Microbio - ED - Biofilmes e Cryptococcus (2)

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO 
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO 
RCG 0245 – MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
ESTUDO DIRIGIDO – BIOFILMES E CRYPTOCOCCUS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Gabriel Coura Dias - Nº USP:11280331 
Giovanna Marina Fernandes Marini - Nº USP: 11352790 
Joara Adão de Oliveira - Nº USP: 11373136 
Luana Queiroz Ferreira - Nº USP: 10273911 
Nicole Merino Carneiro - Nº USP: 10312296 
Pedro Pereira Prado Bagnola - Nº USP: 11300433 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ribeirão Preto 
Julho, 2020 
 
Em relação aos biofilmes de Candida albicans. 
 
1. Quais são os grupos de genes expressos diferencialmente nas células em cada 
etapa da formação dos filmes? Explique o possível papel desses produtos 
gênicos na formação e manutenção dos biofilmes. 
 
Os biofilmes são desenvolvidos em quatro etapas, a partir das quais, gradualmente, 
aumenta-se a população de hifas e a resistência a medicamentos antifúngicos, devido a 
mudanças na expressão gênica que ocorrem nas células do Candida albicans. 
Na fase de aderência, a primeira etapa, as leveduras passam a expressar o gene EAP1, 
cujos produtos levam à formação de proteínas de parede celular, as quais, ao formarem 
pontes GPI, aumentam a adesão entre as células. Além disso, essas proteínas também 
contribuem para a maior adesão das células ao substrato (como superfícies de cateteres 
e outros dispositivos médicos). 
Em seguida, na etapa de iniciação, tem-se o início da formação das hifas. A ativação do 
gene BCR1 produz o fator de transcrição Bcr1, que estimula a expressão de uma série 
de genes, tais como ALS1, ALS3 e HWP1. As proteínas resultantes da expressão desses 
genes são componentes da parede celular das hifas, contribuindo para a maior aderência 
célula-célula e célula-substrato. Cabe aqui ressaltar que o gene ALS1 é também 
expresso em leveduras, e, desse modo, favorece a aderência inicial. Outro fator de 
transcrição ativado nessa etapa é o ACE2, que faz com que mais genes relacionados a 
proteínas de adesão sejam expressos, tais como SUN41 e PGA2. 
Na próxima etapa, de maturação, as células que compõem o biofilme produzem matriz 
extracelular, assegura ao biofilme alta resistência à ação de fármacos antifúngicos. A 
produção de matriz é regulada pelo fator de transcrição ZAP1, cujo efeito é inibitório 
sob os genes GCA1, GCA2 e ADH5 (produtos estimulam a produção de matriz) e 
excitatório sobre CSH1 e IFD6 (produtos inibem a produção de matriz). O mesmo fator 
de transcrição também regula a produção de ergosterol, um dos componentes lipídicos 
da membrana plasmática dos fungos, alvo de diversos fármacos. Outros genes 
importantes são expressos nessa fase, tais como FKS1 (estimula a síntese de β-1,3-
glucano), GCA1 e GCA2 (o produto de ambos realiza a hidrólise de cadeias longas de 
glucano presentes na parede celular fúngica, liberando fragmentos solúveis de β-1,3-
glucano na matriz extracelular). Esse polissacarídeo, por sua vez, propicia grande 
resistência aos azóis, uma das classes de medicamentos antifúngicos, juntamente com os 
produtos dos genes CDR1, CDR2 e MDR1, que funcionam como bombas de efluxo de 
drogas. 
Por fim, na fase de dispersão, novas células (predominantemente leveduras) 
desprendem-se do biofilme e alcançam a circulação sanguínea. A expressão dos genes 
PES1 e NRG1 aumentam a liberação dessas células para o meio, enquanto que o fator 
de transcrição UME6 diminui tal liberação. A partir dessa etapa, o fungo pode dar início 
à formação de novos biofilmes ou se instalar em outros tecidos do organismo. 
 
 
2. Baseado no conhecimento disponível em biologia molecular apresente uma 
estratégia para desenvolvimento de fármacos para prevenção e/ou tratamento 
de biofilmes. 
Os biofilmes são formados pela deposição e adesão de microrganismos em uma 
superfície de contato, formando uma matriz de exopolissacarídeos onde iniciam seu 
crescimento. Os biofilmes de Candida albicans cultivados in vitro geralmente têm uma 
fundação de células de levedura, das quais emana uma camada de hifa. A formação do 
biofilme começa com a aderência das células de levedura a um substrato (etapa de 
aderência). Logo depois, as células de levedura proliferam através da superfície e 
produzem projeções alongadas que crescem em formas filamentosas, incluindo hifas ou 
pseudo-hifas (etapa de iniciação). A matriz extracelular se acumula à medida que o 
biofilme amadurece e também é adquirida resistência a medicamentos de alto nível 
(etapa de maturação). Finalmente, células de levedura não aderentes são liberadas do 
biofilme para o meio circundante (passo de dispersão). 
Uma estratégia para o desenvolvimento de fármacos para a prevenção da formação de 
biofilmes de Candida albicans é o impedimento da etapa de adesão dos fungos na 
superfície de tecidos ou de dispositivos médicos implantados. Uma possibilidade seria 
um fármaco agir de forma que não ocorra a ligação da Eap1 (proteína de superfície da 
Candida albicans) com a superfície de tecidos ou de dispositivos médicos implantados. 
A Eap1 é uma das adesinas de biofilme mais claramente definidas que medeia a ligação 
com a superfície. A análise da sequência da Eap1 mostra que ela possui características 
de sequência comumente encontradas entre as proteínas de superfície das células 
fúngicas e também possui uma curta sequência C-terminal que direciona ligações em 
forma de uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI). Sabe-se que a Eap1 é uma 
adesina de C. albicans que media a adesão das células desse fungo ao poliestireno e a 
células epiteliais. 
Tendo em vista a importância da proteína Eap1 da C. albicans na adesão desse fungo na 
superfície de tecidos ou de dispositivos médicos implantados, tem-se como uma 
estratégia para o desenvolvimento de um fármaco para a prevenção da formação de 
biofilmes é a produção de um fármaco que se liga ao Eap1, por exemplo, por meio da 
GPI, para evitar que essa proteína cause a adesão da C. albicans com superfícies de 
tecidos ou de dispositivos médicos implantados. 
Já para se pensar em uma estratégia para o desenvolvimento de fármacos para o 
tratamento de biofilmes, é importante que o fármaco além de uma ação inibitória, que 
impeça o aparecimento de novos biofilmes, possua uma ação fungicida, capaz de 
combater e matar os biofilmes já existentes. Uma forma de se fazer isso seria o 
desenvolvimento de um fármaco baseado em um composto molecular capaz de impedir 
a síntese de proteínas como a Sun41 e a Pga10 que são proteínas essenciais para a 
manutenção da estrutura da parede celular da Candida albicans, assim, com a síntese 
dessas proteínas inibida, ocorreria uma falha geral na parece celular do fungo, o que o 
acabaria levando suas células à morte. 
Além disso, outra possibilidade seria um composto capaz de impedir a síntese da 
proteína FKS1, uma proteína essencial para a biossíntese dos β-1,3-glucanos, que são 
importantes componentes da matriz extracelular da Candida albicans, de modo que ao 
atrapalharem sua biossíntese o biofilme acabe perdendo sua resistência a outros 
fármacos antifúngicos, como, por exemplo, os azóis, que sem a interferência da 
resistente parede celular são capazes de se ligarem aos ergosteróis da membrana celular 
dos fungos, de modo a acabar os eliminando. 
Em relação ao Cryptococcus, 
 
1. O Criptococcus spp e outros patógenos oportunistas permanecem 
exclusivamente no ambiente, porém possuem fatores de virulência altamente 
específicos. Como você explica essa contradição aparente? 
 
De acordo com o artigo “Cryptococcus: from environmental saprophyte to global 
pathogen” por May et al. doi:10.1038/nrmicro.2015.6, os específicos fatores de 
virulência aos seres humanos observados conjuntamente à grande presença do fungo no 
meio ambiente podem ser explicados pela hipótese da patogênese acidental. 
A hipótese propõe que a patogênese do Cryptococcus não é resultado direto da seleçãoassociada aos organismos humanos, mas sim da evolução de traços em resposta às 
pressões seletivas de ambos nichos ambiental e animal, que, coincidentemente, 
permitiram vantagens ao estabelecimento da virulência em mamíferos. 
Fatores de virulência como a complexa cápsula polissacarídea, a atividade da enzima 
lacase ou a habilidade de sintetizar melanina, são também mecanismos que garantem a 
proteção do fungo a pressões ambientais, como a extrema desidratação ou a exposição 
aos raios ultravioleta, bem como permitem a colonização de plantas hospedeiras. 
Adicionalmente, o Cryptococcus pode se reproduzir não somente no interior de 
fagócitos de animais vertebrados como também no interior de protozoários rizópodes: 
apesar da enorme diferença evolutiva entre vertebrados e amebas, muitos mecanismos 
utilizados pelos fagócitos para a eliminação de patógenos são idênticos a mecanismos 
utilizados pelos amebóides para digerir suas presas, como a produção de espécies 
reativas de oxigênio e a secreção de enzimas microbicidas. Desse modo, ao longo da 
evolução, tais características selecionadas, que permitiram o crescimento e 
sobrevivência do fungo em hospedeiros sarcodíneos, permitiram também a sua 
adaptação à sobrevivência no interior de fagócitos. Tais estratégias incluem não apenas 
mecanismos de tolerância ao estresse, como a resistência às ROS, mas também 
mecanismos que regulam a sua expulsão do interior de células hospedeiras. 
Adicionalmente, o Cryptococcus spp. possui a habilidade de perturbar a imunidade 
adaptativa, impossibilitando a sua completa eliminação pelo sistema imune do 
hospedeiro, o que resulta em infecções latentes. Ainda segundo o artigo, possivelmente, 
essa habilidade de permanecer latente sem instigar as defesas naturais dos organismos 
os quais parasitam é a evidência mais concreta de uma adaptação à virulência aos 
organismos vertebrados, pois são apenas esses que possuem sistemas imunes 
adaptativos. Provavelmente, o fungo evoluiu tais propriedades em resposta às pressões 
de seleção de hospedeiros répteis, aves ou mamíferos, associados ao meio ambiente, o 
que também explica a diversa gama de animais susceptíveis à criptococose. 
 
Referências: 
1. Finkel JS, Mitchell AP. Genetic control of Candida albicans biofilm 
development. Nat Rev Microbiol. 2011 Feb;9(2):109-18. doi: 
10.1038/nrmicro2475. Epub 2010 Dec 29. PMID: 21189476; PMCID: 
PMC3891587. 
2. MAY, Robin C.; STONE, Neil R.h.; WIESNER, Darin L.; BICANIC, Tihana; 
NIELSEN, Kirsten. Cryptococcus: from environmental saprophyte to global 
pathogen. Nature Reviews Microbiology, [s.l.], v. 14, n. 2, p. 106-117, 21 dez. 
2015. Springer Science and Business Media LLC. 
http://dx.doi.org/10.1038/nrmicro.2015.6. 
http://dx.doi.org/10.1038/nrmicro.2015.6