Aula 3 - Métodos de Calibração - parte 2

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 Uma curva analítica padrão possui o seguinte perfil: 
Métodos de Calibração e Validação 
 Para saber qual pode ser o primeiro ponto (ou nível de 
concentração) da curva, bem como o último ponto, deve-
se levar em consideração os LIMITES DE 
QUANTIFICAÇÃO e a LINEARIDADE, respectivamente. 
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 Ao realizarmos qualquer medida instrumental, devemos ter 
em mente os seguintes questionamentos. 
Métodos de Calibração e Validação 
 Para refletirmos sobre esses questionamentos, devemos 
levar em consideração os CUSTOS, LIMITES DE DETECÇÃO E 
QUANTIFICAÇÃO, SENSIBILIDADE, SELETIVIDADE, 
ROBUSTES, PRECISÃO e EXATIDÃO. 
 A técnica instrumental é a mais indicada para a 
realização da análise a ser realizada? 
 A técnica instrumental possui sensibilidade suficiente 
para a análise do analito de interesse? 
 As análises são reprodutíveis e também são confiáveis? 
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Métodos de Calibração e Validação 
 Limite de Detecção LD ou Cm 
 Concentração ou massa mínima de um analito que 
pode ser detectado em um nível confiável. 
 Limite de Quantificação (LQ) 
 Menor concentração, ou massa, que é medida com um 
nível aceitável de confiança. 
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Métodos de Calibração e Validação 
 Em ambos: 
 S = Desvio-padrão da concentração  m = Inclinação 
 X = Média da concentração  t = t de Student 
 Obtenção dos Limites de Detecção e 
Quantificação 
 Prepara-se 7 a 10 brancos e realizam-se as medidas 
(leituras). 
 Cabe ressaltar que as medidas devem ser 
realizadas frente a uma curva analítica. 
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  Exemplo: 
 Calcule LD e LQ para as medidas realizadas em um 
amperímetro, segundo os dados abaixo, sabendo que o 
coeficiente angular da curva (inclinação) é 0,229 nA/µM. 
Bco Sinal nA/µM 
1 1,3 
2 1,7 
3 1,6 
4 1,2 
5 1,0 
6 1,2 
7 1,4 
8 1,6 
9 1,8 
10 1,7 
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Métodos de Calibração e Validação 
 Faixa de concentração do analito em que a resposta é 
proporcional ao sinal analítico. 
 Faixa Linear 
 Assim, ao aumentar ou diminuir a concentração “n” vezes, 
obtém-se um sinal “n” vezes maior ou menor. 
 A recíproca é verdadeira: assim, ao aumentar ou diminuir 
o sinal “n” vezes, obtém-se uma concentração “n” vezes 
maior ou menor. 
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Métodos de Calibração e Validação 
 É também chamado de FAIXA ÓTIMA DE TRABALHO 
(FOT). 
 Faixa Linear de Trabalho (FLT) 
 Faixa que se estende de LQ até o LIMITE DE RESPOSTA 
LINEAR (LRL). 
 Intervalo de concentração que vai de LQ até a 
concentração mensurável. 
 Faixa Dinâmica 
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Métodos de Calibração e Validação 
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 Método do Padrão Externo 
Métodos de Calibração e Validação 
Padrão  Concentração conhecida. 
 S1  S2  S3  S4  S5 
 V1 
 V2  V3 
 V5 
 V4 
 Y = aX + b 
 Adição de quantidades crescentes do Padrão. 
 Ajuste do volume com o BRANCO ANALÍTICO ou MATRIZ. 
 Em alguns casos, pode-se completar com água: CURVA 
AQUOSA. 
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 Método do Padrão Externo 
Métodos de Calibração e Validação 
 O método do Padrão Externo possui algumas limitações 
que devem ser observadas e trabalhadas. 
 A primeira limitação é a possibilidade de interferência da 
Matriz. Na existência de interferência causada por matriz, 
deve-se empregar o MÉTODO DE ADIÇÃO-PADRÃO. 
 A segunda limitação é a possibilidade de perda do analito 
no decorrer da análise. Na existência de perda do analito no 
decorrer da análise, deve-se empregar o MÉTODO DE 
PADRONIZAÇÃO INTERNA. 
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 Método de Adição Padrão – Método Gráfico 
Métodos de Calibração e Validação 
 O padrão é adicionado em quantidades crescentes (assim 
como no método do padrão-externo). Entretanto, a adição do 
padrão acontece sobre um volume conhecido de solução da 
amostra (mesmo volume e todos os balões). 
 Este método é empregado quando a matriz da amostra é 
muito complexa e difícil de ser reproduzida. 
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 Método de Adição Padrão – Método Gráfico 
Métodos de Calibração e Validação 
Padrão  Concentração conhecida. 
 S1  S2  S3  S4  S5 
 V1 
 V2  V3 
 V5 
 V4 
 Cada balão possui uma 
quantidade de amostra. Esta 
quantidade deve ser a mesma em 
cada balão. 
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 Método de Adição Padrão – Método Gráfico 
Métodos de Calibração e Validação 
 A concentração é calculada pela extrapolação da curva, 
mantendo Y = 0, e considerando o valor em módulo. 
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 Método de Adição Padrão – Método Gráfico 
Métodos de Calibração e Validação 
 Ex 1: Calcule a concentração da espécie de interesse, 
considerando-se a curva abaixo: 
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 Ex 2: Considere os dados de uma análise por 
espectrofotometria UV-VIS, na qual foram preparadas as 
seguintes soluções, em meio do analito. Determine a 
concentração do analito. 
X (mol/L) ABS 
0 0,2 
1 0,4 
2 0,6 
3 0,8 
4 1 
5 1,2 
6 1,4 
y = 0,2x + 0,2 
R² = 1 
0 
0,2 
0,4 
0,6 
0,8 
1 
1,2 
1,4 
1,6 
-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 
A
B
S
 
Concentração - mol/L 
Curvas de adição padrão 
ABS 
 1,0 M 
 Método de Adição Padrão – Método Gráfico 
Métodos de Calibração e Validação 
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 Ex. 3: 50,0 mL da amostra de suco, avaliado 
anteriormente, produziu uma corrente de 1,78 µA. Analise 
os dados abaixo, gerados pela adição dos respectivos 
volumes de vit. C 0,279 mol/L. 
Vol. Vit. C 
(mL) 
Sinal 
(µA) 
0 1,78 
0,050 2,00 
0,250 2,81 
0,400 3,35 
0,550 3,88 
0,700 4,37 
0,850 4,86 
1,000 5,33 
1,150 5,82 
[Vit.C] 
(mM) 
Sinal 
(µA) 
1,78 
2,00 
2,81 
3,35 
3,88 
4,37 
4,86 
5,33 
5,82 
 Método de Adição Padrão – Método Gráfico 
Métodos de Calibração e Validação 
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[Vit.C] 
(mM) 
Sinal 
(µA) 
0 1,78 
0,28 2,00 
1,39 2,81 
2,21 3,35 
3,04 3,88 
3,85 4,37 
4,66 4,86 
5,471 5,33 
6,273 5,82 
 ~2,9 mM 
 Método de Adição Padrão – Método Gráfico 
Métodos de Calibração e Validação 
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 Método de Adição Padrão – Método Gráfico 
Métodos de Calibração e Validação 
 A frequência analítica e a simplicidade do método é 
consideravelmente maior ao se trabalhar com uma curva 
aquosa (Água ou Branco Analítico). 
 Entretanto, faz-se necessário empregar o método de 
adição-padrão quando a matriz interfere na análise. 
 Neste sentido, torna-se necessário verificar se HÁ ou NÃO 
a interferência de matriz. Esta avaliação do efeito de matriz 
pode ser conduzida pela comparação das inclinações de duas 
curvas: uma em meio aquoso (água ou branco) e a outra em 
meio à matriz. 
 Considere os exemplos a seguir, referente a determinação 
de Cd em sangue e determinação de Ca em urina. 
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Avaliação de Efeito de Matriz 
Aquosa 
Conc. Cd ABS 
0 0.05 
1 0.15 
2 0.299 
3 0.451 
4 0.602 
5 0.748 
Sangue 
Conc. Cd ABS 
0 0.15 
1 0.25 
2 0.399 
3 0.551 
4 0.702 
5 0.848 
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Avaliação de Efeito de Matriz 
 Observe que as curvas apresentam a mesma inclinação, ou 
seja, são paralelas. Neste sentido, pode-se concluir que NÃO 
há efeito de matriz. 
 Uma vez que não há efeito de matriz, pode-se realizar a 
análise em meio aquoso (água ou branco). 
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Avaliação de Efeito de Matriz 
AquosaConc.Ca ABS 
0 0.05 
1 0.15 
2 0.299 
3 0.451 
4 0.602 
5 0.748 
Urina 
Conc.Ca ABS 
0 0.25 
1 0.45 
2 0.699 
3 0.951 
4 1.302 
5 1.548 
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Avaliação de Efeito de Matriz 
 Observe que as curvas não apresentam a mesma 
inclinação, ou seja, não são paralelas. Neste sentido, pode-se 
concluir que HÁ efeito de matriz. 
 Uma vez que há efeito de matriz, a análise não pode ser 
realizada em meio aquoso (água ou branco), e sim em meio a 
matriz. 
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 Método de Adição Padrão – Método Não Gráfico 
Métodos de Calibração e Validação 
 Observamos que o método gráfico de adição-padrão é 
empregado quando há uma interferência causada pela 
matriz. 
 Entretanto, este método é inviável quando a quantidade 
de amostra disponível não for suficientemente grande para 
a realização da análise. 
 Neste caso, emprega-se o método não gráfico de 
adição-padrão. 
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(Prova aplicada no 1º semestre de 2016) Foi solicitado a um 
analista que determinasse Cr (elemento refratário) e Pb (elemento 
não refratário) por F AAS em uma amostra de siris azuis para 
verificação de contaminação. O analista realizou os seguintes 
procedimentos: digeriu 0,5 g de amostra de siris em um béquer, 
empregando 5,0 mL de HNO3 concentrado e aquecimento a 125 
ºC. Após a digestão, o volume da solução foi ajustado em 25 mL 
com água deionizada. Somente para a determinação do Cr, 2,0 mL 
da solução resultante foram transferidos para um balão de 250 mL 
e o volume foi ajustado com água deionizada. Os procedimentos 
foram realizados em triplicata, bem como para a obtenção de um 
branco analítico. De acordo com os dados abaixo, faça o que se 
pede. OBSERVAÇÃO: ppm = mg/L = µg/mL. 
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a) Determine a concentração (em µg/g) de Cr na amostra. 
Expresse a resposta com duas casas decimais. 
b) Determine o teor (em %) de Pb na amostra. 
Expresse a resposta com uma casa decimal . 
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(Prova aplicada no 2º semestre de 2014) Foi solicitado a um 
estudante do curso de farmácia da UFSJ/CCO, que determinasse 
Cr e Pb em uma amostra de alimento verduras colhidas próximo a 
um rio contaminado. O estudante realizou os seguintes 
procedimentos: digeriu 250,0 mg de amostra de verduras em um 
forno de micro-ondas, empregando 3,0 mL de HNO3 50% v/v e 1,0 
mL de H2O2. Após a digestão, o volume da solução foi ajustado em 
10 mL com água deionizada. Em seguida, o estudante transferiu, 
quantitativamente, 2,5 mL da solução para um frasco de 25 mL e 
ajustou o volume com água deionizada. Este procedimento foi 
realizado em triplicata, bem como para a obtenção de um branco 
analítico. De acordo com os dados abaixo, faça o que se pede: 
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a) Determine a concentração (em µg/g) de Cr na amostra. 
b) Determine o teor (em %) de Pb na amostra. 
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Métodos de Calibração e Validação 
Padrão 
 Sinal 1: 
 Método de Adição Padrão – Método Não Gráfico 
 Referente à amostra. 
 Concentração conhecida. 
 Volume conhecido. 
 Sinal 2:  Referente à amostra 
+ padrão. 
Amostra 
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Métodos de Calibração e Validação 
Padrão 
 Sinal 1: IX 
 Método de Adição Padrão – Método Não Gráfico 
 [S]inicial 
 Volume conhecido: V0. 
 Sinal 2: IX+S 
 [S]f e Vf 
Amostra 
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Métodos de Calibração e Validação 
 Método de Adição Padrão – Método Não Gráfico 
 Ex 1: Determine a concentração de Fármaco no 
medicamento. 
 IX = 0,150 mV 
 Medicamento 
Padrão 
 [S] = 0,05 M 
 500 µL 
 IX+S = 0,345 mV 
 Balão de 5,0 mL 
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 Ex 2: A vitamina C (ácido ascórbico) presente em 50,0 ml 
de uma amostra de laranja foi analisada por um método 
eletroquímico que produziu uma corrente de 1,78 µA no 
detector. A adição de 0,400 mL de um padrão de ácido 
ascórbico 0,279 M elevou a corrente para 3,35 µA. Qual é a 
concentração de vitamina C no suco de laranja? (Adaptado 
de Harris). 
 EXERCÍCIO: 
 Encontre a concentração de vitamina C no suco, se a 
adição-padrão tivesse produzido uma corrente de 2,50 
µA em vez de 3,35 µA. Resposta: 5,37 nM. 
Métodos de Calibração e Validação 
 Método de Adição Padrão – Método Não Gráfico 
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 Método de Adição Padrão – Método Não Gráfico 
Ex 3: Uma amostra desconhecida de Cu2+ apresentou uma 
absorvância de 0,262 em uma análise de absorção atômica. 
Então, 1,00 ml de uma solução contendo 100,0 ppm (= µg/mL) 
de Cu²+ foi misturada com 95,0 mL da amostra desconhecida, 
e a mistura foi diluída a 100,0 mL em um balão volumétrico. A 
absorvância da nova solução foi de 0,500. Determine [Cu²+] na 
amostra desconhecida. (Resp. 1,04 ppm). 
Ex 4: Uma amostra desconhecida de Ni²+ fornece uma corrente 
de 2,36 µA em uma análise eletroquímica. Quando 0,500 mL de 
solução de Ni²+ 0,0287 M são adicionados a 25,0 ml da amostra 
desconhecida, a corrente aumenta para 3,79 µA. Encontre [Ni²+] 
na amostra desconhecida. (Resp. 8,986 x 10-4 M). 
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 Método do Padrão Interno 
Métodos de Calibração e Validação 
 Sabe-se que o método de adição padrão deve ser 
empregado em situações em que a matriz interfere na 
análise. 
 Entretanto, existem situações que a resposta analítica é 
comprometida, mas não em função da interferência da 
matriz, mas por motivos difíceis de se controlar, tal como a 
perda por volatilização. 
 Neste sentido, deve-se empregar o MÉTODO DO PADRÃO 
INTERNO (PI). 
 É uma quantidade conhecida de um composto, diferente 
do analito, mas que possui propriedades semelhantes, que 
é adicionada à amostra desconhecida. 
 Padrão Interno (PI) 
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 Método do Padrão Interno 
Padrão 
 Sinal 1:  Referente ao analito (S). 
 Volumes conhecidos. 
 Padrão + PI 
 Sinal 2:  Referente ao PI (AS). 
 Ambos de concentração conhecida. 
 Sinal 1:  Referente ao analito (X). 
 Sinal 2:  Referente ao PI (AX). 
PI 
 Fator de Resposta 
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 Em um experimento cromatográfico, uma solução 
contendo 0,0837 mol/L de uma espécie X e 0,0666 mol/L de 
PI fornece picos com áreas 423 e 347, respectivamente. 
Para analisar uma amostra desconhecida, 10,0 mL de uma 
solução 0,146 mol/L de PI foram adicionados a 10,0 mL da 
solução contendo a espécie de interesse e a mistura foi 
diluída a 25 mL em um balão volumétrico. Esta mistura 
forneceu um cromatograma com picos de áreas Ax = 553 e 
As = 582. 
 
 Determine a concentração de X na amostra. (Adaptado 
do Harris). 
 Método do Padrão Interno 
Métodos de Calibração e Validação 
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 TESTE 
 Uma solução 0,0837 mol/L de X e 0,0500 mol/L de S 
forneceu áreas Ax = 423 e As = 372. Então, 10,0 mL de uma 
solução 0,050 mol/L de S mais 10,0 mL da solução inicial 
foram diluídos a 25,0 mL. O cromatograma apresenta áreas 
Ax = 553 e As = 586. 
 
 Determine a concentração de X na amostra. (Adaptado 
do Harris). Resposta: 1,725 mol/L. 
 Método do Padrão Interno 
Métodos de Calibração e Validação 
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 Método do Padrão Interno 
Ex 1: Uma solução contendo X a 3,47 mM (analito) e S a 1,72 
mM (padrão interno) apresentou, em uma análise 
cromatográfica, picos de área igual a 3473 e 10.222, 
respectivamente. Então, 1,00 mL de uma solução 8,47 mM de 
S foi adicionado a 5,00 mL da amostra desconhecida de X, e a 
mistura foi diluída a 10,0 mL. Essa solução apresentou picosde área igual a 5428 e 4431 para X e S, respectivamente. 
Determine a concentração de X na amostra original. (Resp. 
12,36 mM). 
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 Capacidade de distinguir o analito de outras espécies 
presentes na amostra. 
 Seletividade 
Parâmetros de Mérito 
 É a capacidade de responder de forma confiável e 
mensurável às variações de concentração do analito. 
 Sensibilidade 
 O método deve apresentar LQ MENOR que as 
concentrações a serem medidas. 
 Em uma curva de calibração, a sensibilidade é a 
Inclinação da Curva (m). 
 Quanto MAIOR a inclinação, MAIOR será a 
sensibilidade. 
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Parâmetros de Mérito 
 É o quociente da inclinação da curva pelo desvio-padrão 
da medida (que pode ser de uma única concentração, ou de 
várias concentrações). 
 Sensibilidade Analítica 
 Inclinação da curva. 
 Desvio-padrão da medida. 
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Parâmetros de Mérito 
 Os seguintes resultados de absorção atômica foram 
obtidos para a determinação de Zn em um comprimido de 
multivitaminas. Todos os valores de absorbância foram 
corrigidos por um branco apropriado (CZn = 0,0 ng/mL). O 
valor médio para o branco foi 0,000 com um desvio padrão 
de 0,0047 unidades de absorção. Faça as seguintes 
determinações. (Adaptado do Skoog – exercício 8.23). 
CZn (ng/mL) A 
5 0,0519 
5 0,0463 
5 0,0485 
10 0,0980 
10 0,1033 
10 0,0925 
Amostra Comprimido 0,0672 
Amostra Comprimido 0,0614 
Amostra Comprimido 0,0661 
 a) Sensibilidade 
de calibração 
 b) Sensibilidade 
Analítica 
 c) LD e LQ 
 d) CVZn na amostra 
 e) µ(95%) 
41 
Valores do Teste t de Student 
Nível de Confiança 
GL 50 90 95 99 
1 1,000 6,314 12,706 63,656 
2 0,816 2,920 4,303 9,925 
3 0,765 2,353 3,182 5,841 
4 0,741 2,132 2,776 4,604 
5 0,727 2,015 2,571 4,032 
6 0,718 1,943 2,447 3,707 
7 0,711 1,895 2,365 3,500 
T
e
s
te
 t
 d
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 S
tu
d
e
n
t