1/EHP2 (Eh) 
EHN1/ENH2(Ed) 
 
Enta 1 /Enta2 
Entamoeba sp 
 
RD5/RD3 
Entamoeba sp 
 
E1/E2 (Ed/Eh) 
Eh1-L/Ed-R (Ed/Eh) 
 
Em1/Em2 (Em) 
Em1/nEm (Em) 
 
Enta F 
EhR/EdR/EmR 
 
Clark e Diamond ,1992; Mirelman et al., 
1997; Ramos et al., 2000 ; Verweij et 
al., 2000; Lebbad & Svard, 2005; Moran 
et al., 2005; 
Troll et al.,1997; Heckendorn et al., 
2002; 
Gonin & Trude, 2003; Calderaro et al., 
2006; 
 
Katzwinkel-Wladarch et al., 1994; 
Haque et al., 1998; Zaman et al.,2000 
 
Verweij et al., 2003 a 
 
 
Clark & Diamond, 1992; Ramos et al., 
2005; 
 
Evangeloupos et al., 2000 e 2001; Pa-
glia e Visca, 2004 
 
Ali et al., 2003; Parija e Khairnar 2005; 
Fotedar et al., 2007; Beck et al., 2008 
 
 
Hamzah et al., 2006 
Sequência repetitiva em 
tandem localizada no 
DNA extracromossômicro 
132 bp 
96 bp 
 
145 bp 
133 bp 
145 bp 
133 bp 
EhP1 /EhP2 (E.h) 
EdP1/ EdP2 (E.d) 
P1/ P2 (Eh) 
NP1/ NP2 (Ed) 
 
EHP1 / EHP2 (E.h) 
EHNP1/EHNP2 
 
Nunez et al., 2003; Santos et al., 2007 
 
Acuna-Soto et al., 1993; Aguirre et al., 
1995; Britten et al., 1997; 
 
 
Romero et al., 1992 
E.h = E histolytica; E.d = E. dispar; E.m = E. moshkovskii. 
 
 20
No Brasil, estudos de variabilidade genética de cepas de E. histolytica 
têm sido realizados empregando técnicas do tipo DNA polimórfico amplificado ao 
acaso, RAPD (GOMES et al., 2000 a; VALE et al., 2000), RNA amplificado 
aleatoriamente, RAP-PCR (VALE et al., 2000), PCR em baixa estringência, 
usando um único iniciador (Low Stringency single specific primer, LSSP-PCR) 
(GOMES et al., 1997). Um estudo envolvendo cepa de E. dispar foi realizado por 
Pinheiro e cols. (2005), onde avaliaram regiões polimórficas localizado no locus 
1/2 e 5/6 da região de microsatélite. 
A aplicação da PCR no diagnóstico da amebíase ainda é restrita aos 
laboratórios de pesquisa ou de referência. Atualmente, ainda encontra-se em fase 
de padronização,não havendo até o momento, um marcador molecular 
padronizado, nem método de extração e de purificação de DNA, que tenha sido 
avaliado em diferentes cenários e utilizado unanimemente para o diagnóstico. 
Inicialmente, a PCR apresentou uma alta sensibilidade na detecção e 
diferenciação de E. histolytica e E. dispar, quando foram utilizados DNA extraídos 
de trofozoítos de cultura. No entanto, estes resultados não foram obtidos quando 
o DNA utilizado foi extraído diretamente do material fecal. A amostra fecal é um 
material extremamente heterogêneo e rico em substâncias inibidoras para a PCR. 
Vale ressaltar que para a PCR ser exequível é necessário ter um método de 
extração de DNA simples e rápido, obtendo-se DNA livre de substâncias 
inibidoras da PCR. Assim, a extração de DNA de amostras clínicas desempenha 
um papel fundamental para a obtenção de resultados satisfatórios da PCR. 
Contudo, a extração de DNA das fezes é um processo complexo, em decorrência 
da coextração de substâncias inibidoras e da presença dos resíduos 
contaminantes, tais como: sais biliares, bilirrubina, etanol, complexos de 
polissacarídeos. Essas substâncias interferem na ação da enzima DNA 
polimerase ou aderem no DNA, podendo causar a degradação do mesmo 
(DEUTER et al, 1995; MONTEIRO et al., 1997; WILSON, 1997; VANDENBERG & 
 21
VAN OORSCHOT, 2002). A remoção total das substâncias inibidoras nem 
sempre é fácil. Porém, é possível verificar a presença destes inibidores na 
amostra, introduzindo na reação controles internos de amplificação ou realizando 
a amplificação em duplicata ou triplicata com diferentes diluições do DNA extraído 
(NECHVATAL et al., 2008). Outra estratégia bastante utilizada é contaminar 
(Spiking) a mistura de amplificação com DNA padrão nas amostras que 
apresentaram resultados previamente negativos pela PCR (DA SILVA et al., 1997; 
OMBROUCK et al., 1997; PELT-VERKUIL, BELKUM & HAYS, 2008b). Com estas 
estratégias torna-se possível uma avaliação qualitativa da eficiência da extração. 
Recentemente, alguns protocolos comerciais de extração e purificação de DNA 
conseguiram melhorar as condições de isolamento de DNA fecal, mas nenhum 
método ainda garante o isolamento de DNA livre de substâncias inibidoras. 
Com o advento da PCR em tempo real, resultados melhores foram 
alcançados na detecção e diferenciação de E. histolytica e E. dispar. Esta técnica 
possibilita o monitoramento e a quantificação do fragmento de DNA, utilizando 
como detector do produto amplificado, corantes ou sondas marcadas com 
fluoróforo, específica para uma região interna da sequência alvo. A quantificação 
do fragmento amplificado ocorre à medida que o sinal de fluorescência é emitido 
durante a extensão de cada ciclo, sendo diretamente proporcional à quantidade 
de produto de PCR. Várias estratégias de monitoramento da amplificação pela 
PCR em tempo real têm sido adotadas. O método mais simples é o que utiliza 
corante que se intercala na dupla fita de DNA, o SYBR GREEN 1. Já o sistema 
TaqMan, emprega sonda que hibridiza especificamente com a sequência alvo. 
Durante o processo de polimerização dos nucleotídeos, a sonda é degradada e a 
fluorescência liberada é capturada pelo sistema detector e amplificador de sinal. 
Existem outros métodos que empregam sondas fluorescentes como a farol 
molecular (molecular beacon) e o LightCycler. O farol molecular utiliza uma sonda 
que é um DNA de fita simples que forma uma estrutura secundária entre as 
 22
extremidades 3’ e 5’. Assim, no momento que a sonda encontra o seu alvo, 
durante a etapa de amplificação, a mesma assume uma mudança 
conformacional, tornando-a capaz de emitir fluorescência. Já o sistema 
LightCycler utiliza duas sondas de hibridação que só produzem fluorescência 
quando estão hibridizadas juntas na sequência-alvo. 
Alguns métodos da PCR em tempo real têm sido empregados na 
detecção e diferenciação de E histolytica e E. dispar nos últimos anos. 
Blessemann e cols. (2002) amplificaram um fragmento de 310 bp contido no SSU-
rRNA, utilizando o sistema Light Cycler. A PCR foi capaz de detectar menos de 
0,1 parasito por grama de fezes. No ano seguinte, Verweij et al. (2003b) utilizaram 
o gene SSU-rRNA e a sequência epissômica repetitiva, descrita por Garfinkel et 
al. (1989), em dois ensaios de PCR em tempo real, empregando sondas do tipo 
TaqMan. Neste trabalho foram utilizadas 192 amostras de fezes obtidas de 
indivíduos moradores na região Norte de Gana. Nesta amostragem foi 
evidenciada somente uma amostra positiva para E. histolytica, o que revelou um 
elevado percentual de E. dispar na população estudada. Posteriormente, Roy e 
cols. (2005) empregaram o sistema “molecular beacon” na identificação de E. 
histolytica e E. dispar em secreção hepática e em amostras de fezes. Também, 
em 2005, Qvarnstrom e cols., em seu trabalho singular, compararam três métodos 
de PCR em tempo real, até então publicado na literatura, além de adaptar a PCR 
descrita por Clark e Diamond (1992) para um ensaio do tipo PCR em tempo real, 
utilizando o corante SYBR-GREEN 1. O limite de detecção e a eficiência de cada 
ensaio foi testado utilizando DNA de amostras fecais, amostras artificialmente 
contaminada e de trofozoítos de cultura. Os autores concluíram que o método que 
apresentou uma maior sensibilidade foi o sistema TaqMan, que amplifica o 
segmento gênico do SSU-rDNA, descrito por Verweij et al. (2003 b). 
A PCR em tempo real realiza a detecção e a quantificação do DNA de 
maneira precisa e com maior sensibilidade. Este método tem mostrado ser mais 
 23
sensível na detecção simultânea de E. histolytica e E. dispar em amostras fecais, 
principalmente em indivíduos com infecção mista, quando comparado com a PCR 
convencional (QVARNSTROM et al., 2005), além de ser um método bastante 
propício para o laboratório de diagnóstico pela sua característica de eliminar a 
análise pós-PCR, diminuindo, assim, seu tempo de execução e, também, 
minimizando o risco de contaminação do ambiente do laboratorial com produtos 
amplificados. 
O emprego da PCR em tempo real em ensaios do tipo multiplex para a 
detecção simultânea de E. histolytica, Giardia lamblia e Cryptosporidium parvum 
em amostras fecais foram padronizados por Verweij et al. (2004) e Haque et al. 
(2007). 
Cabe ressaltar que a PCR em tempo real tem sido utilizada como uma 
interface experimental na elaboração de teste do tipo multianalítico, que utiliza 
uma plataforma de instrumentação que pode ser implementada nos laboratórios 
clínicos. Mesmo assim, ainda restam alguns problemas, tendo como a principal 
desvantagem da PCR em tempo real em relação a PCR convencional, a sua 
limitação quanto ao número de fragmentos de DNA a serem detectados. Os 
equipamentos de PCR em tempo real possuem um número limitado de 
grupamentos fluorescente, isto ganha um forte impacto quando se pretende 
identificar vários alvos simultaneamente. 
Outros fatores que limitam a amplificação do DNA, de uma maneira em 
geral, é a necessidade prévia de regiões alvos, parcialmente ou totalmente, 
sequenciadas. Isto restringe bastante a expansão da PCR para estudo de micro-
organismos com um pequeno número de sequências disponíveis nos bancos 
públicos de DNA, GenBank. No entanto, o aumento do número de “projetos 
genoma” de vários organismos tem proporcionado a identificação de várias 
sequências gênicas, que podem ser utilizadas para o desenvolvimento de testes 
de diagnóstico, baseado na PCR. O sequenciamento do genoma total de E. 
 24
histolytica foi concluído em 2005 (LOFTUS et al. 2005). Já os sequenciamentos 
do genoma de E. moshkovskii e E. dispar estão na etapa final de montagem. 
Paradoxalmente, somente as sequências que codificma o gene SSU-rRNA de E. 
hartmanii, E. poleckii, e E. coli estão disponíveis no GenBank. De fato, os dados 
moleculares que fornecem informações importantes para a avaliação da 
diversidade intere intraespecífica de amebas que pertencem ao gênero 
Entamoeba são escassos. A única sequência gênica que é comum a todas as 
amebas que compõe o gênero Entamoeba, atualmente disponível no GenBank, é 
o gene da SSU-rRNA. Isto reduz bastante a expansão de metodologia e 
estratégias de diagnóstico para o estudo das espécies de amebas. 
Em 1992, Clark e Diamond utilizaram os iniciadores universais, 
RD5/RD3 para a amplificação de um segmento do gene SSU-rDNA. O 
diagnóstico diferencial entre E. histolytica e outros protozoários intestinais foi 
realizado por meio da análise de restrição de fragmentos polimórficos. Somente 
uma década após, a mesma estratégia para a diferenciação de espécies de 
ameba foi utilizada por Verweij e cols. (2003a). Estes autores, descreveram o 
método de hibridação reversa em membrana como intuito de identificar espécies 
do gênero Entamoeba. Inicialmente foi empregada a PCR que amplifica parte do 
gene do SSU-rDNA das amebas, empregando os iniciadores Entam1 e Entam2 
biotinilados. O produto amplificado biotinilado foi hibridizado com sondas ligadas 
na membrana de nitrocelulose e a formação dos híbridos foram detectados e 
visualizados por meio de adição de substrato quimiluminescente seguida da 
autorradiografia. 
O DNA ribossômico é uma ferramenta importante e que tem sido 
utilizado na avaliação de polimorfismo de micro-organismo de uma maneira em 
geral. A diferenciação genética entre as populações de uma espécie constitui o 
primeiro estágio da divergência evolutiva. Estas diferenças resultam, na maioria 
das vezes, da ação de diferentes ambientes a que cada população está 
 25
submetida ao longo dos anos sobre a variabilidade preexistente na espécie. 
Assim, as diferenças interespécies podem ser avaliadas. Sabemos que o gene 
SSU-rDNA está presente em multicópia no DNA extracromossômico e representa 
cerca de 200 cópias no genoma de E. histolytica e E. dispar (ALI, CLARK & 
PETRI, 2008). Esta sequência possui regiões altamente conservadas e 
intercaladas com sequências polimórficas entre o gênero Entamoeba, o que 
propicia a sua utilização para desenhos de iniciadores universais ou semi-
universais capazes de amplificar múltiplos produtos, além de sondas do tipo 
espécie específica, utilizadas na detecção de sequência-alvos empregadas no 
diagnóstico de amebas intestinais. 
Uma alternativa utilizada na identificação de espécies de parasitos é 
através da reação de sequenciamento de DNA. É uma técnica altamente 
fidedigna, porém, trabalhosa, dispendiosa, demorada e que não é prática como 
ferramenta de diagnóstico em laboratório clínico. Mas, permite identificar, 
caracterizar e avaliar a aplicabilidade das sequências consideradas como uma 
potente ferramenta para o diagnóstico. Nos últimos anos, várias tecnologias têm 
emergido como uma ferramenta diagnóstica usando como princípio o estilo 
multianalítico. Assim, o processo de diagnóstico torna-se rápido, vários patógenos 
podem ser detectados simultaneamente, sendo menos dispendioso e decaindo o 
tempo de trabalho porque estes métodos podem ser parcialmente automatizados. 
A grande vantagem dessa metodologia consiste na capacidade de atender a uma 
forte demanda no cenário de diagnóstico por métodos multianalíticos, onde 
poucos procedimentos podem diagnosticar uma grande quantidade de micro-
organismos. 
Genes de diversos patógenos, dentro do mesmo grupo 
taxonomicamente relacionados, podem ser amplificados quando empregamos 
iniciadores universais para este grupo. Estes iniciadores são capazes de 
amplificar DNA de múltiplos patógenos simultaneamente na amostra clínica. 
 26
Assim, ensaios do tipo microarranjo podem ser usados para identificar os 
produtos amplificados através da reação de hibridação empregando sondas 
patógenos-específicas. 
Sabemos que a ideia de imobilizar e hibridizar moléculas em suporte 
sólido foi primeiro proposta por Denhardt (1966), conduzindo ao desenvolvimento 
de metodologias de identificação de sequência no DNA genômico ou oriunda da 
clonagem molecular. Posteriormente, o segundo passo foi dado por Southern 
(1975), quando demonstrou que poderia ser feita a transferência de DNA do gel 
para membranas de nylon. Segundo Dyson (1991), desde as descobertas de 
Denhardt e Southern, as técnicas de hibridação em suporte sólidos tornaram-se 
gradativamente sofisticadas, principalmente devido a melhor compreensão acerca 
dos fatores que influenciam a taxa de hibridação e estabilidade dos híbridos. 
No entanto, a tecnologia de microarranjos de DNA foi descrita no final 
da década de 80 e tem impulsionado de maneira importante o estudo da 
genômica funcional, sendo recentemente aplicada na área de diagnóstico 
(PALLACIOS et al., 2007). O ensaio de microarranjos usa o princípio da 
complementaridade de bases dos ácidos nucléicos, sendo essa técnica 
essencialmente de hibridação de ácidos nucléicos em grande escala. Estudos têm 
demonstrado a sua aplicação no diagnóstico de bactérias, vírus e de parasitas. 
Wangs, Vora & Stenger (2004) descreveram a utilização deste ensaio na 
detecção de E. histolytica, E. dispar, Giárdia lamblia e Cryptosporidium parvum 
em amostras fecais. Contudo, a arquitetura dos microarranjos consiste em uma 
ordem predefinida de fragmentos de DNA quimicamente ligada à superfície sólida 
(lâmina de vidro, membrana etc.). Assim, uma grande quantidade de sondas está 
presente nestes arranjos, conferindo a técnica uma maior sensibilidade, devido a 
alta densidade das sondas específicas para um único alvo, além de possibilitar a 
detecção de diferentes organismos no mesmo ensaio. Estes arranjos pre-
definidos de oligonucleotídeos podem ser aderidos ou sintetizados sobre suportes 
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sólidos que contenham uma superfície positivamente carregada. Este processo é 
todo robotizado e requer uma estrutura complexa para a sua execução ou pode 
ser terceirizado por empresas especializadas nestas áreas. Isto faz com que esta 
tecnologia não seja exponencialmente difundida no cenário do diagnóstico. 
No final da década de 70 surgiram os primeiros trabalhos de análise de 
imunoensaio, utilizando o suporte sólido associado a citometria de fluxo (HORAN 
& WHEELESS, 1977). Desde então, a literatura vem apresentando, de forma 
crescente, a utilização de um método de detecção ensaio molecular inovador que 
associou a filosofia da citometria de fluxo ao uso de microesferas fluorescentes 
(DUNBAR, 2006). Esta tecnologia específica é representada pelo sistema da 
empresa Luminex®, que foi a pioneira no desenvolvimento do equipamento e das 
microesferas. Esta estratégia apresenta uma amplitude vasta de utilização, 
permitindo não somente a realização de imunoensaio, como de hibridação direta 
do DNA sobre a superfície de microesferas. Nota-se, ainda, que esta tecnologia 
não é controlada por licenças especiais e que aumenta o seu potencial para que 
novos ensaios possam ser desenvolvidos. 
Este sistema está fundamentado no uso de microesferas de 
poliestireno, contendo internamente uma mistura de dois fluorocromos, que 
emitem intensidades de fluorescência distintas. A utilização de proporções precisa 
desses fluorocromos produziu mais de 100 diferentes microesferas com espectros 
de emissão de fluorescências distintos. Assim,cada microesfera apresenta um 
sinal de fluorescência único e especifico. 
Em cada uma das superfícies das 100 microesferas podem ser 
acopladas moléculas de capturas como: anticorpos monoclonais com 
especificidade única, peptídeos, antígenos protéicos ou sondas específicas para 
uma sequência de DNA. Isto permite a análise simultânea de até 100 analitos 
numa única amostra, através de uma simples reação em um único tubo. A ligação 
das moléculas de captura, já acopladas a cada microesfera, no seu alvo é 
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detectada pela adição de um conjugado fluorescente. Assim, a microesfera que 
tiver os híbridos, produto amplificado biotinilado/sonda no sistema