Relatório bioquímica - Consumo de glicose por células de levedura

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Coordenadoria de Biotecnologia
Curso de Bioquímica
Prática: Consumo de glicose por células de levedura
Alunos: Adam Menezes
	 Caio Gama
	 Guilherme Campos
	 Renan Martins
Turma: QM-161
Professores: Ana Paula e Michele
Data da realização da prática: 14/06/2010
Data da entrega do relatório: 21/06/2010
Avaliação:
	Critério:
	Nota:
	Apresentação
	
	Introdução
	
	Objetivos
	
	Métodos
	
	Resultados
	
	Discussão
	
	Bibliografia
	
	Total:
	
I.Introdução:
Os carboidratos, ou sacarídeos, são moléculas cuja estrutura é formada basicamente por carbono, hidrogênio e oxigênio. Constituintes do grupo de biomoléculas mais abundantes da natureza muitos carboidratos possuem como fórmula geral (CH2O)n.
Os sacarídeos são aldeídos ou cetonas com várias hidroxilas ligadas ao longo da cadeia carbônica. Geralmente se associam a outras moléculas como lipídeos e proteínas formando glicoconjugados, é possível encontrar elementos como o nitrogênio, o fósforo ou o enxofre em suas composições. Carboidratos são divididos de acordo com o tamanho de suas cadeias, podendo ser monossacarídeos, oligossacarídeos (possuem entre 2 e 10 monossacarídeos) ou polissacarídeos (possuem centenas ou até milhares de monossacarídeos).
Os monossacarídeos são também conhecidos como açucares simples e possuem no mínimo 3 carbonos ligados por ligações covalentes. O monossacarídeo mais abundante é o açúcar de 6 carbonos chamado de D-glucose de onde muitos outros sacarídeos são derivados. Os oligossacarídeos são formados por mais de 1 monossacarídeo (máximo de 10) ligados através de ligações glicosídicas. Os mais comuns são a sacarose, a maltose e a lactose. Os polissacarídeos são formados por muitas unidades monossacarídicas unidas em longas cadeias lineares ou ramificadas. Polissacarídeos podem ser formados por apenas uma unidade monossacarídica repetitiva sendo assim chamado de homopolissacarídeo ou por duas ou mais unidades monossacarídicas, sendo assim conhecidos como heteropolissacarídeo.
A grande abundancia dos carboidratos na natureza se deve aos dois polímeros da D-glucose, o amido e a celulose. O amido é na maioria dos vegetais a principal forma de armazenamento de combustível, enquanto que a celulose é o principal componente estrutural extracelular das paredes celulares rígidas e dos tecidos fibrosos e lenhosos dos vegetais. Muitos glicídios são agentes redutores, estes são reconhecidos através de testes como a reação de Fehling na qual os açúcares são capazes de oxidar os íons Fe3+ e Cu2+.
A glicose, em sua forma cíclica, não possui carbonila livre, como acontece em sua forma de cadeia aberta. Isso impede que haja a oxidação da glicose. Porém, quando em solução aquosa, a glicose apresenta suas duas estruturas em equilíbrio, o que permite que a oxidação entre ela e o ácido
Um método muito utilizado para dosar os açúcares redutores, é o chamado método do DNS. De acordo com esse método, os açúcares redutores reduzem o DNS, gerando complexos de coloração alaranjada, os quais podem ser quantificados por espectrofotometria a 540nm. Portanto, somente monossacarídeos como a glicose e a frutose podem ser dosadas por este meio devido ao seu poder redutor. Um dissacarídeo como a sacarose, por exemplo, não poderia ser dosada desta maneira por não possuir em sua estrutura um carbono anomérico disposto à oxidação, não sendo portanto um dissacarídeo redutor e sim um açúcar não-redutor ou glicosídeo.
II.Objetivos:
· Observar os valores de absorbância dos tubos com a glicose de concentração conhecida, para assim traçar uma curva padrão.
· Utilizar esta curva padrão para descobrir a concentração de glicose e quanto de glicose foi consumido pela levedura.
III.Materiais utilizados:
	· Estante de tubos
· Fermento biológico seco 1,0g
· Parafilm®
· 5 Pipetas cada uma de 1,0 (3 unidades); 5,0 (1 unidade) e 10 mL (1 unidade)
· 2 pró-pipetes
· Solução de ácido 3,5 dinitrossalicílico a 1%
· Solução de glicose a 0,5% (27,8 M)
· Solução padrão de glicose 10mM
· Pipeta automática (200 µL) e tips (ponteiras)
· 15 Tubos de ensaio (tamanho que caiba na centrífuga)
	
· Placa de agitação e barra magnética
· Banho do gelo-isopor 
· Banho-maria a 100ºC
· Bastão de vidro
· 2 bechers 50 mL
· Centrífuga clínica
· 10 Cubetas
· Erlenmeyer com capacidade de 250 mL 
· Espectrofotômetro (540 nm). 
IV.Métodos:
	
Em um erlenmeyer de 250 mL foram adicionados 1 g de fermento biológico e 70 mL da solução de glicose 0,5%. Agitou-se o frasco vigorosamente até formar uma suspensão homogênea.
Logo depois, pipetou-se 5 mL da suspensão, transferindo-se para um tubo de centrífuga e levando-se ao banho de gelo. Neste momento marcou-se o tempo zero. O erlenmeyer foi deixado com a suspensão com agitação constante com o parafilm tampando-o. Após 15, 30 e 45 minutos, retirou-se outras alíquotas de 5 mL.
Esperou-se cinco minutos depois da retirada da última alíquota e então centrifugou-se as mesmas por 10 minutos a 3000 rpm. Alíquotas de 0,1 ml foram pipetados do sobrenadante, com o auxílio de uma pipeta automática para novos tubos de ensaio.
A fim de realizar a dosagem de açúcares redutores, adicionou-se os reagentes aos tubos de ensaio de acordo com a tabela abaixo. Os tubos foram homogeneizados e aquecidos em banho-maria a 100°C por 5 minutos. Os tubos foram postos à temperatura ambiente para esfriar. Em seguida, adicionou-se 8 mL de água destilada a cada tubo, totalizando 10 mL de volume final.
O conteúdo dos tubos foi transportado para as cubetas. Em seguida utilizou o espectrofotômetro (540 nm) para observar as leituras da absorbância, sendo o tubo branco usado para a calibração do mesmo.
A curva padrão foi traçada através dos valores de absorbância observados e os valores de concentração.
	Tubo nº
	Água destilada(mL)
	Sol. padrão de glicose 10mM(mL)
	Alíquotas (mL)
	Sol. DNS (mL)
	1
	1,0
	-
	-
	1,0
	2
	0,9
	0,1
	-
	1,0
	3
	0,8
	0,2
	-
	1,0
	4
	0,7
	0,3
	-
	1,0
	5
	0,6
	0,4
	-
	1,0
	6
	0,5
	0,5
	-
	1,0
	To
	0,9
	-
	0,1
	1,0
	T15
	0,9
	-
	0,1
	1,0
	T30
	0,9
	-
	0,1
	1,0
	T45
	0,9
	-
	0,1
	1,0
Tabela 1 – Tubos de ensaio e os respectivos volumes adicionados.
V.Resultados:
	Tubos
	Absorbancia
	Tubo 1
	0,000
	Tubo 2
	0,095
	Tubo 3
	0,221
	Tubo 4
	0,300
	Tubo 5
	0,397
	Tubo 6
	0,532
	To
	0,300
	T15
	0,231
	T30
	0,199
	T45
	0,188
Tabela 2 – Tubos de ensaio e seus respectivos valores de absorbância utilizando o tubo 1 como o branco.
Cálculos da concentração de Glicose:
O cálculo das concentrações foi feito utilizando o valor de concentração inicial vezes o fator de diluição que seria o volume de glicose adicionado dividido pelo volume final do tubo.
Concentração inicial = 10mM
Volume final = 10 mL
Tubo 1: Concentração = 0,00 mM
Tubo 2:
Volume adicionado = 0,1 mL
Cf = (10 x 0,1)/10 = 0,1 mM
 Concentração final = 0,1 mM
Tubo 3:
Volume adicionado = 0,2 mL
Cf = (10 x 0,2)/10 = 0,2 mM
 Concentração final = 0,2 mM
Tubo 4:
Volume adicionado = 0,3 mL
Cf = (10 x 0,3)/10 = 0,3 mM
 Concentração final = 0,3 mM
Tubo 5:
Volume adicionado = 0,4 mL
Cf = (10 x 0,4)/10 = 0,4 mM
 Concentração final = 0,4 mM
Tubo 6:
Volume adicionado = 0,5 mL
Cf = (10 x 0,5)/10 = 0,5 mM
 Concentração final = 0,5 mM
	Tubos
	Absorbância
	Concentração
	Tubo 1
	0,000
	0,00
	Tubo 2
	0,095
	0,1
	Tubo 3
	0,221
	0,2
	Tubo 4
	0,300
	0,3
	Tubo 5
	0,397
	0,4
	Tubo 6
	0,532
	0,5
Tabela 3 – Tabela apresentando os pontos utilizados para traçar a curva padrão( absorbância x concentração ).
Através da curva padrão foi calcula a equação da reta para que posteriormente fosse possível a descoberta das concentrações dos tubos T0,T15,T30 e T45 .
Cálculo da equação da reta:
 (
Y = AX
)y(absorbância)
x(concentração)
A= (Soma da absorbância de todos os tubos) / (Soma da concentração de todos os tubos)
A= (0,00 + 0,095 + 0,221 + 0,300 + 0,397 + 0,532 ) / ( 0,00 + 0,1 + 0,2 + 0,3 + 0,4 + 0,5 )
A = 1,545 / 1,5 = 1,03
 (
Y = AX
)
(Absorbância) = 1,03 x (Concentração)
	Tubos
	Tubo 0
	Tubo 15
	Tubo 30
	Tubo 45
	Absorbância
	0,300
	0,231
	0,199
	0,188
Tabela4 – Valores de absorbância observados e seus respectivos tubos.
Sabendo-se foi possível calcular a concentração dos tubos T0,T15,T30 e T45 .
Cálculos:
(Concentração) = (Absorbância) / 1,03
Tubo 0: 0,300/ 1,03 = 0,291 mM
Tubo 15: 0,231/ 1,03 = 0,224 mM
Tubo 30: 0,199/ 1,03 = 0,193 mM
Tubo 40: 0,188/ 1,03 = 0,182 mM
Sendo esta a concentração de glicose diluída para o calculo da final será necessário dividir pelo fator de diluição, sendo este (volume inicial de glicose= 0,1) / ( volume final do tubo ).
	Tubos
	Tubo 0
	Tubo 15
	Tubo 30
	Tubo 45
	Concentração de glicose diluída
	0,291
	0,224
	0,193
	0,182
Tabela 5 – Valores de concentração de glicose após a diluição.
Cálculos da concentração de glicose inicial, ou seja, antes da diluição:
Tubo 0: Ci = 0,291 x 10/0,1 = 29,1 mM
Tubo 15: Ci = 0,224 x 10/0,1 = 22,4 mM
Tubo 30: Ci = 0,193 x 10/0,1 = 19,3 mM
Tubo 45: Ci = 0,182 x 10/0,1 = 18,2 mM
	Tubos
	Concentração(mM)
	To
	29,1
	T15
	22,4
	T30
	19,3
	T45
	18,2
Tabela 6 – Valores de concentração de glicose antes da diluição.
VI.Discussão:
A solução, que mais tarde formará uma suspensão constituída de glicose e fermento foi agitada para que grandes quantidade de fermento fosse diluída sem um consumo significativo de glicose. Logo, o tubo no qual estaria a solução de tempo zero(T0) teria a concentração de glicose parecidas com o colocado. Utilizou-se o banho de gelo para que houvesse uma pausa no consumo de glicose, proveniente de fragmentos de fermento que encontravam-se diluídos no meio. Mais tarde, os restos de fermento foram eliminados por meio de uma centrifugação, onde apenas o sobrenadante foi levado para as etapas seguintes.
As coloraçôes observadas nos tubos após os experimentos variavam entre tons de amarelo e laranja, por causa do ácido 3-amino-5-dinitro salicílico produzido através da interação da glicose com o DNS.A coloração era mais intensa em alguns tubos devido a uma maior presença do ácido 3-amino-5-nitro, quanto maior a concentração do mesmo mais intensa a coloração.
As relações entre a concentração utilizada e a absorbância, foram evidenciadas no gráfico da curva padrão.
Notou-se que a concentração de glicose era decrescente conforme os tubos permaneciam fora do banho de gelo, ou seja, o tubo zero( T0 ) por permanecer no banho de gelo o tempo todo reduziu quase totalmente o consumo de glicose pelas leveduras. Os outros tubos por ficarem cada vez mais tempo fora do banho de gelo permitiram o consumo de glicose por parte das leveduras onde quanto mais tempo fora do banho menor a concentração de glicose. Uma vez dentro do banho de gelo a reação é quase totalmente reduzida. O tubo T45 por ter ficado mais tempo fora do banho de gelo teve o maior consumo de glicose como confirmado pelo calculo das concentrações.
 A levedura, como uma célula simples necessita que haja um consumo de glicose para a formação de ATP necessário para as funções básicas de suas células. Uma vez que esta taxa de ATP é alcançada a necessidade do consumo de glicose diminui sendo isto observado na prática.
VII.Bibliografia:
LEHNINGER, A.L. & NELSON, D.L. & COX, M.M. Lehninger Princípios da Bioquímica. 3ª edição. São Paulo: Editora Sarvier, 2002. 977 p.
STRYER, Lubert. Bioquímica. 3. ed. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 1992. 881p.
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