A maior rede de estudos do Brasil

Grátis
165 pág.
Curso de HPLC

Pré-visualização | Página 1 de 8

Curso de Cromatografia Líquida e Validação de Métodos
Gianfranco Brendolan
SGB Consultoria Química Ltda
Curso de Cromatografia Líquida e Validação de Métodos
	1 – cromatografia Líquida e sua utilização
	2 – conceitos de separação cromatográfica
	3 – detecção, sensibilidade e seletividade
	4 – preparo de amostra
	5 – coluna
	6 – sistema cromatográfico
	7 – gradiente 
	8 – desenvolvimento de métodos
 
	1 – validação: uma visão geral
	2 – critérios de validação
	3 – estatística 
	4 – parâmetros da validação
	5 – preparando o estudo da validação
	6 – validação de métodos qualitativos
Primeira parte – HPLC
Capítulo 1º
	A HPLC é uma das mais modernas técnicas analíticas que temos.
	Tem seu aparecimento em meados 1970 e até hoje não para de crescer.
	Como toda técnica analítica tem suas vantagens e desvantagem.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 1º
	Vantagens da HPLC
	Menor tempo de análise. 
	Alta resolução 
	Resultados quantitativos. 
	Boa sensibilidade 
	Versatilidade 
	Automatização. 
	Desvantagens (limitações)
	Alto custo da instrumentação. 
	Alto custo de operação. 
	Difícil análise qualitativa. 
	Falta de detector universal sensível . 
	Necessidade de experiência no seu manuseio. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 1º
	Técnicas da HPLC
Há cinco tipos diferentes de fases estacionárias, que implicam em cinco mecanismos diferentes de realizar a HPLC. 
Cromatografia Líquido-Sólido ou por Adsorção 
Cromatografia Líquido-Líquido ou por Partição 
Cromatografia Líquida com Fase Ligada 
Cromatografia por Exclusão 
Cromatografia Líquida por Troca Iônica 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Conceito de separação
70% dos trabalhos em HPLC são de fácil resolução pois normalmente trabalhamos com uma única substância.
30% dos trabalhos são os mais difíceis e desafiadores que requerem experiência e conhecimento.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Resolução.
O quanto dois picos estão separados entre si.
Matematicamente a resolução é definida como:
t1 e t2 são os tempo dos picos
W1 e w2 são as larguras da base dos picos
		(eq. 2.1)
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	A medida completa da resolução não envolve somente a distância entre os dois picos, mas sim outros fatores como: seletividade, fator de capacidade e o número de pratos teóricos. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	 α é definido como a razão entre os fatores de capacidade dos picos.
	k' é definido como fator de retenção e está baseado no tempo morto da coluna.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Com base no exposto acima, podemos verificar que quando o valor temos o que podemos considerar uma situação de separação completa. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Os principais parâmetros que afetam a resolução são:
	Composição da fase móvel.
	Composição da fase estacionária.
	Temperatura.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Mudanças na fase móvel ou fase estacionária geralmente afetam K e α com menos efeito sobre N.
	O valor de N depende da qualidade da coluna e pode variar mudando-se 
	Taxa de fluxo
	Comprimento da coluna
	Tamanho da partícula
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Com base na eq. 2.2 a resolução aumenta sempre que o valor de K da amostra aumenta; se dois compostos eluirem próximo de t0 então K=0 e RS=0.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	É muito importante que durante o procedimento de pesquisa e desenvolvimento de métodos analíticos se tenha um conhecimento completo da coluna que estamos utilizando, para tanto o valor do t0 é muito importante.
	O valor do t0 pode ser deretminado de varias formas:
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
Primeiro distúrbio significativo da linha de base.
Uso de uma fase móvel muito forte.
Cálculo com base nas dimensões da coluna.
Injetando amostra sem retenção.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Já se quisermos fazer a determinação do por cálculo podemos usar a seguinte equação:
	Onde: Vm = Volume morto e F=fluxo
	
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Assim temos
	 L = comprimento da coluna em centímetros.
	 d =diâmetro da coluna em centímetros.
 Assim : 
 
	para uma coluna de 0,46 cm de ID temos
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Para a determinação efetiva pode-se utilizar substância que não apresente retenção, e para coluna de fase reversa utiliza-se uma concentrada de nitrato de sódio detectando em 210nm.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Efeito da Seletividade 	
	Muitas substâncias são analisadas com uma ótima resolução, fazendo-se ajustes na força do solvente (%B), ajustando o tempo de retenção.
	De qualquer maneira, no desenvolvimento do método, depois de ajustar o valor de 0,5<K<20, vamos mexer no valor de α.
	O valor de α pode ser modificado mudando-se a fase móvel, mudando o tipo de coluna ou mudando a temperatura.
	Usualmente começamos pelas mudanças do solvente.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	HPLC Método	Qual força de solvente é usualmente variada.
	Fase Reversa	Água (A) mais solvente orgânico (B). (Ex. água - acetonitrila); aumento na %B diminuição de K.
	Fase Normal	Solvente orgânico não polar (A) mais solvente orgânico polar (B). (Ex. hexano - propanol); aumento na %B diminuição de K.
	Íon-Par	Mesmas condições da fase reversa.
	Troca Iônica	Solução aquosa, tampão mais adição de sal. (Ex. 5mM acetato de sódio mais 50 mM de NaCl); aumento da força iônica (NaCl concentração) diminuição de K.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Variável	Exemplo
	RUN 1	RUN 2
	Mudar %B	40% ACN	45% ACN
	Troca do solvente orgânico	40% ACN	50% MeOH
	Mistura de sol. Orgânicos	40% ACN	20% ACN + 25%MeOH
	Mudança pH (iônica)	ph = 2,5	pH = 3,5
	Mudança do íon-par	Não	25mM octano sulfonato
	Troca do tampão em conc. do tampão	25mM citrato	50 mM acetato
	Troca de aditivo	Não	10mM TEA
	Adição agente de complexação	Não 	10 mM nitrato de prata
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Mudança de Coluna.
		A natureza da coluna é sem dúvida um problema, assim a troca da marca da coluna pode trazer mudanças drásticas. 
	É importante ter sempre em mente que coluna estamos utilizando, pois C18 temos muitas por aí. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Assim:
	A natureza química ou a funcionalidade da fase ligada. (Ex. C18, fenil ou ciano).
	A quantidade de fase ligada por unidade de área das partículas de sílica. (Ex. 2 VS. 4mol/m2).
	A maneira com que a fase ligada é ligada com a sílica. (Ex. monofuncional VS. polifuncional reação com silanos)
	A natureza da superfície da sílica, entre vários fornecedores.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Devemos lembrar também que o método é, e sempre será validado para as condições do momento e em caso de mudança, estudos de equivalência de coluna deverão ser feitos. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Temperatura. 
	A temperatura, exceto para análises iônicas, não tem muito efeito na mudança de K e .
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Pratos Teóricos.
		Os pratos teóricos na coluna HPLC são um parâmetro que define a resolução. É um valor de grande importância na avaliação da performance do método. 
	Os números de pratos teóricos podem ser incrementados via uma série de fatores: 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
Colunas bem empacotadas.
Comprimento da coluna.
Baixos fluxos - mas não muito baixo.
Partículas pequenas - diminuição das partículas.
Baixa viscosidade da fase móvel a altas temperaturas.
Moléculas pequenas.
Efeitos extra coluna minimizados ao máximo.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	A performance da coluna pode ser definida em termos do valor de N (pratos teóricos), mas também de simetria de pico.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Porém normalmente utiliza-se a largura na meia altura.
				
	Se fizermos uma avaliação mais profunda a assimetria do pico tem influência, assim a fórmula fica:
Primeira parte

Crie agora seu perfil grátis para visualizar sem restrições.