CCD e Cromatografia em Coluna

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Atividade 4: Cromatografia em Camada Delgada (CCD) 
 
Objetivos: 
. Introduzir a técnica da cromatografia em camada delgada (CCD); 
. Estudar a fotoisomerização cis-trans do azobenzeno. 
 
Introdução ao Assunto: 
 
1) CROMATOGRAFIA 
 
Cromatografia é um processo de análise que se presta à purificação, separação, 
identificação ou doseamento de substâncias orgânicas e inorgânicas tendo como base a 
diferença de velocidade com que as substâncias se movem através de um meio poroso 
(fase estacionária) quando arrastadas por um solvente (eluente) em movimento. 
Acredita-se que o termo cromatografia foi utilizado pela primeira vez pelo 
bioquímico russo, Michael Tswett, quando em 1906, separou a clorofila de uma mistura 
de pigmentos vegetais. Ele utilizou uma pequena coluna de vidro empacotada com 
carbonato de cálcio em pó e então, eluiu a amostra com éter de petróleo. Quando a amostra 
migrou ao longo da coluna os componentes da mistura migraram com diferentes 
velocidades. Devido à natureza dos pigmentos da amostra, cada banda apresentava-se 
com uma cor diferente. Assim, o termo cromatografia derivou dos termos “cor” e 
“escrever”, a partir do grego (cromato, grafia). 
Separações ou análises cromatográficas podem ser feitas de acordo com os 
métodos a seguir. 
 
Cromatografia em papel monodirecional ascendente (cromatografia de partição em 
papel) 
Método elementar que consiste em gotejar a solução contendo a mistura a ser 
analisada próximo à extremidade de uma folha de papel de filtro sendo esta colocada em 
contato com o solvente que se encontra em um recipiente fechado (câmara 
cromatográfica), de maneira a facilitar a ascensão do solvente por capilaridade. O 
solvente passa sobre a mancha arrastando os componentes com velocidades diferentes. O 
sistema envolve o solvente, a mistura de compostos, o papel e a água (umidade) que está 
normalmente no papel. 
Na cromatografia em papel, algumas vezes desejável, para objetivos analíticos, 
deve-se obter os chamados valores de “fator de retenção” (Rf) que são calculados por 
meio da equação: 
 
d1
d2
=Rf =
distância percorrida pela substância
distância percorrida pelo eluente 
 
As distâncias percorridas pela substância, d1, e pelo eluente, d2, podem ser vistas na Figura 1. 
Quando a substância não se desloca ou quando ela se move junto com o solvente deve-se 
mudar a fase móvel (solvente) para se realizar a análise. 
 
2 
 
 
Figura 1: Desenho esquemático de uma cromatoplaca. 
 
Cromatografia em camada delgada 
Este método, introduzido por Stahl, usa uma placa de vidro (ou folha de plástico, ou 
folha metálica) revestida com uma fina camada de um material adsorvente (sílica, 
alumina, celulose, etc.) formando as cromatoplacas. A amostra a ser analisada é aplicada 
numa extremidade e o desenvolvimento do cromatograma deve ser feito em atmosfera 
saturada com o solvente empregado, numa cuba de eluição. Muitas das substâncias 
analisadas por este processo não são coloridas mas a cor pode ser desenvolvida 
momentaneamente por exposição do sistema à luz ultra-violeta, ou então estas substâncias 
incolores podem ser convertidas a derivados coloridos quando a cromatoplaca é 
pulverizada com um reagente apropriado (ex.: sulfato cérico) ou exposto à atmosfera de 
um reagente apropriado (ex. iodo) (Figura 2). 
 
 
 
Figura 2: Processo de aplicação (A), processo de eluição (B) e processo de revelação 
(C) de uma cromatoplaca. 
 
 
3 
 
Após a aplicação das substâncias na cromatoplaca elas irão interagir com a sílica. 
Após a eluição e revelação observa-se que substâncias com diferentes polaridades 
interagem de modo diferentes com a sílica, sendo que as substâncias mais polares ficam 
mais retidas do que as substâncias menos polares, uma vez que a sílica tem caráter polar. 
A ordem da eluição independe do solvente utilizado (substâncias polares sempre eluem 
depois que as menos polares, quando se utiliza sílica gel comum). Solventes mais polares 
deslocam as substâncias a uma distância maior do que solventes menos polares. 
A cromatografia em camada delgada apresenta algumas vantagens em relação à 
cromatografia em papel, tais como maior nitidez, alta sensibilidade, grande rapidez e 
ainda, a possibilidade do emprego de solventes e reveladores que são nocivos ao papel (à 
base de ácidos concentrados e complexos fortemente oxidantes) e de utilização de 
aquecimento até 300 0C; o que torna mais visível o cromatograma. A análise em CCD 
permite avaliar o grau de complexidade de uma mistura e a identificação de compostos 
através da comparação com amostra autêntica. 
Pode-se utilizar a CCD como um processo de separação de substâncias químicas. 
Nesse caso, a camada de adsorvente deve ser um pouco mais espessa, a cromatoplaca 
deve ser maior e é denominada cromatoplaca preparativa. 
 
Cromatografia em coluna 
Neste processo um tubo de vidro é empacotado com um material adsorvente. A 
coluna é colocada na posição vertical e a solução dos compostos passa de cima para 
baixo. A eluição é feita de modo a obter frações que podem conter mistura de compostos 
ou compostos puros (Veja Figura 3). Essa eluição normalmente é acompanhada por 
análise em CCD. 
 
 
Figura 3: Representação esquemática do processo de eluição em coluna cromatográfica. 
 
 
4 
 
Cromatografia gasosa 
Os componentes da mistura que estão sendo separados estão no estado de vapor 
quando eles passam através de uma coluna empacotada. Os vapores são arrastados através da 
coluna por um gás transportador, que é normalmente o hélio, o nitrogênio ou hidrogênio. O 
método é empregado primariamente para objetivos analíticos, embora equipamentos sejam 
disponíveis para separar pequenas quantidades de substâncias. Um registrador automático 
constrói um gráfico da concentração relativa versus o tempo de retenção na coluna. 
A cromatografia gasosa constitui um dos melhores recursos para se avaliar a 
pureza de uma substância química ou a complexidade de uma mistura. Acoplada ao 
espectrômetro de massas permite a caracterização e identificação de cada um dos 
componentes da mistura. 
 
2) FOTOISOMERIZAÇÃO DO AZOBENZENO 
 
Da mesma forma que os alquenos di-substituídos (não terminais) existem como 
isômeros cis e trans, os compostos com ligação dupla entre nitrogênios, denominados 
azocompostos e representados por R-N=N-R, também apresentam isomeria cis/trans. 
 
 
 CIS TRANS 
 
 As ligações duplas carbono-carbono são fortes e a isomerização cis-trans só é 
possível em condições muito energéticas. No entanto, os azo-derivados têm a ligação 
N=N, que é fotoquimicamente sensível na região do visível e leva facilmente à 
isomerização. 
 
Parte Experimental 
 
Materiais 
 
 
Béquer de 50 mL, tubos capilares, placas cromatográficas previamente preparadas, cubas 
de vidro, vidros de “penicilina”, iodo sólido, papel de filtro, espátula. 
Reagentes 
 
Tolueno, azobenzeno, benzidrol, benzofenona, acetona. 
 
H H
CH3H3C
NN
C6H5H5C6
NN
H5C6
C6H5
H CH3
HH3C
CIS TRANS
Alquenos 
Azobenzenos 
5 
 
Procedimentos 
 
PARTE I: Isomerismo cis-trans no Azobenzeno 
 
• Aplique, cuidadosamente e usando um tubo capilar, a 1,0-1,5 cm de altura da placa, uma 
gota de azobenzeno (conforme Figuras 1 e 2). Ao fazer a aplicação, cuide para gota de 
solução que na transferência do líquido o capilar não toque o adsorvente, fique o mais 
vertical possível e a mancha não ultrapasse a um diâmetro de 5mm. Faça a aplicação 
levando em conta que outra amostra será aplicada na mesma placa (aplique mais próximo 
a uma das bordas laterais). 
• Exponha a placa ao sol por pelo menos 15 minutos, levando-a para a parte externa do 
laboratório. 
• Verifique se o solvente a ser usado na eluição se encontra em cuba já preparada. Caso a 
cuba esteja seca, adicione o solvente de modo a atingir não mais que 1 cm de altura. A 
presença de um pedaço de papel de filtro permite saturarde vapor a cuba. Enquanto isso 
dê prosseguimento ao ítem 2 da parte experimental. 
• Após o tempo necessário de exposição ao sol, pegue a placa e faça uma segunda aplicação 
de azobenzeno na placa usando a solução que permaneceu no escuro e com o cuidado de 
não utilizar a mesma extremidade do capilar. 
• Introduza a placa na cuba de eluição (conforme Figura 3), tampe-a e deixe que o solvente 
suba até atingir uma altura correspondente a cerca de 1 cm abaixo da extremidade superior 
da placa. 
• Remova a placa para o exterior e marque, imediatamente, com auxílio de lapiseira ou 
outro material fino, a posição atingida pelo eluente (frente do eluente). Observe a diferença 
das posições e o número de manchas na cromatoplaca. Deixe o solvente evaporar, 
colocando a cromatoplaca na estufa, e meça as distâncias entre o ponto de aplicação da 
amostra e a frente do solvente, bem como do ponto de aplicação e o centro de cada uma 
das manchas para cálculo dos Rf`s. 
• Associe as manchas ao cis-azobenzeno e ao trans-azobenzeno. 
 
PARTE II: Identificação dos Compostos Benzidrol e benzofenona 
 
• Transfira uma pequena quantidade da substância A (uma pontinha de espátula) para um 
frasco pequeno (béquer ou vidro de penicilina) e adicione três gotas de acetona para 
dissolver a substância. Aplique a solução na placa, de modo que o ponto de aplicação 
esteja mais próximo a uma das bordas laterais da placa. Reabasteça o capilar e faça uma 
segunda aplicação no mesmo ponto. 
• Pegue um segundo frasco pequeno e de modo semelhante dissolva pequena quantidade da 
substância B em pequena quantidade de acetona. Aplique a nova solução num ponto mais 
próximo à outra borda lateral da placa e de modo que os dois pontos de aplicação não 
fiquem muito juntos (afastados cerca de 1 cm). 
• Proceda à eluição da placa com tolueno. Remova a placa, marque a frente do solvente, 
espere até a total evaporação do solvente (5-10 minutos numa estufa com temperatura 
apropriada) e, então, introduza a placa numa cuba reveladora (contendo iodo). Aguarde 
até a complexação do iodo para visualização das manchas. Remova a placa, contorne as 
manchas com auxílio de material pontiagudo (lápis por exemplo) e faça as medidas para 
o cálculo dos Rf`s. 
 
6 
 
• Associe as manchas ao Benzidrol e à Benzofenona, em função da polaridade. 
• Despreze o adsorvente no lixo, os capilares em local indicado pelo professor e lave o 
material utilizado. 
 
OOH
 
 Benzidrol Benzofenona 
 
Questionário: 
 
1. Em que consiste a técnica CCD? 
2. Em que situações CCD pode ser utilizada como técnica de separação/purificação? 
Justifique. 
3. Complete a tabela abaixo: 
Substância Estrutura Polaridade 
(ordem 
decrescente) 
Rf 
cis-azobenzeno 
 
 
trans-azobenzeno 
 
 
Benzidrol 
 
 
Benzofenona 
 
 
 
4. Qual azobenzeno foi utilizado na atividade? Justifique. 
5. Qual deles é o mais estável? Por quê? 
6. O que ocorreu durante a irradiação de luz? Equacione a reação química correspondente 
ao processo. 
7. Identifique as substâncias A e B. 
8. Como a confirmação da identidade dessas substâncias poderia ser feita, utilizando 
CCD? 
 
Bibliografia Recomendada: 
 
SHRINER, R.L.; Fuson, R.C.; Cutin, D.Y. - Identificação sistemática dos compostos orgânicos: 
manual de laboratório. 6a edição. Rio de Janeiro, Guanabara Dois, 1983. 
COLLINS, Carol H.; Braga, Gilberto L.; Introdução a Métodos Cromatográficos, Campinas, 
Editora da Unicampi, 1987. 
STAHL, E.; Thin-Layer Chromatography: A Laboratory Handbook, 6ª reimp. da 2ª ed., Springer-
Verlag: New York, 1990; 
 
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Atividade 5: Cromatografia em Coluna (CC): Extração e 
Fracionamento de Pigmentos Vegetais 
 
Objetivos 
 
. Introduzir a técnica da cromatografia de adsorção em coluna; 
. Extrair pigmentos vegetais e fracioná-los por meio de CC. 
 
Observação: O grupo deve providenciar ~10 g de folhas de espinafre verde para 
realização deste experimento. 
 
Introdução ao assunto 
 
A cromatografia é um método físico-químico de análise que se presta à 
purificação, separação, identificação e quantificação de substâncias orgânicas e 
inorgânicas. Esta técnica fundamenta-se na migração diferencial dos componentes de 
uma mistura em um meio poroso (fase estacionária) quando arrastados por um solvente 
(fase móvel). Os componentes da mistura movem-se com o solvente, pela coluna, com 
velocidades diferentes, dependendo de vários fatores, tais como a natureza de cada 
substância, a natureza do solvente e a atividade do adsorvente. A separação dos 
constituintes de uma mistura baseia-se na interação dos componentes da amostra e do 
solvente com a superfície do adsorvente. Um adsorvente sólido ativo tem uma grande 
área superficial, dispondo de inúmeros sítios polares que podem se combinar 
reversivelmente ou adsorver pequena concentração de substâncias, através de forças de 
atração eletrostática. O solvente movendo-se pela superfície do adsorvente compete com 
a amostra adsorvida e com o adsorvente, e então desloca seus constituintes 
reversivelmente e continuamente. 
Este processo pode ser visualizado como uma competição entre a amostra, o 
solvente e o adsorvente e pode ser expresso pelo equilíbrio a seguir: 
 
 
 
Compostos polares ou polarizáveis, tais como alcoóis, ácidos carboxílicos, amidas 
e aminas, são adsorvidos mais fortemente e eluídos menos prontamente do que compostos 
menos polares, tais como compostos halogenados, aldeídos, cetonas, éteres e apolares 
como hidrocarbonetos. 
A atividade do adsorvente sólido também determina a velocidade com que as 
substâncias são eluídas. A atividade é determinada pelo seu conteúdo de água e pela 
granulação das partículas. 
O solvente empregado também afeta a eluição. Solventes pouco polares são 
empregados para substâncias fracamente adsorvidas enquanto solventes polares são para 
aquelas fortemente adsorvidas. A ordem da eluição independe do solvente utilizado 
(substâncias polares sempre eluem depois que as substâncias apolares, quando o 
adsorvente usado é a sílica gel comum). 
 
Amostra-Adsorvente  Solvente  Amostra-Solvente 
8 
 
Alguns solventes comumente utilizados estão listados a seguir na ordem de 
aumento da polaridade. 
Hexano [CH3(CH2)4CH3] 
Diclorometano [CH2Cl2] 
Clorofórmio [CHCl3] 
Éter etílico [CH3CH2OCH2CH3] 
Acetona [CH3COCH3] 
Acetato de etila [CH3COOCH2CH3] 
Etanol [CH3CH2OH] 
Metanol [CH3OH] 
Água [H2O] 
 
 
Figura 1: Ilustração da separação de duas substâncias em uma coluna cromatográfica 
utilizando-se sílica-gel como adsorvente. 
 
Faremos uso da presente atividade para ilustrar os fundamentos da cromatografia 
de adsorção em coluna num processo de extração e fracionamento de pigmentos vegetais. 
Serão isoladas misturas de carotenos e de clorofilas, pigmentos comuns em folhas verdes. 
 
 
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Parte Experimental 
 
Materiais 
 
Coluna com torneira, algodão, folhas de espinafre, água destilada, papel absorvente, Sílica Gel 
60, pipeta conta-gotas, erlenmeyer de 125 mL, proveta de 25 mL, bastão ou tubo de vidro, 
béqueres de 50 e 250 mL, almofariz com pistilo, suporte, garras e mufas, espátula, tela de 
amianto, aro ou tripé, bico de gás, conjunto para evaporador rotatório, funil de haste longa, 
bastão de vidro com borracha. 
 
Reagentes 
 
Folhas de espinafre, água destilada, sílica Gel 60, hexano, acetona. 
Procedimentos 
 
1) Empacotamento da coluna 
Fixe a coluna de vidro verticalmente em um conjunto suporte. Feche a torneira, 
transfira cerca de 10 mL de hexano e introduza um pequeno chumaço de algodão até a 
conexão do corpo do tubo com a torneira. 
Adicione uma suspensão contendo cerca de 5g de sílica e hexano (aproximadamente 
10 mL). Abra a torneira e deixe escoar o líquido (NUNCA DEIXE A COLUNA SECAR). 
Após a completa transferência da suspensão, continue recolhendo solvente para acertaro 
enchimento até que o nível de solvente atinja aproximadamente 3 cm acima do topo da 
fase estacionária. 
Feche a torneira e tampe a coluna enquanto prepara a mistura a ser analisada. 
2) Preparo do extrato 
Pese 10 g de folhas de espinafre, remova as nervuras centrais. Ferva as folhas em 100 
mL de água destilada, por 2 minutos, num béquer de 250 mL. Despreze a água na pia, 
resfrie rapidamente as folhas utilizando água gelada e enxugue-as utilizando papel 
absorvente. 
Triture as folhas em almofariz com 15 mL de uma mistura de acetona e hexano 
(1:1) até obter uma solução verde. Transfira a solução para um béquer pequeno. 
Adicione aproximadamente 2 pontas de espátulas (tipo canoa) de sílica ao béquer, 
para incorporar o extrato. Deixe o solvente secar completamente, para isto coloque o 
béquer em uma manta ou placa de aquecimento ou banho maria, agitando sempre com 
o bastão para não projetar. 
 
3) Eluição da coluna cromatográfica 
 
Com a torneira da coluna ainda fechada, coloque o extrato no topo da coluna com a 
ajuda de um funil de haste longa. Adicione um pouco de hexano utilizando pipeta conta-
gotas de modo a lavar a parede da coluna. Abra a torneira até o solvente atingir novamente 
o topo. 
Feche a torneira, coloque eluente (hexano) na coluna para proceder à eluição 
(preencher com eluente 5 cm da coluna acima do topo por vez). 
Abra a coluna e continue a recolher o solvente no mesmo frasco até que a primeira 
banda colorida esteja bem próxima a torneira (Fração I). 
1 0 
 
Substitua o frasco de coleta e recolha esta banda colorida (Fração II) até o eluente 
perder a cor. 
Substitua novamente o frasco coletor, aguarde o solvente atingir o topo do recheio e 
substitua o eluente por acetona, continue recolhendo o eluente no mesmo frasco até que 
a segunda banda colorida esteja bem próxima a torneira (Fração III). 
Substitua então o frasco coletor novamente e recolha a segunda banda colorida 
(Fração IV). 
Compare as cores dos eluatos obtidos (Fração II e Fração IV). Transfira todas as 
frações recolhidas para frascos devidamente identificados na capela. 
Remova o adsorvente da coluna deixando-o em local indicado. Despreze os restos 
de folha no lixo e lave todo o material. 
 
Questionário: 
 
1) Consulte na literatura as estruturas dos carotenos e das clorofilas. 
2) Considerando que os carotenos apresentam cores próximas do amarelo enquanto as 
clorofilas são verdes, avalie as polaridades das misturas obtidas e identifique o 
conteúdo das mesmas. 
3) Correlacione a polaridade com a estrutura química dos componentes da mistura. 
4) Um aluno leu rapidamente o procedimento experimental e começou esta prática, no 
entanto, ao invés de utilizar inicialmente o hexano, ele confundiu e começou a coluna 
com acetona. Discuta o que você acha desta troca de eluentes. 
5) Suponha que você tenha uma mistura de três substâncias orgânicas, sendo todas 
sólidas: um álcool, um hidrocarboneto saturado e uma cetona. Proponha uma 
separação cromatográfica destas substâncias utilizando sílica-gel como adsorvente e 
os eluentes que achar necessário. 
6) Faça uma pesquisa sobre outros adsorventes que podem ser utilizados em métodos de 
separação por cromatografia em coluna, mostrando qual a diferença entre eles. 
 
Bibliografia Recomendada: 
SHRINER, R. L.; FUSON, R. C.; CUTIN, D. Y. Identificação sistemática dos compostos 
orgânicos: manual de laboratório. 6. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Dois, 1983. 
VOGEL, A. I. Química orgânica. Análise orgânica qualitativa. 3. ed.. Rio de Janeiro: Ao Livro 
Técnico e Científico, 1971-1985. v. 1, 2, 3. 
COLLINS, Carol H. & BRAGA, Gilberto L., Introdução a Métodos Cromatográficos, 1987.