PREPARAÇÃO DE TECIDOS PARA EXAME MICROSCÓPICO

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PREPARAÇÃO DE TECIDOS PARA EXAME MICROSCÓPICO
O procedimento mais usado no estudo de tecidos é a preparação de cortes histológicos que
podem ser estudados com a ajuda de um microscópio. No microscópio de luz (também
chamado de microscópio óptico ou fotônico) a imagem pode ser examinada porque um feixe
de luz é transmitido através do corte. Considerando que tecidos e órgãos são normalmente
espessos demais para permitir a passagem de um feixe de luz, eles devem ser seccionados para
se obterem cortes delgados. No entanto, células vivas, camadas muito delgadas de tecidos ou
membranas transparentes de animais vivos (por exemplo, o mesentério, a cauda de um girino,
a parede de uma bolsa existente na bochecha de hamsters) podem ser observadas diretamente
te ao microscópio sem necessidade de seccioná-las. Desta maneira, é possível estudar essas
estruturas por longos períodos sob diversas condições fisiológicas ou experimentais. Na
maioria dos casos, porém, os tecidos e órgãos devem ser fatiados em seções ou cortes
histológicos muito delgados, que são colocados em lâminas de vidro antes de serem
examinados. Estas soluções são obtidas a partir de tecidos e órgãos que necessitam sofrer uma
série de tratamentos prévios para então poderem ser fatiados por meio de instrumentos de
grande precisão chamados micrótomos.
Um preparado microscópio ideal deveria ser preservado de tal forma que sua estrutura e
composição molecular seriam as mesmas que tinha no corpo Isto é as vezes possível, porém na
prática é difícil de realizar, de modo que distorções e perda de componentes, fenômenos que
em conjunto são chamados de artefatos, quase sempre estão presentes.
Fixação
Para evitar a digestão dos tecidos por enzimas presentes no interior de células (autólise) ou por
bactérias e para preservar a estrutura e a composição molecular, fragmentos de orglios devem
ser tratados antes ou o mais rapidamente possível depois de sua remoção. Este tratamento é
chamado fixação e pode ser feito por substâncias químicas ou, menos frequentemente, por
métodos físicos. Na fixação química os tecidos são geralmente imersos em soluções de agentes
desnaturantes ou de agentes que estabilizam as moléculas formando pontes com moléculas
vizinhas. Estas soluções são chamadas de fixadores. Como demora algum tempo para que o
fixador se difunda completamente pelo interior dos tecidos, estes geralmente devem ser
cortados em fragmentos pequenos antes de serem imersos no fixador, para facilitar a
penetração do fixador e, por conseguinte, garantir uma boa preservação das suas estruturas.
Alternativamente, pode ser utilizada a perfusão intravascular do fixador, que deste modo
alcançar a intimidade dos tecidos rapidamente pelos vasos sanguíneos, sendo a fixação melhor.
Um dos melhores fixadores rotineiros para microscopia de luz é uma solução isotônica
tamponada de formaldeído do a 4%. A química do processo de fixação é complexa e nem
sempre bem compreendida. Formaldeído e glutaraldeído, outro fixador extensamente usado,
são conhecidos por reagir com os grupos amina (NH) das proteínas dos tecidos No caso de
glutaraldeído, a sua ação fixadora é reforçada pelo fato de ser um dialdeído que promove a
formação de ligações cruzadas entre proteínas.
Devido à alta resolução oferecida pelo microscópio eletrônico, é necessário um cuidado muito
maior na fixação para preservar detalhes da ultra-estrutura das células e da matriz Para esta
finalidade uma fixação dupla usando uma solução de glutaraldeído tamponado, seguida por
uma segunda fixação em tetróxido de ósmio, tornou-se um procedimento padrão em
preparações para estudos ultra-estruturais. O efeito do tetróxido de ósmio é preservar e
fornecer contraste aos lipídios e proteínas.
Inclusão
Para obter seções delgadas como micrótomo, após terem passado pela fixação os fragmentos
de tecidos e órgãos devem ser infiltrados com substâncias que lhes proporcionem uma
consistência rígida. Dentre as substâncias que têm esta propriedade, as mais utilizadas são a
parafina e algumas resinas de plástico. A parafina é habitualmente usada para microscopia de
luz, enquanto as resinas são usadas para microscopia de luz e eletrônica. O processo de
impregnar os tecidos com parafina é chamado inclusão ou embebição e geralmente é
precedido por duas etapas: desidratação e clareamento. A água é inicialmente extraída
passando os fragmentos por diversos banhos de soluções de concentrações crescentes de
etanol em água (normalmente de etanol 70% a etanol 100%). Após a desidratação o etanol
presente nos fragmentos deve ser substituído por uma substância intermediária (geralmente
um solvente orgânico) que é miscível tanto em etanol como no meio que foi escolhido para
inclusão (parafina ou resina). Para a inclusão em parafina a substância intermediária mais
comumente usada é o xilol. Quando os fragmentos de tecidos são embebidos e saturados com
o solvente orgânico, eles ficam transparentes ou translúcidos. A seguir são colocados em
parafina previamente derretida em uma estufa, normalmente a 58-60°C. O calor causa a
evaporação do solvente e os espaços existentes dentro dos tecidos são preenchidos com
parafina. Tecido embebido em parafina se torna rígido depois de ter sido retirado da estufa. No
caso de tecidos a serem embebidos com resinas plásticas, eles também são desidratados em
etanol dependendo do tipo de resina usada, depois infiltrados com solventes de plástico. O
etanol ou o solvente é depois substituído por soluções de plástico que endurecem por
polimerização. A inclusão em resina plástica pode evitar alguns dos efeitos da alta temperatura
das estufas, produzindo menos artefatos que os da parafina permitindo a obtenção de sexo
mas delgadas.
Os blocos rígidos que contém os tecidos são então levados a um micrótomo, onde são
seccionados por uma lâmina de aço ou de vidro de modo a fornecer cortes de 1-10 um de
espessura. Após serem seccionados, os cortes são colocados para flutuar sobre uma superfície
de água aquecida, de onde são colocados sobre lâminas de vidro, onde aderem e onde serão
depois corados. Um modo completamente diferente de preparar secções de tecidos pode ser
feito submetendo os tecidos a um congelamento rápido. Desta maneira, os tecidos são fixados
por congelação (um método físico), ficando ao mesmo tempo rígidos e, assim, prontos para
serem seccionados. Um micrótomo para tecidos congelados - o criostato - foi desenvolvido
para a produção de cortes de tecidos congelados. Pelo fato deste método permitir a
preparação rápida de cortes sem passar pelo longo procedimento de desidratação e inclusão
descrito acima, eles são habitualmente usados em hospitais para analisar espécimes obtidos
durante procedimentos cirúrgicos. Congelar tecidos é também muito útil para o estudo
histoquímico de enzimas muito sensíveis ou de moléculas pequenas, pois o congelamento, ao
contrário da fixação química, não inativa a maioria das enzimas e mantém as pequenas
moléculas em seus locais originais. Quando se deseja estudar lipídios presentes nos tecidos, é
aconselhado o uso de secções congeladas, pois a imersão de tecidos em solventes como xilol
dissolve as substâncias.
Coloração
Para serem estudados no microscópio, a maioria dos cortes histológicos devem ser corados.
Isto porque, com poucas exceções, a maioria dos tecidos é incolor, de modo que observá-los ao
microscópio de luz será muito pouco proveitoso. Foram desenvolvidos métodos de coloração
que não só tornam evidentes os vários componentes dos tecidos, como também facilitam a
distinção entre eles. A seletividade com que os corantes coram os componentes dos tecidos
pode ser maior ou menor. A maioria dos corantes se comporta como compostos ácidos ou
básicos e tende a formar ligações eletrostáticas (salinas) com radicais ionizados dos tecidos. Os
componentes dos tecidos que se coram bem com corantes básicos são chamados de basófilos,
e os que têm grande afinidade por corantes ácidos são chamados de acidófilos.O azul de toluidina e o azul de metileno são exemplos de corantes básicos. A hematoxilina
comporta-se como um corante básico, ligando-se às estruturas basófilas dos tecidos. Os
principais componentes dos tecidos que ionizam reagem com corantes básicos o fazem por
conter ácidos na sua composição - ácidos nucléicos, glicosaminoglicanas e glicoproteínas
ácidas. Corantes ácidos (por exemplo, orange G, eosina, fucsina ácida) coram principalmente os
componentes acidófilos dos tecidos como as mitocôndrias, os grânulos de secreção, proteínas
citoplasmáticas e colágeno.
Dentre todos os corantes, a combinação de hematoxilina e eosina (HE) é a mais comumente
usada. A hematoxilina cora em azul ou violeta o núcleo das células e outras estruturas ácidas
(como porções do citoplasma ricas em RNA e a matriz da cartilagem hialina). A eosina, por
outro lado, cora o citoplasma e o colágeno em cor-de-rosa. Muitos outros corantes são usados,
como os tricrômicos (por exemplo, os corantes de Mallory e de Masson). Os tricrômicos, além
de mostrar muito bem o núcleo e o citoplasma, ajudam a diferenciar colágeno e músculo liso
entre si. Uma técnica especialmente boa para observar e diferenciar colágeno é o uso do
corante picro-sirius associado com luz polarizada (ver Microscopia de polarização). Embora a
maioria dos corantes seja útil para visualizar os vários componentes dos tecidos, eles
normalmente oferecem pouca informação sobre a natureza química dos componentes dos
tecidos.
Em muitos procedimentos (ver Imunocitoquímica) as estruturas são evidenciadas por um
precipitado ou por um corante fluorescente, mas as células e os seus limites não são visíveis.
Neste caso é usado um contracorante - trata- se de um corante aplicado a um corte apenas
para permitir a visualização dos contornos das células ou núcleos. Uma outra maneira de
evidenciar componentes de células e tecidos é a sua impregnação por metais, como prata e
ouro, método comum para estudar tecido nervoso.
O procedimento inteiro, desde a fixação até a observação de um tecido em um microscópio de
luz, pode demorar de 12 h a 24 dias, dependendo do tamanho do tecido, do fixador e do meio
de inclusão utilizados.
MICROSCOPIA DE LUZ
Por meio do microscópio de luz, preparações coradas são examinadas por iluminação que
atravessa o espécime. O microscópio é composto de partes mecânicas e ópticas (Fig.1.2). O
componente óptico consiste em três sistemas de lentes: condensadora, objetiva e ocular. O
condensador concentra a luz e projeta um feixe luminoso sobre o espécime. A objetiva projeta
uma imagem aumentada do objeto em direção à ocular, que novamente amplia a imagem e a
projeta na retina, em uma tela, em um negativo fotográfico ou em um detector (como uma
câmera CCD). Para imagens projetadas na retina, a ampliação total dada pelo microscópio é
igual ao aumento da objetiva multiplicado pelo aumento da ocular.
Resolução
O fator mais crítico para o microscópio fornecer uma imagem detalhada é seu poder de
resolução, que é definido como a menor distância entre duas partículas ou duas linhas que
permite que elas sejam vistas como dois objetos separados. O poder de resolução máximo
(também chamado de resolução ou limite de resolução) do microscópio de luz é de
aproximadamente 0,2 µm; esta resolução permite a obtenção de boas imagens aumentadas de
1.000 a 1.500 vezes. Objetos menores que 0,2 µm (como por exemplo a membrana da célula
ou um filamento de actina) não podem ser distinguidos com este instrumento. Igualmente,
dois objetos, como duas mitocôndrias ou dois lisossomos, serão vistos como um só objeto se
eles estiverem se parados por menos de 0,2 µm. O que determina a riqueza de detalhes da
imagem fornecida por um sistema óptico é seu limite resolutivo e não seu poder de aumentar
de tamanho os objetos. A propriedade de aumentar só tem valor prático se for acompanhada
de poder de resolução. Este depende essencialmente da objetiva, enquanto a lente ocular
apenas aumenta a imagem real projetada pela objetiva. Quando se comparam objetivas de
ampliações diferentes, é possível verificar que as que fornecem aumentos maiores também
têm poder de resolução mais elevado.
Os limites da microscopia têm sido alargados pelo uso de vídeo-câmeras de alta sensibilidade e
resolução que permitem a digitalização de imagens que podem ser usadas em computadores
para análise quantitativa por meio de aplicativos de análise de imagem. Objetos que não são
visíveis diretamente pela ocular podem ser visualizados por uma vídeo-câmera. Estes sistemas
também são úteis para estudar células vivas por períodos longos de tempo, porque usam luz
de baixa intensidade e evitam o dano celular que pode resultar de uma iluminação intensa.
MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE E DE CONTRASTE DIFERENCIAL DE
INTERFERÊNCIA
Alguns sistemas ópticos permitem a observação de células e cortes não corados. Espécimes
biológicos não corados são geralmente transparentes e difíceis de serem observa dos com
detalhes, pois todas as partes do espécime têm quase a mesma densidade óptica. Porém, a
microscopia de contraste de fase usa um sistema de lentes que produz imagens visíveis de
objetos quase transparentes (Fig. 1.3).
A microscopia de contraste de fase é baseada no fato de que a luz muda sua velocidade ao
atravessar estruturas celulares e extracelulares que tenham índices de refração diferentes.
Estas mudanças são usadas pelo sistema de contraste de fase para fazer com que as estruturas
apareçam mais claras ou mais escuras e fazem deste tipo de microscopia uma ferramenta
poderosa para observar células vivas. Outro instrumento para observar células ou secções de
tecidos não corados é a microscopia de contraste diferencial (microscopia de Nomarski), que
produz uma imagem aparentemente tridimensional (Fig. 1.3).
MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO
Quando raios de luz passam através de um filtro polarizador (como um filtro Polaroid), eles
saem vibrando em uma só direção. Um segundo filtro colocado com seu eixo principal
perpendicular ao primeiro filtro bloqueará a passagem da luz. Se, porém, um tecido que tiver
estruturas formadas por átomos e moléculas com um alto grau de orientação (como celulose,
colágeno, cristais, microtúbulos e microfilamentos) for colocado entre os dois filtros, a
estrutura molecular repetitiva e orientada modifica o plano de vibração da luz que emerge do
primeiro filtro, fazendo com que estas estruturas aparecem luminosas contra um fundo escuro
após passarem pelo segundo filtro (Fig. 1.4). A capacidade que as estruturas têm de girar o
plano de vibração da luz polarizada é chamada birrefringência.
MICROSCOPIA CONFOCAL
A profundidade de foco no microscópio de luz é relativamente longa, especialmente quando
são usadas objetivas de pequeno aumento. Isto significa que uma grande espessura do
espécime é vista em foco simultaneamente, causando a superposição da imagem originada de
um objeto tridimensional. Uma das características mais importantes do microscópio confocal é
o fato de que ele torna possível focalizar um plano de foco muito delgado do espécime. Os
princípios nos quais este microscópio se baseia são os seguintes: 1) o espécime é iluminado por
um feixe de luz muito estreito (no microscópio de luz um feixe muito grande ilumina o
espécime); 2) a imagem coleta do espécime me deve passar por um pequeno orifício. A
consequência esse arranjo é que só a imagem originada do plano focalizado alcança o detector,
enquanto as imagens de planos anteriores e posteriores são bloqueadas (Fig. 1.5). A luz
proveniente de fora do plano de foco é em grande parte eliminada, a definição do objeto
focalizado fica melhor e a localização de componentes do espécime pode ser feita com muito
mais precisão que no microscópio de luz.
Por razões práticas o seguinte arranjo é usado na maioria dos microscópios confocais (ver Fig.
1.6): 1) a iluminação é provida por uma fonte de laser, 2) como esta fornece um ponto de
iluminação muito pequeno, ele deveser varrido sobre o espécime para permitir a observação
de uma área maior do espécime; 3) o componente do espécime que é de interesse deve ser
marcado com uma molécula fluorescente (isto significa que uma secção rotineira não pode ser
estudada); 4) a luz usada para formar uma imagem é aquela que é refletida pelo espécime; 5) a
luz refletida é capturada por um detector, onde o sinal é ampliado eletronicamente para ser
visto em um monitor. Como somente um plano focal muito delgado é focalizado de cada vez
(também chamado de secção óptica), é possível reunir os vários planos de um espécime e
reconstruí-los em um objeto tridimensional. Para realizar todas estas funções, os microscópios
confocais dependem da grande capacidade de computação.
MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA
Quando certas substâncias são irradiadas por luz de um certo comprimento de onda, elas
emitem luz com um comprimento de onda mais longo. Este fenômeno é chamado
fluorescência. Na microscopia de fluorescência as secções de tecidos são geralmente irradiadas
com luz ultravioleta e emitem luz na porção visível do espectro, fazendo com que as
substâncias fluorescentes apareçam brilhantes sobre um fundo escuro. O microscópio de
fluorescência possui uma fonte de luz ultravioleta muito intensa e filtros especiais que
selecionam o comprimento de onda dos raios luminosos que atingem o espécime e também
dos raios que são emitidos pelo espécime.
Substâncias fluorescentes com afinidade por moléculas presentes nas células ou na matriz
podem ser usadas como corantes fluorescentes, como alaranjado de acridina, que pode
combinar-se com o DNA e RNA. Quando observado em um microscópio de fluorescência, o
complexo DNA alaranjado de acridina emite fluorescência de cor verde amarelada e o
complexo RNA alaranjado de acridina emite fluorescência vermelho-alaranjada. Assim, é
possível identificar e localizar os dois tipos de ácidos nucléicos nas células através da
microscopia de fluorescência (Fig. 1.7). Outra aplicação importante resulta da combinação
química de substâncias fluorescentes (como o isotiocianato de fluoresceína - FITC) com
moléculas que se ligam especificamente a componentes das células e tecidos, permitindo
assim a identificação destes componentes através da fluorescência que eles irão emitir (ver
Detecção de moléculas em cortes histológicos por meio de interações moleculares de alta
afinidade).
MICROSCOPIA ELETRÔNICA
A microscopia eletrônica de transmissão e de varredura se baseia na interação entre elétrons e
componentes dos tecidos.
Microscopia Eletrônica de Transmissão
O microscópio eletrônico de transmissão é um sistema de produção de imagens que
teoricamente permite uma altíssima resolução (0,1 nm) (Fig. 1.8). Na prática, porém, a
resolução obtida pela maioria dos bons instrumentos se situa ao redor de 3 nm, resolução que
permite que espécimes ampliados até 400.000 vezes sejam vistos com detalhes. Infelizmente,
este nível de ampliação só pode ser usado para analisar partículas ou moléculas isoladas, pois
cortes delgados de células e tecidos podem ser observados com detalhes em aumentos de até
cerca de 120.000 vezes.
O funcionamento do microscópio eletrônico de transmissão se baseia no seguinte princípio:
elétrons podem ser desviados por campos eletromagnéticos de uma maneira semelhante à
refração produzida na luz por lentes de vidro. Os elétrons são liberados pelo aquecimento de
um delicado filamento metálico (geralmente tungstênio) em vácuo. Os elétrons libertados por
este filamento (chamado de catodo) são então submetidos a uma diferença de voltagem de
60-120 kV existente entre o catodo e o anodo, que é um prato metálico com um orifício em seu
centro (Fig. 19). Desta maneira, os elétrons são atraídos pelo anodo e acelerados, atingindo
altas velocidades. Após atravessarem o orifício do anodo eles formam um feixe de elétrons que
percorre o tubo do microscópio. No tubo, o feixe de elétrons passa pelo interior de bobinas
elétricas e é desviado de maneira análoga ao que acontece com um feixe luminoso em lentes
de vidro, porque elétrons desviam seu trajeto quando são submetidos a campos magnéticos.
Por esta razão, as bobinas dos microscópios eletrônicos são chamadas de lentes
eletromagnéticas.
A configuração do microscópio eletrônico é muito semelhante à do microscópio de luz, embora
o trajeto dos elétrons em geral se dê de cima para baixo (Fig. 1.9). A primeira lente é uma
condensadora que focaliza o feixe de elétrons no espécime. Alguns elétrons interagem com
átomos do corte ao atravessá-lo e continuam seus trajetos em direção às outras lentes,
enquanto outros simplesmente cruzam o espécime sem interagir com ele. A maioria dos
elétrons atinge a lente objetiva que produz uma imagem aumentada do objeto, a qual é
projetada nas outras lentes que por sua vez aumentam a imagem ainda mais. Pelo fato da
nossa retina não ser sensível a elétrons, para se observar uma imagem os elétrons necessitam
ser projetados sobre um detector - uma placa fluorescente, um negativo fotográfico ou uma
câmera CCD. Como a imagem no microscópio eletrônico de transmissão é produzida pelo
balanço da quantidade de elétrons que atingiram o detector e elétrons que foram retidos no
tubo do microscópio, a imagem resultante é sempre em preto e branco. As áreas escuras de
uma micrografia eletrônica costumam ser denominadas de elétron-densas, enquanto as áreas
claras são chamadas de elétron-lucentes ou elétron-transparentes.
Para haver uma interação adequada entre o espécime e os elétrons, o microscópio eletrônico
utiliza cortes muito delgados (40-90 nm de espessura), e para conseguir estes cortes os tecidos
são incluídos em resinas plásticas, como as do tipo epóxi. Os blocos assim obtidos são tão
duros que navalhas de vidro ou de diamante são necessárias para seccioná-los. Os cortes são
coletados em pequenas grades de metal medindo cerca de 3 mm de diâmetro, as quais são
colocadas no interior do tubo do microscópio para serem observadas. Técnicas de congelação
permitem o exame de tecidos por microscopia eletrônica sem a necessidade defixação e
inclusão em resina. Com estas técnicas há menos artefatos em comparação com as técnicas
convencionais, embora as técnicas de congelação sejam muito trabalhosas. Tecidos congelados
podem ser seccionados e submetidos a técnicas citoquímicas e imunocitoquímicas ou podem
ser fraturados (criofratura, freeze fracture) para fornecer detalhes da estrutura interna de
membranas celulares.
Microscopia Eletrônica de Varredura
A microscopia eletrônica de varredura fornece imagens pseudotridimensionais das superfícies
de células, tecidos e órgãos. Neste microscópio eletrônico um feixe muito pequeno de elétrons
é movido sequencialmente de modo a esquadrinhar (varrer) o espécime. Diferentemente do
microscópio eletrônico de transmissão, no microscópio de varredura os elétrons não
atravessam o espécime (Fig. 1.10). Os elétrons interagem com uma camada muito delgada de
metal previamente aplicada ao espécime e são refletidos pelos átomos do metal. Estes elétrons
são capturados por um detector que os transmite a amplificadores e outros dispositivos de
forma que o sinal é finalmente projetado em um tubo de raios catódicos (um monitor),
resultando em uma imagem em preto e branco. As fotografias resultantes são de fácil
interpretação, pois apresentam imagens que parecem ser iluminadas e possuem locais claros e
outros sombreados. O microscópio eletrônico de var madura mostra somente uma visão de
superfícies. O interior de órgãos pode ser analisado congelando células ou órgãos e em seguida
fraturando-os para expor as suas superfícies internas. Veja alguns exemplos de imagens obtidas
com este tipo de microscopia nas Figs. 123124174 19.6 e 21.11.
RADIOAUTOGRAFIA EM SECÇÕES DE TECIDOS
A radioautografia é o estudo de processos biológicos em cortes de tecidos por meio de
radioatividade. A radioautografia permite a localização de substâncias radioativas em tecidos
peloefeito de sua radiação em emulsões fotográficas. Cristais de brometo de prata presentes
na emulsão agem como micro detectores de radioatividade da mesma maneira como eles
respondem à luz em um negativo fotográfico. A primeira etapa da radioautografia é fornecer
moléculas radioativas às células. Muitos tipos de moléculas podem ser usados, dependendo da
finalidade do estudo: aminoácidos radioativos, nucleotídeos radioativos, açúcares radioativos
etc. Estas moléculas são chamadas precursores, porque podem ser usadas pelas células para
sintetizar moléculas maiores, como proteínas, ácidos nucléicos, polissacarídeos e
glicoproteínas. Cortes dos tecidos a serem analisados são cobertos no escuro com uma
emulsão fotográfica. As lâminas são mantidas em caixas à prova de luz e, depois de um tempo
de exposição adequado, elas são reveladas fotográficamente e examinadas ao microscópio. Os
cristais de brometo de prata da emulsão que foram atingidos por radiação originam pequenos
grânulos pretos de prata metálica que indicam a existência de radioatividade no tecido; as
estruturas do corte que contêm moléculas radioativas são portanto cobertas por estes
grânulos. Este procedimento pode ser usado tanto em microscopia de luz como eletrônica (Fig
1.11).
Muitas informações podem ser obtidas pela localização de radioatividade em componentes de
tecidos. Se tiver sido usado um aminoácido radioativo como precursor, é possível conhecer
quais células de um tecido produzem mais e quais produzem menos proteínas, porque o
número de grânulos de prata existentes sobre as células é proporcional à intensidade de
síntese de proteína. Se for usado um precursor radioativo de DNA (como timidina radioativa), é
possível determinar quais e quantas células de um tecido estão se preparando para dividir.
Podem também ser analisados eventos dinâmicos, por exemplo: 1) se queremos saber onde na
célula é produzida uma proteína, se ela é secretada e qual o seu trajeto na célula durante a
secreção, podem-se injetar vários animais com um aminoácido radioativo e sacrificá-los em
diferentes tempos depois da injeção. Os rádio autógamas dos cortes podem mostrar a
migração das proteínas radioativas sintetizadas e secretadas. 2) Se queremos saber onde são
produzidas células novas em um órgão e para onde elas migram, podem-se injetar vários
animais com timidina radioativa e sacrificá-los em vários tempos depois da injeção. Os
radioautogramas mostram onde as células se dividem e para onde elas migram, se este for o
caso (Fig. 1.12).
CULTURA DE CÉLULAS E TECIDOS
Em um organismo complexo as células são banhadas pelo plasma sanguíneo que contém
centenas de moléculas diferentes. Células vivas podem ser mantidas e estudadas fora do
corpo, o que é muito útil para estudar o efeito isolado de moléculas sobre um tipo de célula ou
tecido. A cultura de células permite também a análise direta do comportamento de células
vivas por meio de um microscópio, e além disso várias experiências que não podem ser
executadas em um animal vivo podem ser feitas in vitro.
As células e os tecidos são cultivados em soluções de composição conhecida (sais,
aminoácidos, vitaminas) às quais são frequentemente adicionados componentes do soro. Para
preparar culturas de um tecido ou órgão, as células devem ser inicialmente separadas
mecanicamente ou por meio de tratamento enzimático. Uma vez isoladas, as células podem
ser cultivadas em suspensão ou podem ser colocadas sobre uma placa de Petri (feita de vidro
ou plástico) ou sobre uma lamínula de vidro, superfícies sobre as quais elas costumam aderir e
crescer sob forma de uma única camada de células (Fig. 1.3). Culturas feitas desta maneira são
chamadas culturas primárias. Muitos tipos de células assim isolados a partir de tecidos normais
ou patológicos e que foram desde então mantidos in vitro constituem agora linhagens
permanentes de células. A maioria das células obtidas de tecidos normais tem uma duração de
vida finita, programada geneticamente. No entanto, modificações (principalmente relacionadas
com oncogenes; ver Cap. 3) podem promover a imortalidade das células in vitro, processo este
chamado de transformação, que pode ser o primeiro passo da mudança do estado de uma
célula normal em direção a uma célula cancerosa. Por causa do fenômeno da transformação e
de outras melhorias na tecnologia do cultivo celular, a maioria dos tipos de células podem ser
agora mantidos indefinidamente no laboratório. Todos os procedimentos com células e tecidos
vivos devem obviamente ser executados em uma área estéril usando-se soluções e
equipamento estéreis.
FRACIONAMENTO CELULAR
Organelas e outros componentes das células e tecidos podem ser purificados e isolados por
meio de uma técnica chamada fracionamento celular. Este é um processo físico pelo qual é
usada força centrífuga para separar organelas e componentes celulares em função de seus
coeficientes de sedimentação. O coeficiente de sedimentação de uma partícula depende de
seu tamanho, forma, densidade e viscosidade do meio em que está suspensa (Fig. 1.14). As
organelas e moléculas obtidas por estas técnicas podem ser analisadas ao microscópio
eletrônico para se verificar sua pureza (Fig. 1.15) e sua composição química, e funções podem
ser estudadas in vitro.