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1 UNIVERSIDADE PARANAENSE - UNIPAR RECONHECIDA PELA PORTARIA - MEC Nº 1580, DE 09/11/93 - D.O.U. 10/11/93 MANTENEDORA ASSOCIAÇÃO PARANAENSE DE ENSINO E CULTURA - APEC UMUARAMA – TOLEDO – GUAÍRA – PARANAVAÍ – CIANORTE – CASCAVEL – FRANCISCO BELTRÃO “MANUAL DE PRÁTICAS LABORATORIAIS DA DISCIPLINA DE PARASITOLOGIA BÁSICA E CLÍNICA” CURSO DE FARMÁCIA 2016 2 01-NORMAS DE BIOSSEGURANÇA EM LABORATÓRIO DE PARASITOLOGIA O padrão para a redução da exposição do trabalhador a patógenos baseia-se na adoção de precauções gerais como um método de controle de infecção: a) devem ser usadas luvas e jaleco quando se manipulam fezes ou outras amostras; b) as mão devem ser lavadas com sabão desinfectante ao entrar no laboratório e após a retirada das luvas; c) as vestes de laboratório jamais devem ser usadas fora dele; d) nada deve ser levado à boca quando se está no laboratório; e) evitar tocar o rosto com as mãos, e não colocar objetos de uso pessoal, como óculos ou livros, sobre a bancada de trabalho; f) deve-se tomar cuidado para deixar toda a área de trabalho limpa e desimpedida. A bancada de trabalho deve ser limpa com desinfetante ou uma solução de hipoclorito a 1% antes e depois do trabalho; g) todos os materiais contaminados devem ser imediatamente colocados em desinfetante ou recipiente adequado para descarte; h) derramamentos devem ser cobertos com desinfetante ou solução de hipoclorito a 1% e toalhas absorventes ou areia. Após 10 minutos, recolher o material contaminado em um saco plástico ou outro recipiente adequado. LUVAS • As luvas são usadas como barreira de proteção prevenindo contra contaminação das mãos ao manipular material contaminado, reduzindo a probabilidade de que microrganismos presentes nas mãos sejam transmitidos durante procedimentos. O uso de luvas não substitui a necessidade da LAVAGEM DAS MÃOS. • Usar luvas de látex SEMPRE que houver CHANCE DE CONTATO com sangue, fluídos do corpo, dejetos, trabalho com microrganismos e animais de laboratório. • Lavar instrumentos, roupas, superfícies de trabalho SEMPRE usando luvas. • NÃO usar luvas fora da área de trabalho, NÃO abrir portas, NÃO atender telefone. JALECO • Os jalecos são usados para fornecer uma barreira de proteção e reduzir a oportunidade de transmissão de microrganismos. Previnem a contaminação das roupas do pessoal, protegendo a pele da exposição a sangue e fluidos corpóreos, salpicos e derramamentos de material infectado. • São de uso constante nos laboratórios. • Devem sempre ser de mangas longas, confeccionados em algodão ou fibra sintética (não inflamável). Uso de jaleco é PERMITIDO somente nas ÁREAS DE TRABALHO. NUNCA EM REFEITÓRIOS, ESCRITÓRIOS, BIBLIOTECAS, ÔNIBUS, ETC. Jalecos NUNCA devem ser colocados no armário onde são guardados objetos pessoais. • Devem ser descontaminados antes de serem lavados. Manuseio de Amostras Tomar sempre muito cuidado ao manusear as amostras laboratoriais, usando sempre luvas de borracha. Amostras de sangue – devem sempre ser consideradas potencialmente infecciosas. Patógenos muito sérios podem ser transmitidos pelo sangue, tais como o vírus da imunodeficiência humana e o vírus da hepatite B, assim é preciso muito cuidado em sua colheita e processamento. São riscos particulares: 1. Cortes e ferimentos agulhas ou lancetas usadas devem ser descartadas em recipiente que possa ser incinerado ou enterrado em recipiente descartável com solução desinfetante não reutilizar lancetas não deixar lancetas e agulhas jogadas sobre as superfícies de trabalho não utilizar como descartes recipientes de vidro que estejam lascados ou estilhaçados, ou de metal que esteja enferrujado 2. Contaminação da pele machucada ou de membranas mucosas: 3 cubra qualquer machucado com curativos impenetráveis evite derrubar sangue na pele ou em membranas mucosas se houver contato da pele com o sangue, lave imediatamente a área afetada com água e sabão se os olhos forem atingidos, lavar imediatamente com grande quantidade de água não pipetar com a boca Amostras de fezes: Amostras de Fezes Evitar o contato com a pele; Após o exame do material colocar a amostra em solução desinfetante e posteriormente recipiente de descarte. Lâminas utilizadas em exames microscópicos Descartar em recipiente com solução de hipoclorito ou em recipiente para descarte se não puder ser limpa para reutilização. descartar as lâminas num recipiente com solução de hipoclorito a 1% 4 02-MICROSCÓPIO O microscópio é usado em muitos setores dos laboratórios clínicos para visualizar estruturas ou células pequenas demais para serem vistas a olho nu. Devido ao fato do microscópio ser um instrumento delicado e caro, cuidados especiais devem ser tomados com o seu uso, limpeza e armazenamento. Partes de um microscópio: Ajuste grosseiro ou macrométrico - o controle que ajusta a posição das objetivas do microscópio; usado para o focar inicialmente o microscópio. Ajuste fino ou micrométrico – o controle que ajusta a posição das objetivas; usado para o foco preciso do objeto depois de ter sido focado com o macrométrico. Ocular - lente de aumento que está mais próxima do olho do examinador. O aumento usual é de 10 vezes (10 x). Objetiva - lente de aumento que está mais próxima do objeto a ser examinado no microscópio. A objetiva pode ser de pequeno aumento (10 x), objetiva de grande aumento (40,43 ou 45 x) e a objetiva de imersão a óleo (95, 97 ou 100 x). Condensador – aparelho localizado abaixo da platina do microscópio que direciona a luz para a objetiva se for baixado ou elevado. Baixando o condensador vai haver um aumento de espécimes não corados. Diafragma – aparelho que regula a quantidade de luz que chega ao espécime examinado no microscópio. Distância de trabalho - é a distância entre a objetiva e a lâmina quando o objeto está em foco bem nítido. Quanto maior o aumento, menor a distância. O macrométrico não deve ser usado quando se usa o maior aumento, para evitar que a objetiva acidentalmente bata na lâmina e esta seja danificada. Precauções Use o ajuste macrométrico somente com objetivas de pequeno aumento. Use o óleo de imersão sempre que usar a lente de imersão. Use o óleo de imersão somente com lente de imersão. Limpe as oculares e objetivas após o uso. Sempre baixar a luz antes de desligar o microscópio. Para carregar o microscópio, segure com uma mão o braço do microscópio e com outra a base. Evite vibrações e batidas no microscópio. Guarde o microscópio coberto com uma capa para protege-lo do pó. 5 6 03-PREPARAÇÃO E EXAME DE AMOSTRAS FECAIS: Exame de fezes: parasitos intestinais Outros materiais: urina, escarro, secreção urogenital, aspirados, tecidos, etc... Estágios usuais de diagnóstico: ovos, larvas de helmintos, cistos, oocistos,trofozoíto de protozoário. Colheita e Preservação = identificação segura e correta de um parasita (morfologia) 1.1.EXAME MACROSCÓPICO *OBS: Exame macroscópico antecede exame microscópico. Material fecal varia quanto a sua consistência e é classificada em: - Fezes formadas. - Semiformadas. - Pastosas. - Líquidas (diarréia). Realização do exame macroscópico: Simples observação Tamização OBS: Poderão ser encontrados helmintos adultos nas amostras fecais e ausência dos ovos. 1.2. EXAME MICROSCÓPICO: Método Direto Técnicas de concentração RESULTADO DO E.P.F.: É qualitativo – deve-se usar “Não foram encontrados cistos, ovos ou larvas de parasitas na amostra analisada ”.1.3.COLHETA DE MATERIAL Fezes emitidas espontaneamente Amostras múltiplas Fezes emitidas através de laxantes: 1.4. . ESTABILIDADE DAS AMOSTRAS 1.5. PRESERVAÇÃO: (amostras fecais não enviadas imediatamente ao laboratório). Temporária Permanente 7 04-EXAME DIRETO 1 – OBJETIVO Finalidade: Método simples e eficiente para exame de fezes, que permite observar trofozoítos vivos dos protozoários e também permite ao microscopista ter uma visão geral do material que será analisado. Várias formas de desenvolvimento dos parasitas, pelo uso de diferentes soluções, podem ser determinadas e identificadas. 2 – METODOLOGIA Materiais: Material fecal salina Bastão de vidro ou palito de madeira Lâmina Lamínula Lugol Microscópio Procedimento: a) Identificar a lâmina com um lápis de cera; b) Colocar uma gota de salina no centro da metade esquerda da lâmina e uma gota de lugol na metade direita da lâmina; c) Com o auxílio de um abaixador de língua ou um palito, peque uma pequena porção da amostra e misture com a gota de solução salina; d) Da mesma forma, misture uma porção de fezes com a solução de lugol; e) Coloque uma lamínula sobre cada uma das gotas, tomando o cuidado para não formar bolhas de ar; 8 f) Percorra todos os campos da lâmina. OBS: Uma boa homogeneização ou diluição permite ler as letras de um jornal colocado por baixo da lâmina 9 05-IDENTIFICAÇÃO DE RESÍDUOS FECAIS 1 - OBJETIVO Identificação de resíduos fecais a fim de diferenciá-los de estágios diagnósticos de parasitas. 2.FUNDAMENTAÇÃO A maioria dos parasitos intestinais é diagnosticada pelo exame de fezes, embora outros materiais como escarro, urina, secreções urogenitais, aspirados, tecidos, conteúdo duodenal e espécimes obtidos por biópsia, possam ser utilizados para identificação de certas espécies. Os estágios usuais de diagnóstico são ovos e larvas de helmintos e trofozoítos, cistos, oocistos e esporos de protozoários. Freqüentemente fragmentos de alimentos, células vegetais, grãos de pólen, leucócitos, células de tecido animal e outros artefatos podem se assemelhar-se a certas espécies de parasitos, desta forma um cuidadoso exame revelará características que determinarão o diagnóstico do parasita. 3 – METODOLOGIA Materiais: Amostra de fezes Lâmina Lamínula Lugol Microscópio Procedimento: Identificar e representar esquematicamente os resíduos fecais presentes na amostra analisada ÁCARO Grãos de pólen 10 Bolha de ar Fibras musculares: mal digerida Leucócitos nas fezes Grãos de pólen, esporos e células vegetais 11 06-Soluções empregadas nas técnicas para diagnóstico das enteroparasitoses 1 - OBJETIVO Preparação de soluções utilizadas na rotina laboratorial do setor de Parasitologia Clínica. 2 – METODOLOGIA Materiais e Procedimento: 2.1. Solução de lugol (corante temporário): Iodo.....................................................................0,5g Iodeto de Potássio................................................ 1g Água destilada q.s.p............................................100mL Colocar o iodeto de potássio no balão de vidro. Acrescentar aproximadamente 20mL de água destilada para dissolvê-lo; adicionar o iodo (triturado na capela) e, após a completa dissolução do iodo - iodeto, juntar o restante de água destilada. Guardar a solução em frasco âmbar 2.2. Solução conservadora de MIF: a) Solução concentrada de Timerosal ( mertiolato) Glicerina.............................................................5 mL Solução de Formaldeído 10%...........................25 mL Tintura de Timerosal ( mertiolato) a 1:1000 .....200mL Agua destilada...................................................250mL Misturar todos os componentes da fórmula. Guardar em frasco âmbar por período não superior a 3 meses. Solução de Formaldeído 10% Solução comercial de formaldeído a 37%..............10mL Água destilada........................................................90mL Meça a solução de formalina em uma proveta graduada e coloque em uma garrafa de 100ml com tampa de vidro ou tampa com rosca. Adicione água destilada e agite. Rotule a garrafa: Formalina 10%. Datar. Esta solução tem um prazo de durabilidade em torno de 2 anos. a) Solução iodada de lugol a 5% Iodo.....................................................................5g Iodeto de Potássio.............................................10g Água destilada q.s.p............................................100mL b) No momento de uso misturar: Solução concentrada de timerosal.......................9,4 mL Solução iodada de lugol a 5%..............................0,6 mL 2.3. Solução fixadora de SAF: Acetato de sódio....................................................1,5g Acido acético glacial..............................................2,9 mL Formol 40%...........................................................4,0 mL Agua destilada......................................................92,5 mL Misturar todos os componentes da fórmula 12 07- PREPARAÇÃO DE LÂMINAS – GOTA ESPESSA E GOTA ESTENDIDA Gota espessa: Colocar em uma lâmina de microscopia 3 a 4 gotas de sangue; Com a ponta de outra lâmina e com movimentos circulares, contínuos, reunir as gotas, criando uma área de aproximadamente 2cm; continuar com os movimentos circulares , do centro para periferia, durante 30 segundos; Deixar secar; Após a secagem mergulhar a preparação rapidamente em água para que ocorra a desemoglobinização; Deixar secar e proceder a coloração. Obs: nos casos de colorações utilizando-se corantes dissolvidos em água não é necessário efetuar hemólise Gota espessa Gota estendida 13 Gota estendida: Colocar uma pequena quantidade de sangue sobre a lâmina próximo a uma de suas extremidades; Com outra lâmina, apoiada sobre a primeira em ângulo de 35º a 45º graus de inclinação, fazer com que o sangue se espalhe por capilaridade por toda superfície de contato; Distender a gota deslocando a segunda lâmina sobre a primeira de modo a afastá-la da posição inicial, até que se esgote o volume de sangue; Secar a preparação agitando a lâmina durante alguns segundos ao ar Fixar e corar. 14 08-TÉCNICAS DE COLORAÇÃO Coloração de Giemsa 1. Fixar a preparação com metanol durante 2 a 3 minutos (esfregaço estendido); 2. Esfregaços espessos não fixar; 3. Cobrir a preparação com corante Giemsa previamente diluído (Giemsa a 5% em tampão de fosfatos pH 7,2); 4. Deixar corar por 30 minutos ( o tempo é variável de acordo com a preparação que se deseja corar); 5. Lavar em água corrente; 6. Deixar secar naturalmente e observar ao microscópio. Coloração de Leishman 1. Sobre a preparação não fixada, colocar 8 a 10 gotas de corante de Leishman gota a gota, cobrindo toda a lâmina; 2. Deixar corar por 1 minuto; 3. Adicionar 15 a 20 gotas de água destilada, homogeneizando soprando-se o corante com a pipeta a fim de fazer com que a mistura de água e corante fique uniforme; 4. Deixar corar por 10 minutos; 5. Lavar a preparação com água corrente; 6. Deixar a lâmina secar à tempertura ambiente e examinar. PREPARAÇÃO DOS CORANTES O corante Giemsa pode ser preparado de duas formas: A) Giemsa em pó............................................................... 3,8g Glicerina ............................................................... 125,0 mL Metanol ( P.A)............................................................... 375,0 mL B) Azur II eosina ................................................................. 3,0g Azur II ................................................................. 0,8g Glicerina ................................................................. 250,0 mL Metanol (P.A) .................................................................. 250,0 mL Adicionar o(s) pó(s) a um almofariz, juntamente com a glicerina. Triturar até a dissolução do(s) pó(s). Deixar em repouso por 24-48 horas. Juntar o metanol. Armazenar a mistura em frasco âmbar bem fechado e filtrar após uma semana ( no mínimo) ou apenas no momento do uso. Guardar em vidro âmbar com tampa esmerilhada, bem fechado, e protegido da luz intensa. 15 SOLUÇÃO TAMPÃO DE FOSFATOS, pH 7,2 Diidrogenofosfato de potássio anidro ........................................0,49g Hidrogenofosfato dissódico diidratado .......................................1,09g Água destilada – deionizada, q.s.p ......................................1.000 mL Dissolver KH2PO4 e Na2HPO4.2H2O em água e misturar bem. Armazenar a solução tampão em frasco de vidro com tampa esmerilhada. GIEMSA A 5% EM TAMPÃO DE FOSFATOS pH 7,2 Giemsa ( concentrado) ..................................... 5 mL solução tampão de fosfatos, pH 7,2 ..................................... 95 mL CORANTE LEISHMAN Eosina- azul – de – metileno, segundo Leishman ................................... 0,15g Álcool metílico...........................................................................................100 mL Agitar o recipiente freqüentemente por três dias, quando estará pronta para o uso. Filtrar a solução. 16 09-Trypanossoma cruzi – Doença de Chagas 1 - OBJETIVO 1.1. Identificar formas evolutivas do parasita: Amastigota, Epimastigota, Tripomastigota 1.2. Reconhecer o material biológico no qual as formas evolutivas estão presentes. 1.3. Selecionar os métodos aplicáveis para o diagnóstico da doença. 2 – METODOLOGIA Materiais: Microscópio Lâminas permanentes das formas: amastigota, , tripomastigota, epimastigota Procedimento: Observação microscópica das lâminas a fim de reconhecer as formas evolutivas presentes com a finalidade de realizar um diagnóstico seguro. Descreva cada forma diagnóstica observada indicando onde são encontradas. _________________ _________________ ________________ 17 10- Exame parasitológico do sangue 1- OBJETIVO 1.1.Realização de procedimentos para o diagnóstico de hemoparasitas: Exame de sangue a fresco, esfregaço espesso e esfregaço estirado. 2.FUNDAMENTAÇÃO a) Exame do sangue a fresco: É o processo mais simples consistindo na pesquisa do parasito a fresco, em sangue periférico, obtido por meio de punção digital ou sangue venoso (com anticoagulante). A gota de sangue é examinada entre lâmina e lamínula. b) Gota espessa: Processo que apresenta sensibilidade um pouco superior ao exame de sangue a fresco. Duas ou três gotas de sangue são depositadas em uma área de 1cm da lâmina que após des- hemoblobinização e coloração pelo método de Giemsa, são examinadas com a objetiva de imersão.. c) Esfregaço: É um processo que não oferece vantagens devido a sua baixa sensibilidade. É indicado para o estudo morfológico dos parasitos para identificação segura da espécie. Giemsa e Leishman são os corantes utilizados nestas preparações. 2 – METODOLOGIA Método direto (T. cruzi ) Colocar uma gota de sangue, obtida por punção de polpa digital ou de sangue venoso colhido com anticoagulante, no centro de uma lâmina, adicionar uma gota de salina e cobrir com lamínula. Examinar exaustivamente ao microscópio em objetiva de (40x). Obs: em face dos pequenos volumes de sangue examinado a cada vez, o método necessita ser repetido várias vezes ao dia ou mesmo em dias consecutivos até que o parasito seja detectado. 18 11-Leishmaniose 1 - OBJETIVO 1.1.Identificar formas evolutivas do parasita: Amastigota, promastigota, paramastigota 1.2. Reconhecer o material biológico no qual as formas evolutivas estão presentes. 1.3. Selecionar o melhor método aplicável para o diagnóstico da doença. 2 – METODOLOGIA Materiais: Microscópio Lâminas permanentes das formas: amastigota, promastigota, paramastigota Procedimento: Observação microscópica das lâminas a fim de reconhecer as formas evolutivas presentes com a finalidade de realizar um diagnóstico seguro. Descreva cada forma diagnóstica observa indicando onde são encontradas. ______________________ _______________________ 19 12-PESQUISA DE GORDURA NAS FEZES 1 – OBJETIVO e FUNDAMENTAÇÃO Em uma dieta normal, a gordura nas fezes representa até 20% do total de sólidos. Os lipídios são medidos com ácidos graxos: < 7g/24 h. Este é o teste padrão no diagnóstico da esteatorréia, que apóia o diagnóstico das síndromes de mal absorção. As fezes típicas são espumosas, gordurosas, moles, pastosas e fétidas. IMPLICAÇÕES CLÍNICAS Aumentos da gordura fecal e dos ácidos graxos estão associados à síndrome de mal absorção: - Doença Celíaca (Espru não-tropical) - Doença de Crohn – colite ulcerativa - Fibrose cística - Enterite - Insuficiência pancreática, biliar - Remoção cirúrgica de uma seção do intestino FATORES QUE INTERFEREM Pode haver aumento da gordura neutra nas seguintes condições não patológicas: - Uso de medicações como bário, bismuto, supositórios e medicações que diminuem a absorção de gorduras; - Ingestão de óleo de rícino ou óleo mineral, maionese dietética de baixa caloria, dieta rica em fibras ou Metamucil; - Período neonatal; - Contaminação com urina; - A amostra aleatória de fezes é de pouco valor diagnóstico. 2 – METODOLOGIA PREPARO DO PACIENTE O ideal é coletar amostras durante 48 a 72 horas. O paciente deve fazer uma dieta de 60 a 100g de gorduras, 100g de proteínas e 180 g de carboidratos, por 6 dias antes e durante a coleta. Após a coleta, o paciente deve seguir dieta normal. Procedimento: Fazer uma suspensão de fezes e colocar uma gota sobre a lâmina. Acrescentar uma gota de álcool a 96% e uma gota de Sudam III a 1%. As gorduras neutras apresentam-se sob a forma de pequenas gotículas muito refringentes e fracamente coradas pela bile. Coram-se de laranja pelo Sudam III. Os ácidos graxos apresenta-se sob a forma de agulhas finas longas e entrecruzadas. Aquecendo-se a lâmina, dissolvem e assumem o aspecto de glóbulos. Normalmente, aparecem 2 gotas de gorduras neutras por campo. REATIVO DE SATOFF – SUDAM III Sudam III.......................................................2g Álcool a 96%.................................................10 mL Ácido acético glacial.....................................90 mL 20 13-Plasmodium sp - Malária 1 - OBJETIVO 1.1. Identificar as estruturas morfológicas que compõe o protozoário 1.2. Identificar as formas evolutivas de cada espécie de Plasmodio: esporozoítas,, trofozoíto jovem, trofozoíto maduro ,esquizonte, rosácea, merozoíta e gametócitos. 1.3. Selecionar os métodos aplicáveis para o diagnóstico da doença. 2 – METODOLOGIA Materiais: Microscópio Lâminas permanentes de esporozoítas, merozoíta Lâminas permanentes de esfregaço sanguíneo e gota espessa de: trofozoíto jovem, trofozoíto maduro, esquizonte, rosácea e gametócito das espécies Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum e Plasmodium malariae Procedimento: Observação microscópica das lâminas permanentes a fim de reconhecere diferenciar as formas evolutivas das espécies de Plasmodio com a finalidade de realizar um diagnóstico seguro. Identifique as formas evolutivas. Caracterize-as de acordo com as espécies de Plasmodium encontradas no Brasil. A) P. vivax B) P. ovale C) P. malariae D) P. falciparum 21 14-PESQUISA DE LEUCÓCITOS NAS FEZES 1 – OBJETIVO O exame microscópico de leucócitos nas fezes é útil na diferenciação de determinadas doenças bacterianas nas quais os leucócitos estão ausentes. Raramente é observado pus nas fezes. IMPLICAÇÕES CLÍNICAS Grande quantidade de leucócitos está associada a patologias como: - colite ulcerativa crônica - disenteria bacilar - abscessos - fístulas do sigmóide, reto e ânus - Shigelose - Salmonelose - Yersinia - diarréia por Escherichia coli entero-invasiva Ausência de leucócitos está associada a: - cólera - diarréia inespecífica - diarréia viral - colite amebiana - diarréia por E. coli não invasiva - parasitas – Giardia, Entamoeba 2 – METODOLOGIA PREPARO DO PACIENTE - O laboratório deve explicar ao paciente o propósito do teste. - O paciente deve trazer ao laboratório uma amostra aleatória de fezes. - Procedimentos com bário e laxativos devem ser evitados por 1 semana antes do teste. - A antibioticoterapia deve ser suspensa até a coleta. Procedimento: - Colocar uma gota de solução de Azul de Metileno no centro da lâmina. - Com o auxílio de um bastão de madeira ou um palito, peque uma pequena porção da amostra de fezes e misture completa e cuidadosamente com a gota de solução de azul de metileno. Dê preferência pela porção de fezes que tiver muco. - Colocar uma lamínula sobre a mistura e deixar em repouso por 3-5 minutos para corar os núcleos. - Observar no microscópio em campo de 40X. - Focalizar 10 campos microscópicos, contando a eventual presença de leucócitos polimorfonucleares. Quando a soma for igual ou superior a 50 leucócitos em 10 campos, indica agressão do trato intestinal. OBS: Pode-se utilizar também a coloração de GRAM. 22 12-Toxoplasmose 1 - OBJETIVO 1.1. Identificar as estruturas morfológicas que compõe o T. gondii 1.2 Identificar as formas evolutivas do parasita: taquizoíto, bradizoíto, esporozoítos e oocisto 1.3. Reconhecer o material biológico no qual as formas evolutivas estão presentes. 1.4. Selecionar os métodos aplicáveis para o diagnóstico da doença. 2 – METODOLOGIA Materiais: Microscópio Lâminas permanentes de taquizoíto, bradizoíto, esporozoíto e oocisto. Procedimento: Observação microscópica das lâminas permanentes a fim de reconhecer a formas evolutiva presente com a finalidade de realizar um diagnóstico seguro. Descreva cada forma diagnóstica observada indicando onde são encontradas. ____________________________ ____________________________ ____________________ 23 13-PESQUISA DE SANGUE OCULTO NAS FEZES 1 – OBJETIVO A pessoa elimina em torno de 2,0 a 2,5 mL de sangue pelo TGI diariamente. A eliminação de mais de 2,8 mL de sangue nas 24 horas é um sinal importante de hemorragia do TGI. Este teste rastreia úlcera gástrica, carcinoma de cólon, hemorróidas, fissuras, colite ulcerativa, diverticulite, hérnia, além de outras fontes de sangramento oculto. 2 – METODOLOGIA Materiais: Reativo de Meyer – Johannessen Água oxigenada 10 volumes Procedimento: PREPARO DO PACIENTE - Recomenda-se que o paciente consuma uma dieta adequada 4 dias antes da coleta. A dieta deve incluir, preferencialmente, grande quantidade de fibras. Deve-se evitar frutas e vegetais que possuam grande quantidade de peroxidase, como nabo, couve-flor, brócolis, rabanete. O paciente não deve comer cerne vermelha, nem mal passada. Não é recomendada a ingestão de álcool, aspirina ou vitamina C ,2 dias antes do exame. FATORES QUE INTERFEREM - Drogas como salicilatos, ferro, esteróides, indometacina, ácido bórico, brometos, iodo, agentes oxidantes; - Vegetais com atividade peroxidase e carne vermelha ou mal cozida; - Não se deve coletar após maratonas e durante o período menstrual. FUNDAMENTO A pesquisa de sangue oculto deve ser realizada em material recentemente emitido ao laboratório. A pesquisa é baseada na Reação de Meyer, a qual a fenolftaleína é reduzida pelo zinco para anidro ftálico que, oxidado pela água oxigenada, desprende oxigênio pela ação do sangue, transformando-se novamente em fenolftaleína, assumindo cor vermelha no meio alcalino. METODOLOGIA Fazer uma suspensão de fezes de aproximadamente 5%. Passar 5 mL para um tubo de ensaio e juntar 1 mL de Reativo de Meyer. Inverter várias vezes e acrescentar 3 a 4 gotas de água oxigenada. A positividade da reação é considerada quando se desenvolve coloração vermelha imediata. 24 14- Giardíase 1 - OBJETIVO 1.1. Identificar através de lâminas coradas permanentes as formas evolutivas do parasita: trofozoíta e cisto e diferencia-los. 1.2. Selecionar o melhor método aplicável para o diagnóstico desta parasitose. .2 – METODOLOGIA Materiais: Microscópio Lâminas permanentes de Trofozoíto e cistos de Giardia lamblia Material a fresco de cisto de Giardia lamblia Procedimento: Observação microscópica das lâminas permanentes e à fresco a fim de reconhecer as formas evolutivas presentes com a finalidade de realizar um diagnóstico seguro. Descreva cada forma diagnóstica observada. ____________________________ _______________________ 25 15-TÉCNICA DE FAUST E COLS: 1 – OBJETIVO TÉCNICA DE FLUTUAÇÃO: Princípio: Fundamenta-se no princípio da diferença de densidade específica entre ovos de helmintos, cistos e oocistos de protozoários e o material fecal, a fim de que esse organismos flutuem na superfície de um reagentes com alta densidade específica, neste caso, sulfato de zinco 33%, densidade igual a 1,180 g/cm 3 . Finalidade: Pesquisa de ovos leves de helmintos e cistos de protozoários 2 – METODOLOGIA Materiais: Material fecal Água Frasco borrel Bastão de vidro ou palito de madeira Gaze dobrada em quatro Peneira ou funil Cálice de sedimentação Tubo de centrifugação (de wassermann) Estante porta tubos Centrífuga Alça de platina Solução de sulfato de zinco 33% Bico de bunsen Lâmina Lamínula Lugol Microscópio Procedimento: 1.Preparar uma suspensão de 1 parte de fezes para 10 partes de água. 2.Filtrar em gaze dobrada 4 vezes. 3.Recolher o filtrado em tubo de centrifugação. 4.Centrifugar por 2 minuto a 1.500 rpm. 5.Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 mL de água e completar o volume com água. 6.Centrifugar novamente, repetindo a mesma operação até que o sobrenadante torne-se transparente. 7.Decantar o sobrenadante da última lavagem e ressuspender o sedimento em 1 mL de solução de sulfato de zinco a 1,180 g/ml de densidade e completar o volume com a mesma solução. 8.Centrifugar 2 minuto a 1.500 rpm. 9.O material a examinar será retirado da película superficial, empregando-se uma alça bacteriológica dobrada em anel. Fazer 3-4 tomadas, a fim de se obter maior quantidade de material a ser examinado. Solução de Sulfato de Zinco a 33% (d= 1,180): Sulfato de Zinco.................................................................................................. 33g Água destilada aquecida q.s.p........................................................................100 mL 26 16- Entamoebas 1 - OBJETIVO 1.1. Identificar as estruturas morfológicas que compõe o protozoário 1.2 Identificar as formas evolutivas do parasita: Trofozoíto, pré-cisto, metacisto e cisto 1.3. Diferenciar as espécies de amebas que parasitam o homem 1.4.Selecionar o melhor método aplicável para o diagnóstico destas parasitoses.. 2 – METODOLOGIA Materiais: Microscópio Lâminas permanentes de Trofozoíto, pré cisto, metacisto e cisto de Entamoeba histolytica Lâminas permanentes de Trofozoíto e cisto maduro de e Entamoeba coli Lâminas permanentes de Trofozoíto e cisto de Endolimax nana Lâminas permanentes de Trofozoíto e cisto de Iodamoeba butschlli Material a fresco de cistos de amebas Procedimento: Observação microscópica das lâminas permanentes e à fresco a fim de reconhecer as formas evolutivas presentes com a finalidade de realizar um diagnóstico seguro. Diferenciar e representar esquematicamente todas as formas evolutivas observadas __________________________________ _________________________________ ___________________________________ ________________________________________ _________________________________ __________________________________________ 27 17- Trichomoníase 1 - OBJETIVO 1.1. Identificar e indicar na figura abaixo as estruturas morfológicas que compõe o protozoário 1.2. Reconhecer a forma evolutiva do parasita: Trofozoíto 1.3. Selecionar o melhor método aplicável para o diagnóstico da doença ( coleta, conservação e coloração). 2 – METODOLOGIA Materiais: Microscópio Lâminas permanentes de Trofozoíto de T. vaginalis Procedimento: Observação microscópica das lâminas permanentes a fim de reconhecer a formas evolutiva presente com a finalidade de realizar um diagnóstico seguro. Descreva cada forma diagnóstica observada. ______________________ 28 18-Protozoários emergentes Sarcocystis, Isospora, Cyclospora e Cryptosporidium sp 1 - OBJETIVO 1.1. Identificar as estruturas morfológicas que compõe o protozoário 1.2.Identificar as formas evolutivas dos parasitas: Merontes (esquizontes), sarcocistos (cistos de bradizoítos), oocistos 1.3.Selecionar técnicas aplicáveis para o diagnóstico de cada emergente. 2 – METODOLOGIA Materiais: Microscópio Lâminas permanentes de sarcocisto muscular de Sarcocystis sp Lâminas permanentes de oocistos de Isospora belli, Cryptosporidium sp, Cyclospora cayetanensis e Sarcocystis sp Procedimento: Observação microscópica das lâminas permanentes a fim de reconhecer a forma evolutiva presente com a finalidade de realizar um diagnóstico seguro. Descreva cada forma diagnóstica observada indicando a espécie a qual pertence. 29 19-COLORAÇÃO DE KINYOUN – MODIFICADA: 1 – OBJETIVO Recomendada para a pesquisa de coccídeos parasitas intestinais. Materiais: Fucsina Carbólica de Kinyoun Solução de Azul de metileno a 1%: Solução de álcool-ácido clorídrico: Formalina tamponada 10%: Éter etílico ou acetato de etila Microscópio Procedimento: 1.Fazer esfregaço fino e deixar secar à temperatura ambiente ou na chama do bico de Bunsen. 2.Fixar o esfregaço em metanol por 5 minutos. 3.Corar com Fucsina Carbólica de Kinyoun por 3 minutos. 4.Lavar cuidadosamente com água destilada. 5.Gotejar solução álcool-ácida 0,5% sobre o esfregaço, até que esta solução escora pela lâmina e se torne incolor. 6.Lavar cuidadosamente com água destilada. 7.Contracorar com solução de Azul de metileno a 1% por 1 minuto. 8.Lavar com água corrente, secar a temperatura ambiente. 9.Examinar ao microscópio óptico comum em objetiva de imersão (1000X) Fucsina Carbólica de Kinyoun: Fucsina básica........................................................................................................4g Cristais de fenol......................................................................................................8g Álcool etílico 95%...............................................................................................20mL Água destilada.................................................................................................100mL Solução de Azul de metileno a 1%: Azul de metileno.....................................................................................................1g Água destilada.................................................................................................100mL Solução de álcool-ácido: Ácido clorídrico concentrado.............................................................................0,5mL Álcool etílico 70%.............................................................................................100mL 30 20-TÉCNICA DE FLUTUAÇÃO DE SHEATHER 1 – OBJETIVO TÉCNICA DE CENTRÍFUGO FLUTUAÇÃO EM SOLUÇÃO DE SACAROSE Princípio: Finalidade: Pesquisa de oocistos 2 – METODOLOGIA Materiais: Material fecal Formalina tamponada 10% Solução de sacarose ( Sheather) Frasco borrel Bastão de vidro ou palito de madeira Gaze dobrada em quatro Peneira ou funil Tubos de centrifugação Lâmina Lamínula Lugol Microscópio Procedimento: 1.Suspender 2g de fezes em 10 ml de formalina tamponada. 2. Filtrar a suspensão através de gaze dobrada duas vezes. 3.Transferir 2ml da suspensão para tubo de centrifugação rosqueado. 4.Acrescentar 8ml de solução de Sheather. 5.Agitar por inversão do tubo 6.Centrifugar por 15 minutos até 500g. 7.Pipetar com cuidado a camada superior da solução de açúcar ou utilizar a alça de platina. 8.Colocar em lâmina e observar os oocistos em microscópio óptico comum ( x 400) ou de contraste de fase. 9.Depois da lâmina seca, fixar e corar o material. Solução de açúcar de Sheather: Sacarose.............................. 500g Fenol.................................... 6,5g Água destilada.................... 320ml Ferver a solução de sacarose até clarificar e adicionar ,com cuidado, o fenol. Deixar esfriar à temperatura ambiente antes de usar 31 21-Schistosoma mansoni - Esquistossomose 1 – OBJETIVO 1.1 Identificar e diferenciar as características morfológicas de todas os estágios evolutivos: ovo, miracídio, cercária, macho e fêmea adultos 1.2.Selecionar técnicas específicas para o diagnóstico deste helminto. 2 – METODOLOGIA Materiais: Lâmina de ovo – método Kato Lãmina de cercaria Lâmina de verme adulto (casal) Lâmina cercaria – pele Lâmina de granuloma (corte histológico)-fígado Lâmina de granuloma (corte histológico)-intestino Material à fresco de ovos Procedimento: Observação microscópica das lâminas permanentes e à fresco a fim de reconhecer as formas evolutivas presentes e realizar um diagnóstico seguro. Identificar e representar e descrever esquematicamente todas as formas observadas. 32 22-MÉTODO DE KATO – KATZ 1 – OBJETIVO ESFREGAÇO ESPESSO DE CELOFANE Princípio: Esse método quantifica um pequena porção de fezes, combinando um cartão retangular de papelão ( ou plástico) com pequeno orifício central e o esfregaço espesso de fezes Finalidade: Pesquisa de ovos de helmintos principalmente de S. mansoni. 2 – METODOLOGIA Materiais: Material fecal Kit quantitativo – OPG – Lâmina de vidro Lamínula de papel celofane Tela metálica (orifícios correspondentes a 200 micras) Procedimento: 1.Depositar uma pequena quantidade de fezes sobre um pedaço de papel absorvente 2.Comprimir as fezes com uma espátula sobre uma tela ; 3.Colocar sobre uma lâmina de microscopia o cartão retangular contendo no seu centro um orifício de 6mm de diâmetro 4.Retirar as fezes que passaram pela tela até preencher o orifício do cartão 5.Retirar o cartão sobre as fezes e colocar a lamínula de papel celofane previamente embebida em solução de verde malaquita, água e glicerina, durante 24 h; 6.Inverter o conjunto lâmina- fezes-lamínula sobre papel absorvente e comprimir com o polegar sobre a lâmina, até que o material fecal se distribua de maneira uniforme. 7.Deixar a preparação em repouso,à temperatura ambiente, para clarificação do material pela glicerina 8.Examinar ao microscópio, com objetiva de 10x. O número de ovos encontrados multiplicados por 24 corresponderá ao número de ovos por grama de fezes Preparo das lamínulas de papel celofane Mergulhar as lamínulas ou tiras de papel celofane pelo menos 24 horas em uma solução contendo: Glicerina.............................................................100mL Agua destilada....................................................100mL Solução aquosa de verde malaquita.......................1mL Escorrer o excesso da solução, deixando as tiras de papel apenas umedecidas. Guardá-las em um placa de Petri fechada 33 23-Fasciola hepatica 1 - OBJETIVO 1.1 Identificar e diferenciar as características morfológicas de todas os estágios evolutivos: ovo, miracídio, espocisto, rédias, cercária, metacercária, forma adulta 2 – METODOLOGIA Materiais: Lâminas permanentes de ovos Procedimento: Observação microscópica das lâminas permanentes e a fim de reconhecer as formas evolutivas presentes e realizar um diagnóstico seguro. ________________________ 34 24-Teníase - Taenia solium e T. saginata 1 - OBJETIVO 1.1 Identificar e diferenciar as características morfológicas de todas os estágios evolutivos: ovo – cisticerco – adulto (escólex, colo, estróbilo, ventosas, proglotes) 1.2. Selecionar os métodos aplicáveis para o diagnóstico desta parasitose. 2 – METODOLOGIA Materiais: Lâminas permanentes de escólex e proglotes grávidas de T. solium e T. saginata Material à fresco de ovos de Taenia sp Procedimento: Observação microscópica das lâminas permanentes e à fresco a fim de reconhecer as formas evolutivas presentes com a finalidade de realizar um diagnóstico seguro. Representar esquematicamente todas as formas observadas. 35 25-Tamisação das fezes 1 – OBJETIVO 1.1. Pesquisa de Proglotes de Taenia ou partes de eliminação 2 – METODOLOGIA Materiais: Material fecal Água Bastão de vidro Tamis metálico de 80 a 100 malhas por cm 2 Lâmina de vidro Procedimento: 1.Deve-se coletar todas as fezes emitidas ( em geral após uso de purgantes salinos) 2.Emulsionar as fezes em àgua com auxílio de um bastão de vidro, coar todo material em tamis metálico de 80 a 100 malhas por cm 2 sob uma tormeira aberta 3.Atentamente, coletar as proglotes ou vermes eventualmente retidos na peneira Obs: Não raro são levados ao laboratório proglotes de Taenia para exame e identificação. 36 26-Identificação de Proglotes de Taenia – Método do Ácido acético 1 – OBJETIVO 1.1. Reconhecer especificamente proglotes grávidas da Taenia solim e T. saginata pelo seu alto significado clínico uma vez que a Taenia solium desenvolve a cisticercose humana. 2 – METODOLOGIA Materiais: Proglotes Ácido acético glacial Lâmina de vidro Procedimento: 01. Colocar a(s) proglote(s) a ser(em) identificada(s) em pequeno recipiente contendo ácido acético glacial. 02. Decorridos pelo menos 15 minutos, retira-la e comprimi-la entre duas lâminas. 03. Examinar sob iluminação intensa (artificial). 04. Os caracteres do útero e suas ramificações permitirão distinguir se a proglote grávida em exame é de T. solium ou T. saginata. 05. É aconselhável utilizar lâminas largas para comprimir as proglotes como medida de cautela para uma eventual contaminação do examinador, através de ovos do parasita (principalmente em se tratando da T. solium). 06. O mecanismo de ação do ácido acético está baseado na dissolução de sais, calcários e carbonato de cálcio que impregnam o corpo do parasita. ♠Taenia saginata: proglotes grávidas: útero com ramificações laterais finas, dicotômicas e numerosas. ♣Taenia solium: proglotes grávidas: útero com ramificações espessas, dendríticas e em pequena quantidade. *OBS.: pelo encontro de ovos de taenia nas fezes não podemos dizer se a espécie é solium ou saginata. RESULTADO: OVOS DE Taenia sp. Somente pelo encontro de proglotes, podemos determinar a espécie, após executar a técnica diferencial. Atividade: Esquematize as proglotes grávidas de T. solium e T. saginata: 37 27-Hymenolepis nana e H. diminuta 1 - OBJETIVO 1.1 Identificar e diferenciar as características morfológicas de todas os estágios evolutivos: ovo, verme adulto 1.2.Selecionar técnicas aplicáveis para o diagnóstico deste helminto. 2 – METODOLOGIA Materiais: Lâmina de ovo de H. nana e H. diminuta Lâmina de proglotes Lâmina de escólex Material à fresco de ovo de H. nana Procedimento: Observação microscópica das lâminas permanentes e à fresco a fim de reconhecer as formas evolutivas presentes. Diferenciar ovos de H. nana e H. diminuta com a finalidade de realizar um diagnóstico seguro. Representar esquematicamente todas as formas observadas. _________________ _________________ 38 28-Ascaris lumbricoides 1 - OBJETIVO 1.1 Identificar e diferenciar as características morfológicas dos estágios evolutivos: ovo (corticado, decorticado e infértil) e vermes adultos 1.2.Selecionar técnicas específicas para o diagnóstico deste helminto. 2 – METODOLOGIA Materiais: Lâmina de ovo Lâmina de adulto (corte transversal) Espécime adulto macho Espécime adulto fêmea Material á fresco de ovo (corticado, decorticado e infértil) Procedimento: Observação microscópica das lâminas permanentes e a fim de reconhecer as formas evolutivas presentes e realizar um diagnóstico seguro. Descreva morfologicamente cada forma observada. 39 29-TÉCNICA DE LUTZ ( Hoffmann, Pons e Janer): 1 – OBJETIVO TÉCNICA DE SEDIMENTAÇÃO: Princípio: Sedimentação espontânea de fezes em água pela força da gravidade Finalidade: Pesquisa de ovos e larvas de helmintos e cistos de protozoários 3 – METODOLOGIA Materiais: Material fecal Água Frasco borrel Bastão de vidro ou palito de madeira Gaze dobrada em quatro Peneira ou funil Cálice de sedimentação Canudo ou pipeta de pasteur Lâmina Lamínula Lugol Microscópio Procedimento: 1.Em cálice graduado ou copo descartável, homogeneizar, com auxílio de bastão de vidro ou palito de madeira, cerca de 2 – 4 g de fezes em 20 mL de água; 2.Filtrar a suspensão por meio de gaze dobrada 4 vezes, em cálice de fundo cônico apropriado, com capacidade de 125 mL; 3.Completar o volume com água e deixar em repouso por no mínimo 2 horas para que ocorra sedimentação espontânea; 4.Após, com auxílio de canudinho (refrigerante) ou pipeta vedada pelo dedo indicador, recolher do fundo do cálice amostra da porção inferior do sedimento, depositar sobre lâmina, adicionar 1 gota de lugol, cobrir com lamínula e proceder a leitura microscópica. 40 30-Ancilostomídeos: Ancylostoma duodenale e Necator americanus 1 - OBJETIVO 1.1 Identificar e diferenciar as características morfológicas dos estágios evolutivos: ovo, larva rabditoide, larva filarioide, verme adulto (macho e fêmea) 1.2.Selecionar técnicas específicas para o diagnóstico deste helminto. 2 – METODOLOGIA Materiais: Lâmina de larvas rabditoides e filarioides de ancilostomideos Lâminas de ovos de ancilostomídeos Lâmina de Ancylostoma duodenale - macho Lâmina de Ancylostoma duodenale – fêmea Lâmina de Necator americanus - macho Lâmina de Necator americanus – fêmea Material à fresco de ovos de ancilostomídeos Procedimento: Observação microscópica das lâminas permanentese material a fresco a fim de reconhecer as formas evolutivas presentes e realizar um diagnóstico seguro. Reconhecimento e diferenciação das larvas rabditóides e filarióides de ancilostomídeos ( vestíbulo bucal, primórdio genital, cauda) ____________________ 41 31-TÉCNICA DE WILLIS, 1921 1 – OBJETIVO FLUTUAÇÃO SIMPLES: Princípio: Fundamenta-se na dupla propriedade que apresentam certos ovos de helmintos de flutuarem na superfície de uma solução de densidade elevada, neste caso, Cloreto de sódio (NaCl), densidade igual a 1,20 g/ml e de aderirem ao vidro. Cistos de protozoários se retraem, ficando irreconhecíveis. Preparação da Solução: Aproximadamente 40g de NaCl em 100 ml de água quente ou em ebulição, controlar a densidade com densitômetro.filtrar em papel de filtro. Finalidade: Pesquisa de ovos leves de helmintos (principalmente ancilostomídeos) 2– METODOLOGIA Procedimento: 1.Dissolver cerca de 5g de fezes em solução saturada de NaCl; 2.Filtrar em gaze dobrada em quatro em frasco de borrel e completar com solução saturada de NaCl até formar um menisco convexo na boca do frasco; 3.Colocar uma lâmina por sobre as bordas do frasco para que fique em contato com o líquido de 5 - 15 minutos no máximo; 4.Levantar rapidamente a lâmina, invertendo sua posição, virando-a para cima; 5.Adicionar ao líquido retido na superfície do vidro, uma gota de solução de Lugol e examinar ao microscópio. 42 32-Strongyloides stercoralis 1 – OBJETIVO 1.1 Identificar e diferenciar as características morfológicas dos estágios evolutivos: fêmea partenogenética, larva rabditoide, larva filarioide 1.2.Selecionar técnicas específicas para o diagnóstico deste helminto. 2 – METODOLOGIA Materiais: Lâmina de larvas rabditoides Lâmina de larvas filarioides Lamina de fêmea partenogenética Material à fresco para observação de larvas Procedimento: Observação microscópica das lâminas permanentes e material a fresco a fim de reconhecer as formas evolutivas presentes e realizar um diagnóstico seguro. Reconhecimento e diferenciação das larvas rabditoides e filarioides de Strongyloide stercoralis ( vestíbulo bucal, primórdio genital, cauda) Diferenciação de larvas rabditoides e filarioides de ancilostomídeos e Strongyloides stercoralis 43 33-COPROCULTURA DE HARADA MORI 1 – OBJETIVO Princípio: Migração de larvas de nematóides de amostras fecais cultivadas no papel de filtro em tubo de ensaio. Finalidade: Diagnóstico de infecções humanas pelo Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Strongyloides stercoralis. Amostra: Fezes frescas. 2 – Procedimento 1. Preparar uma fita de papel de filtro de 15x1cm ou 15x2cm, com dobradura no meio; 2.Espalhar 0,5g de fezes frescas no papel-filtro, formando um esfregaço fino e uniforme, em um dos lados da fita, exceto nas áreas de 4cm distante de ambas as extremidades; 3. Introduzir a fita em tubo de ensaio de 18x180mm ou 20x200mm ou em tubo cônico de centrifuga de maneira que a água não contacte com as fezes; 4. Fechar o tubo com rolha de borracha, conservando-o na posição vertical durante 10 a 14 dias, à temperatura de 25-30°C. 5. No fim do período de incubação colher a água no fundo do tubo a fim de observar se existem larvas filarioides. 6. Em caso positivo, retirar a rolha e em seguida o papel de filtro. 7. Colocar o tubo em banho de água a 50°C durante 15 minutos e transferir a água para um tubo de centrifugação e centrifugar a 500 x g por 1 minuto. Decantar e colocar as larvas em uma lâmina e eaminar em pequeno aumento. 44 34-Enterobius vermiculares 1 - OBJETIVO 1.1 Identificar e diferenciar as características morfológicas dos estágios evolutivos: ovo, vermes adultos (macho e fêmea) 1.2.Selecionar técnicas específicas para o diagnóstico deste helminto. 2 – METODOLOGIA Materiais: Lâmina de adulto macho e fêmea Lamina de ovos Material à fresco para identificação de ovos Procedimento: Observação microscópica das lâminas permanentes e material a fresco a fim de reconhecer as formas evolutivas presentes e realizar um diagnóstico seguro. Descreva morfologicamente a forma observada. 45 35-MÉTODO DE GRAHAM (OU FITA ADESIVA) 1 - OBJETIVO Pesquisa de Enterobios vermiculares (coleta local) 2 – METODOLOGIA Materiais: Lâminas de vidro Fita durex Tubo de ensaio Lugol Procedimento: 01. Ao despertar pela manhã, antes que o paciente faça higiene ou troque de roupas, fazer a coleta do material. 02. Fixar sobre uma lâmina limpa e desengordurada uma tira de fita durex um pouco menor que o comprimento da lâmina. Nas extremidades colar 2 tiras de papel, as quais servirão de suporte para segurar e também para a identificação. 03. No momento de usar, retirar cuidadosamente a fita da lâmina. Com a face adesiva voltada para fora, colocar um tubo de ensaio (ou abaixador de língua) na face interna (sem cola), como suporte, segurando nas tiras de papel. 04. Afastar os glúteos do paciente e encostar rápida e firmemente a fita adesiva sobre o ânus. 05. Após a coleta, colar novamente sobre a lâmina, procurando evitar a formação de bolhas de ar. 06. Examinar ao microscópio com pequeno aumento, percorrendo todos os campos. OBS.: - Pode-se utilizar 1 a 2 gotas de lugol entre a fita adesiva e a lâmina. - É freqüente o encontro de ovos de Taenia sp. - Outros métodos com papel de celofane não superam a técnica descrita e são menos higiênicos. 46 36-Trichuris trichiura 1 - OBJETIVO 1.1 Identificar e diferenciar as características morfológicas dos estágios evolutivos: ovo e vermes adultos 1.2.Selecionar técnicas específicas para o diagnóstico deste helminto. 2 – METODOLOGIA Materiais: Lâmina de adulto macho e fêmea Lamina de ovos Material à fresco para identificação de ovos Procedimento: Observação microscópica das lâminas permanentes e material a fresco a fim de reconhecer as formas evolutivas presentes e realizar um diagnóstico seguro. Descreva morfologicamente a forma observada. 47 37-TÉCNICA DE RUGAI, MATTOS E BRISOLA: 1 – OBJETIVO Princípio: Fundamenta-se no termohidrotropismo de larvas pela ação da gravidade Finalidade: Pesquisa de larvas de helmintos Amostra: Fezes frescas 3 – METODOLOGIA Materiais: Material fecal Água morna Gase Frasco borrel Bastão de vidro ou palito de madeira Gaze dobrada em quatro Peneira ou funil Cálice de sedimentação Canudo ou pipeta de Pasteur Lâmina Lamínula Lugol Microscópio Procedimento: 1.Estender sobre a boca da latinha contendo as fezes um pedaço de gaze dobrada 2 a 4 vezes, conforme a consistência das fezes, e repuxar as extremidades da gaze para trás da lata, formando uma ”trouxinha”. 2.Emborcar a “trouxinha” com a abertura voltada para baixo em cálice cônico com capacidade de 125 mL, fixando-a por pressão contra as paredes, em posição levemente inclinada. 3.Encher o cálice com água aquecida a 40ºC - 45 o C até que o nível de água alcance as fezes contidas na “trouxinha” emborcada. 4.Deixar em repouso cerca de 90 minutos. As larvas, quando presentes, dirigiam-se para o fundo do cálice. 5.Sem retirar a trouxinha”, introduzir até o fundo do cálice um canudinho ( que pode estar adaptado a uma ponteira) para aspirar rapidamente o conteúdo final. 6.Passar o material para um vidro de relógio e examinar em pequeno aumento ou passar o material para uma lâmina, adicionar 1 gota de lugol e observar ao microscópio.48 38-TÉCNICA DE BAERMAN E MORAES 1 – OBJETIVO Princípio: Fundamenta-se no termohidrotropismo de larvas pela ação da gravidade Finalidade: Pesquisa de larvas de helmintos. Amostra: Fezes frescas 2 – Procedimento 1. Monta-se um aparelho extrator de larvas, utilizando-se um funil de vidro com cerca de 12 cm de diâmetro, tendo na extremidade inferior da usa haste um pequeno pedaço de tubo de látex conectado. Ao mesmo, prende-se uma pinça ou similar para impedir o escoamento de água. 2. Coloca-se o funil em um suporte e um vidro de relógio de 10cm de diâmetro sob o tubo de borracha pinçado; 3. Sobre o funil é ajustada uma tela metálica e, em cima desta, um pedaço de gaze dobrado 4 vezes; 4. Enche-se o funil com água aquecida a 40 – 42°C, até ultrapassar a parte inferior da tela contida no funil. 5. Sobre a gaze dobrada, deposita-se 8 a 10 gramas de fezes; 6. Após uma hora, as larvas existentes nas fezes passam para a água, acumulando-se no tubo de borracha; 7. Abre-se a pinça, deixando cair 3 a 5 mL de líquido no vidro de relógio, examinando-se ao microscópio em pequeno aumento; as larvas são pescadas com uma pipeta de pasteur, colocadas em uma lâmina e identificadas após coloração com solução de lugol. Obs: Fezes pastosas devem ser colocadas em gaze dobrada maior número de vezes. Material líquido não se presta para esse método. 49 39-TÉCNICA DO FORMOL – ÉTER MODIFICADO: 1 – OBJETIVO TÉCNICA DE SEDIMENTAÇÃO POR CENTRIFUGAÇÃO: Princípio: Os organismos são sedimentados pela centrifugação, sendo necessário o uso de éter ou acetato de etila para separação das gorduras. Finalidade: Pesquisa de oocistos 4 – METODOLOGIA Materiais: Material fecal Água Frasco borrel Bastão de vidro ou palito de madeira Gaze dobrada em quatro Peneira ou funil Tubos de centrifugação Lâmina Lamínula Lugol Microscópio Procedimento: 1. Homogenizar 1 g de fezes em 10 mL de formalina tamponada a 10%, pH 7,0 em PBS. 2. Filtrar em gaze e tranferir o filtrado para flaconetes. 3. Se necessário, conservar em geladeira até a próxima etapa. 4. Colocar 4 mL do material em formalina em tubo de centrífuga e adicionar 2 mL de éter etílico. 5. Centrifugar por 10 minutos a 1500 rpm. 6. Desprezar o sobrenadante e limpar as paredes do tubo com um “cotonete”. 7. Confeccionar o esfregaço com o sedimento em lâminas bem limpas e desengorduradas. 8. Realizar coloração Formalina tamponada 10%: Formaldeído 37 – 40%......................................................................................10mL PBS q.s.p.........................................................................................................100mL Éter etílico ou acetato de etila 50 40-Filarias 1 - OBJETIVO 1.1 Identificar as características morfológicas de todas os estágios evolutivos: microfilária e verme adulto 1.2.Diferenciar microfilárias das espécies Wuchereria bancrofti, Onchocerca volvulus, Mansonella ozzardi 1.3.Selecionar técnicas específicas para o diagnóstico dessas parasitoses. 2 – METODOLOGIA Materiais: Lâminas de microfilárias de Wuchereria bancrofti Lâminas de microfilárias de Onchocerca volvulus Lâminas de microfilárias de Mansonela ozzardi Procedimento: Observação microscópica das lâminas permanentes a fim de reconhecer as formas evolutivas presentes e realizar um diagnóstico seguro. Descreva e esquematize morfologicamente as formas observadas indicando as técnicas apropriadas para o encontro das mesmas. 51 41-Artrópodes (Características Gerais) 1 - OBJETIVO 1.1 Observar, diferenciar e desenhar as características morfológicas externas, principais dos artrópodes. 2 – METODOLOGIA Materiais: Fotos em transparências Espécimes preparados Procedimento: Utilizando-se do desenho esquemático, anexo, localizar nos espécimes preparados para a aula as características gerais dos artrópodes. Ilustrações: Fig. 1 - Esquema do corpo de um inseto (gafanhoto) com as suas regiões separadas (adapt. de Herms); a - antena; ant - asa anterior; aps - asa posterior; cx - coxa mediana; f1, f2 e f3 - fêmur anterior, médio e posterior; g- garra; oc - ocelo; ocp - olho composto; <ov - ovopositor; <sp - espiráculo; <t - tímpano; p; tb-tíbiamediana; >trtrocante rmediano; ts - artículos tarsais. Exercícios: Fazer pesquisa sobre preparo de espécimes em laboratório 52 42-Artrópodes (Classe Insecta) 1 - OBJETIVO 1.1 Observar, diferenciar e desenhar as características morfológicas do aparelho bucal dos insetos 2 – METODOLOGIA Materiais: Fotos em transparências Espécimes preparados Procedimento: Utilizando-se do desenho esquemático, abaixo, localizar nos espécimes preparados para a aula as características gerais do aparelho bucal da Classe Insecta. Ilustrações: Aparelho bucal dos insetos (esquemático:) M - mastigador; L - lambedor; S - sugador maxilar; P - sugador labial (pungitivo); g - espirotromba; h - hipofaringe; lb - lábio; Ir - labro; Ire - labro-epifaringe; mn - mandíbula; mx - maxíla; plb - palpo labial; pmx - palpo maxilar (adapt. de Forattini, Ennt. Méd. 1962). 53 43-Artrópodes (Ordem Hemíptera) 1 - OBJETIVO 1.1 Observar, diferenciar e desenhar as características morfológicas da Ordem Hemíptera 2 – METODOLOGIA Materiais: Fotos em transparências Espécimes preparados Procedimento: Utilizando-se do desenho esquemático, abaixo, localizar nos espécimes preparados para a aula as características gerais da Ordem Hemíptera. Ilustrações: Ordem Hemíptera - Triatoma infestans: detalhes da morfologia externa. Em separado, as extremidades do abdômen, mostrando as diferenças entre macho e fêmea. A - Detalhe do sulco estridulatório, na base do esterno. Exercícios: Fazer pesquisa sobre as diferenças entre os principais gêneros da Família Reduviidae, Subfamília triatominae 54 44-Artrópodes (Família Psychodidade) 1 - OBJETIVO 1.1 Observar, diferenciar e desenhar as características morfológicas da Família Psychodidae 2 – METODOLOGIA Materiais: Fotos em transparências Espécimes preparados Procedimento: Localizar nos espécimes preparados para a aula as características gerais da Família Psychodidae - Flebotomíneos Ilustrações: Exercícios: Fazer pesquisa sobre as diferenças entre os principais gêneros dessa família 55 45-Artrópodes (Família Culicidae) 1 - OBJETIVO 1.1 Observar, desenhar e diferenciar as características morfológicas da Família Culicidae 2 – METODOLOGIA Materiais: Fotos em transparências Espécimes preparados Procedimento: Localizar nos espécimes preparados para a aula as características gerais da Família Culicidae – Anophelinos Exercícios: Fazer pesquisa sobre as diferenças entre os principais gêneros dessa família 56 46-Artrópodes (Subfamília Culicinae) 1 - OBJETIVO 1.1 Observar, desenhar e diferenciar as características morfológicas da Subfamília Culicinae 2 – METODOLOGIA Materiais: Fotos em transparências Espécimes preparados Procedimento: Localizar nos espécimes preparados para a aula as características gerais da Subfamília Culicinae Gênero: Aedes sp; Culex sp Ilustrações: Aedes sp 57 Exercícios: Fazer pesquisa sobre as diferenças entre os principais gêneros dessa subfamília. 58 47-Artrópodes(Família Simuliidae) 1 - OBJETIVO 1.1 Observar, diferenciar e desenhar as características morfológicas da Família Simuliidae 2 – METODOLOGIA Materiais: Fotos em transparências Espécimes preparados Procedimento: Localizar nos espécimes preparados para a aula as características gerais da Família Simuliidae - borrachudos Exercícios: Fazer pesquisa sobre as diferenças entre os principais gêneros dessa família 59 48-Artrópodes (Família Ceratopogonidae) 1 - OBJETIVO 1.1 Observar,desenhar e diferenciar as características morfológicas da Família Ceratopogonidae 2 – METODOLOGIA Materiais: Fotos em transparências Espécimes preparados Procedimento: Localizar nos espécimes preparados para a aula as características gerais da Família Ceratopogonidae.Gênero Culicoides Exercícios: Fazer pesquisa sobre as diferenças entre os principais gêneros dessa família 60 49-Artrópodes (Família Muscidae) 1 - OBJETIVO 1.1 Observar, desenhar e diferenciar as características morfológicas da Família Muscidae 2 – METODOLOGIA Materiais: Fotos em transparências Espécimes preparados Procedimento: Localizar nos espécimes preparados para a aula as características gerais da Família Muscidae – musca doméstica Exercícios: Fazer pesquisa sobre as diferenças entre os principais gêneros dessa família 61 50-Artrópodes (Família Muscidae) 1 - OBJETIVO 1.1 Observar, desenhar e diferenciar as características morfológicas da Família Muscidae 2 – METODOLOGIA Materiais: Fotos em transparências Espécimes preparados Procedimento: Localizar nos espécimes preparados para a aula as características gerais da Família Muscidae – Musca doméstica Exercícios: Fazer pesquisa sobre as diferenças entre os principais gêneros dessa família 62 51-Artrópodes (Família Cuterebridae) 1 - OBJETIVO 1.1 Observar, desenhar e diferenciar as características morfológicas da Família Cuterebridae 2 – METODOLOGIA Materiais: Fotos em transparências Espécimes preparados Procedimento: Localizar nos espécimes preparados para a aula as características gerais da Família Cuterebridae- berne Exercícios: Fazer pesquisa sobre as diferenças entre os principais gêneros dessa família 63 52-Artrópodes (Família Calliphoridae) 1 - OBJETIVO 1.1 Observar, desenhar e diferenciar as características morfológicas da Família Calliphoridae 2 – METODOLOGIA Materiais: Fotos em transparências Espécimes preparados Procedimento: Localizar nos espécimes preparados para a aula as características gerais da Família Calliphoridae. – “varejeiras” Exercícios: Fazer pesquisa sobre as diferenças entre os principais gêneros dessa família 64 53-Artrópodes (Família Sarcophagidae) 1 - OBJETIVO 1.1 Observar, desenhar e diferenciar as características morfológicas da Família Sarcophagidae 2 – METODOLOGIA Materiais: Fotos em transparências Espécimes preparados Procedimento: Localizar nos espécimes preparados para a aula as características gerais da Família Sarcophagidae. Exercícios: Fazer pesquisa sobre as diferenças entre os principais gêneros dessa família 65 54-Artrópodes (Família Tabanidae) 1 - OBJETIVO 1.1 Observar, desenhar e diferenciar as características morfológicas da Família Tabanidae 2 – METODOLOGIA Materiais: Fotos em transparências Espécimes preparados Procedimento: Localizar nos espécimes preparados para a aula as características gerais da Família Tabanidae – “mutucas” Exercícios: Fazer pesquisa sobre as diferenças entre os principais gêneros dessa família 66 55-Artrópodes (Família Siphonaptera) 1 - OBJETIVO 1.1 Observar, desenhar e diferenciar as características morfológicas da Ordem Siphonaptera 2 – METODOLOGIA Materiais: Fotos em transparências Espécimes preparados Procedimento: Localizar nos espécimes preparados para a aula as características gerais da Ordem Siphonaptera - Pulgas Ilustrações: Exercícios: Fazer pesquisa sobre as diferenças entre os principais gêneros dessa família 67 56-Artrópodes (Família Anoplura) 1 - OBJETIVO 1.1 Observar, desenhar e diferenciar as características morfológicas da Ordem Anoplura 2 – METODOLOGIA Materiais: Fotos em transparências Espécimes preparados Procedimento: Localizar nos espécimes preparados para a aula as características gerais da Ordem Anoplura.- piolhos Ilustrações: Pediculus humanus Exercícios: Fazer pesquisa sobre as diferenças entre os principais gêneros dessa família 68 57-Artrópodes (Subclasse Acari) 1 - OBJETIVO 1.1 Observar, desenhar e diferenciar as características morfológicas da Subclasse Acari 2 – METODOLOGIA Materiais: Fotos em transparências Espécimes preparados Procedimento: Localizar nos espécimes preparados para a aula as características gerais da Subclasse Acari – carrapatos e ácaros Exercícios: Fazer pesquisa sobre as diferenças entre os principais gêneros dessa família BIBLIOGRAFIA CONSULTADA VALLADA, E.P. Manual de Exame de Fezes: coprologia e parasitologia, Editora Atheneu, 1995. DE CARLI, G. A. Parasitologia Clínica: seleção de métodos e técnicas d laboratório para o diagnóstico das parasitoses humanas. São Paulo: Atheneu, 2001. NEVES, D. P.; MELO, A. L.; GENARO, O.; LINARDI. P. M. Parasitologia Humana, 10ª ed. São Paulo: Atheneu. 2000. DIAS, R. M. D. S.; MANGINI, A. C. S.; TORRES, D. M. A. G. V. et al. Cryptosporidiosis among patientes with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) in country of São Paulo, Brazil. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, v. 30, p. 310-2, 1988. Division of Parasitic Diseases – DPDx – Laboratory Identification of Parasites of Public Health Concern. Disponível em http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/Default.htm REY, Luís. Parasitologia: Parasitos e doenças parasitárias do homem nas Américas e na África. 3º ed., Guanabara-Koogan, 2001. COURA, José Rodrigues. Dinâmica das doenças Infecciosas e Parasitárias. Guanabara – Koogan, 2005 WORLD HEALTH ORGANIZATION. Procedimentos Laboratoriais em Parasitologia Médica. 2.ed. São Paulo: Livraria e Editora Santos. 1999. 114p. ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE. Procedimentos Laboratoriais em Parasitologia Médica.Genebra, 1994. Disciplina de Parasitologia Básica e Clínica: MSc Cibeli Lunardeli de Oliveira e Esp. Liane Terezinha Dezanet S. - Campus - Toledo