Fibrose Cística

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Composição do Muco e Fibrose Cística
Liz Schettini e Nathália Oliveira
Bioquímica
 Nós temos algumas proteínas que compõe o sistema de defesa do sistema respiratório principalmente, todas são de alguma classe específica de proteínas – proteínas plasmáticas, mais de 300 identificadas relacionadas à defesa do organismo, como a lactoferrina, sistema complemento, surfactante (não é uma proteína e sim uma associação de lipídeos), fibronectina, alfa-antitripsina, lisozimas, imunoglobulinas A e G etc
 Quando falamos de proteínas plasmáticas, que são as proteínas que têm funcionalidade plásmica, elas são divididas em albumina (60% DO TOTAL) e temos as globulinas/globinas (40% DO TOTAL) esse conjunto compõe o exame de proteínas totais e frações, que é um exame simples de dosagens bioquímicas. As globulinas têm cadeias diferentes (alfa, beta e gama globulinas) como as imunoglobulinas, etc. Dentre as globulinas, nós temos proteínas de fase aguda e fase crônica da doença inflamatória. Elas compõem o mecanismo de defesa do nosso organismo e é importante que elas estejam em equilíbrio, tanto em equilíbrio de proporção quanto equilíbrio de quantidade total secretada. 
 Então temos a relação das proteínas e a relação de eletrólitos que vão garantir o movimento mucociliar, importante para manter a limpeza e mecanismo de defesa em todo o trato respiratório. Tanto a umidade quanto a camada de muco (composta por proteínas e eletrólitos) têm que manter um equilíbrio osmótico e eletrolítico (equilíbrio da produção proteica e de eletrólitos) para que esse movimento de “chicotada” seja eficiente, para garantir a limpeza e umidificação de todo o trato. Em baixo dos cílios temos as células caliciformes e ductos produtores de imunoglobulinas (de cadeia alfa nesse caso) e muco. 
 Eletroforese de proteínas -> As cadeias vão se organizar dessa forma: a albumina, tem maior peso molecular e representa a maior concentração (quem “corre” mais na eletroforese é quem tem o maior peso molecular) depois temos a cadeia alfa (alfa-1 e alfa-2), depois a beta e depois a gama. A eletroforese é um exame bioquímico que separa essas cadeias de proteínas (albumina e globulina) por peso molecular, dando uma relação de proporção das proteínas daquele paciente. Nesse exame nós conseguimos identificar as cadeias, para identificar as proteínas especificamente se faz reações imunológicas antígeno-anticorpo. A eletroforese é feita através da aplicação dessas proteínas em um gel, que é aniônico e catiônico (ou seja, que pode migrar qualquer tipo de íons, proporcionando com que a única interferência no exame seja pelo peso molecular), que é então mergulhado numa cuba que tem polo positivo e negativo, e então haverá a migração dessas proteínas e será interpretada em gráficos depois. 
 A partir da eletroforese você pode usar o gel para fazer outras análises de proteínas, como por-exemplo para separar o RNA no exame de Northen Blot, ou, nos dando moléculas de DNA que estão relacionadas a expressão daquela proteína pelo Southern Blot, e a análise da própria proteína presente, que é feita pelo Western Blot. Qualquer doença que você queira identificar RNA, DNA ou proteína, essa é a técnica utilizada. O gráfico é a interpretação, no resultado saem essas bandas, e então vai-se comparando com o fracionamento normal (a amostra controle”). Os géis comuns são poliacrilamida e agarose
 A alfa-1-antitripsina tem uma relação de defesa com o sistema respiratório. Na beta temos as proteínas do sistema complemento, que são todas as proteínas de opsonização que desencadeiam a resposta celular e humoral. As gama são as imunoglobulinas, que são proteínas de fase mais tardia e que têm relação com a resposta humoral, relação de síntese prolongada tanto em resposta iniciada na fase aguda como também iniciada na fase crônica. 
 Algumas proteínas relacionadas com o caso, de acordo as regiões da eletroforese:
· Região ALFA-1 –> Antitripsina: globulina de cadeia alfa que faz a proteção na parede dos alvéolos contra as proteases (enzimas) provenientes dos grânulos dos neutrófilos. Proteção contra a destruição da parede alveolar. É uma proteína relacionada à doenças que fazem estreitamento das vias aéreas, como asma e enfisema (quando há depleção de Antitripsina). Na ELETROFORESE haveria cadeia alfa transparente ou ausente. São importantes porque toda vez que temos uma resposta neutrofílica, os neutrófilos degranulam e liberam proteases que vão agir contra o alvéolo, então a antitripsina vai inibir a ação dessas proteases.
· Região BETA-1 –> Complemento: relacionado a resposta humoral. A deficiência na expressão dessas proteínas, resulta em um déficit na resposta contra processos infecciosos, principalmente no sistema respiratório.
· Região BETA-2 –> Fração CIII do complemento: Atua na resposta imunológica humoral.
· Região GAMA –> Imunoglobulinas: são proteínas de 4 cadeias (2 leves e 2 pesadas) sintetizadas pelo sistema imune em resposta a uma partícula estranha. Reconhecem, reagem, neutralizam bactérias, vírus e proteínas estranhas. Elas têm epítopos diferentes ligadores de antígenos. É específica. Na extremidade das cadeias leves, há a troca de aminoácidos que é o que faz com que você tenha uma resposta direcionada para um ou para outro antígeno diferente. 
 Exemplo de interpretação de eletroforese -> Na resposta aguda inflamatória vai ter cadeia alfa-2 aumentada, com redução proporcional da albumina, porque sempre que você aumenta uma cadeia, há diminuição proporcional de outra cadeia, em geral a albumina. Na resposta crônica há um aumento das cadeias alfa- 1 e 2, e da Gama, em detrimento da albumina. 
 Existe uma lei chamada lei da eletroneutralidade onde é determinado que existe uma mesma concentração molar de cátions e ânions por compartimento (se eu falo do líquido extracelular, eu tenho em torno de 150 mEq de cátions e 154 mEq de ânions) e isso, junto com o equilíbrio das cadeias de proteínas, mantém o equilíbrio osmótico e eletrolítico dos fluidos. Essa relação é dada por um cátion predominante (sódio) e um ânion predominante (cloreto), que são equivalentes em mols. 
 Outros cátions e ânions também mantém esse equilíbrio, já que por mais próximo que a concentração de sódio e cloreto sejam umas das outras, sempre tem uma pequena diferença, pelo peso molecular diferente. Então se tem 154 mEq/L de cátions, tem que ter o mesmo de ânions. Isso acontece tanto no líquido intra, quanto no meio extracelular. Esse equilíbrio é importante porque podemos, com o desequilíbrio, entrar em acidose ou alcalose respiratória e metabólica. 
 Epitélio ciliar -> As bombas trocadoras de cátions e ânions garantem a eletroneutralidade. Então temos a absorção de água pelo epitélio ciliar, a entrada de sódio se faz por canais específicos (na membrana apical), enquanto que o cloreto faz o transporte paracelular/transcelular (entre as células -> independe de canal), e no lado oposto, na membrana basolateral, temos a Na/K ATPase. Na excreção de fluidos temos o contrário, ou seja, temos uma saída por canais de cloreto (CFTR), enquanto que o sódio sai para o lúmen através do transporte paracelular/trancelular.
 Ela tem uma relação importante para que haja uma fluidificação dessas globulinas que estão sendo produzidas como mecanismo de defesa/controle desse muco. As proteínas precisam ficar fluidas, se tivermos excesso de cátions ou ânions, há o comprometimento hídrico, que normalmente dispersa as proteínas no muco. Quando há uma interferência na saída do cloreto, e um desequilíbrio na lei da eletroneutralidade, há a formação de gradientes osmóticos, que começam a formar agregados proteicos (das proteínas que estavam dispersas), um muco espesso, com pouca água, proteínas vão desnaturando e formando agregados mesmo. 
 Temos um gene anormal (CF) que acarreta em uma proteína (CFTR) expressa de forma ineficiente, e haverá um comprometimento na excreção de sódio acoplado com cloreto, formando um gradiente osmótico desfavorável que favorece a formação de agregados proteicos. E isso impede oClearance mucociliar (que é a limpeza das vias aéreas pelo movimento ciliar) aumentando a susceptibilidade da permanência de agentes pro-inflamatórios e infecciosos. O CFTR controla o movimento do cloreto dentro e fora da célula. É uma proteína de 5 domínios – alguns atravessados na membrana e outros que são funcionais. As vezes existe a expressão da proteína, mas ela não está acoplada à membrana, o que faz com que o canal seja defeituoso também, então podemos ter uma expressão mutante da proteína, ou uma resposta ineficiente quando ela não se acopla à membrana. O tipo de expressão de fibrose cística está relacionada com os domínios.
 OBS.: domínios são a quantidade de dobraduras de uma proteína. Ex.: uma proteína de 7 domínios, significa que é uma proteína que passa 7 vezes pela membrana onde ela está ancorada. O CFTR tem 2 subunidades que têm 7 domínios na membrana, se ele não tiver essa boa ancoragem ele também vai ser ineficiente.
 Nas glândulas exócrinas -> o cloreto entra nas células pelo canal CFTR. Então não haverá a entrada de cloreto nas células do ducto, o cloreto vai estar concentrado na parte do lúmen e, consequentemente, o sódio também não entra nas células caracterizando o suor salgado. É diferente do mecanismo do epitélio ciliar, onde o cloreto fica dentro da célula criando um muco espesso, aqui o cloreto nem entra na célula. O mecanismo de desidratação nas células ciliares é mais intenso do que o mecanismo que mantém o cloreto fora da célula.
 O CFTR faz o transporte de cloreto, e os 5 diferentes domínios, desses, 2 são de ligação com nucleotídeos (intracelulares) citoplasmáticos que hidrolisam o ATP, 2 domínios (MSD1) que são transmembranas (que têm 7 domínios transmembrana) e o domínio R, que vai se abrir e fechar pra permitir a passagem. O CFTR, funciona principalmente como um canal de cloreto, induzido por AMPc, mas parece capaz de regular outros canais iônicos. Além da mutação mais comum, DELTAF508 (é a mais severa), responsável por cerca de 70% dos cromossomos que levam à fibrose cística em todo o mundo, mais de 850 alelos mutantes foram relatados a CF. Estas mutações afetam o CFTR através de uma variedade de mecanismos moleculares que podem produzir pouco ou nenhum CFTR funcional na membrana apical. Por isso é possível que o paciente tenha sintomas somente relacionados às vias aéreas, ou somente às glândulas exócrinas, não necessariamente apresentando todo o quadro patológico.
 OBS.: em bioquímica a palavra domínio pode se referir a quantidade de dobraduras da proteína ou a quantidade de subunidades dela, sendo que uma subunidade pode ter dobraduras, ou seja, um domínio com domínios. 
 Exames: 
 Por ordem de especificidade, o diagnóstico de FC deveria ser por:
1) Achado de duas mutações no gene FC 
2) Dois testes de suor alterado (presença de cloro no suor). Os valores normais é de 5 a 45 mmol/L em crianças (> 60 é diagnóstico diferencial para FC) e em adultos o normal é de 10-70 mmol/L. Este teste envolve a estimulação da produção de suor por iontoforese, o fornecimento indolor de uma pequena quantidade de corrente elétrica para a pele. Os resultados são
3) Achados clínicos – insuficiência pancreática exócrina crônica, história familiar de FC, triagem neonatal (Tripsina imunorreativa TIR -> Antitripsina aumentada).
 Hemograma –> presença de leucocitose com neutrofilia
 D-xilose teste de absorção, soro ou urina –> diminuído: Pentose que não é metabolizada pelo nosso organismo, é absorvida e excretada de forma inalterada na urina (a mesma quantidade ingerida tem que estar presente na urina). O teste é utilizado para distinguir má absorção de má digestão, porque ajuda a avaliar a eficiência de absorção da mucosa. Teste realizado no soro e na urina após administração de 0,5g por kg em crianças. Para FC realizar no soro. Vai sair nas fezes. 
Técnica Gibson-Cooke (teste do suor) ->
1. Lavar e secar o antebraço ou Coxa.
2. Coloque uma pequena quantidade de pilocarpina-embebida sobre a pele da área a ser estudada e anexá-la ao eletrodo positivo. Coloque uma pequena quantidade de gaze embebida em soro fisiológico sobre a pele e anexá-lo ao eletrodo negativo.
3. Aplique 4mA de corrente em intervalos de 15 a 20 segundos por 5 minutos.
4. Coloque a gaze ou papel de filtro esterilizado, seco, pré-pesado sobre o local da gaze de pilocarpina. Cobrir com plástico e selá-lo com Fita impermeável.
5. Após 30-40 minutos, as gotas visíveis sob o plástico indicam um acúmulo adequado de suor. É preferível pelo menos 100 mg de suor.
6. Retire a gaze ou o papel de filtros coloque-o diretamente num frasco de pesagem, feche-o firmemente e envie-o para o laboratório.
É normal que a área estudada permaneça Vermelho por várias horas.