Prática 3

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE - FURG 
ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS - EQA 
BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL 
 
 
 
 
 
 
 
 
Prática 3: 
EXTRAÇÃO, ISOLAMENTO E DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DO 
ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLÉICO (DNA) DE TECIDOS VEGETAIS 
 
 
 
 
Júlia Gonzalez - 86756 
Lisliane Kickofel - 71591 
Simone Soares - 47475 
 
 
 
Profª.: ​​Márcia Luvielmo 
 
 
 
 
 
Rio Grande 
 2018 
1. INTRODUÇÃO 
 
 DNA é a sigla da molécula da vida. O ácido desoxirribonucleico (DNA) é um 
dos ácidos nucleicos que constituem o material genético da maioria dos seres 
vivos. Os ácidos nucleicos são polímeros formados por nucleotídeos, que é um 
grupamento fosfóricos (fosfato), glicídio (monossacarídeo/pentose) e uma base 
nitrogenada (SÓ BIOLOGIA). 
 
 
Figura 1.1. ​​Representação do nucleotídeo 
 
 As bases nitrogenadas que compõem o DNA são as responsáveis pela 
codificação das informações genéticas de cada célula. O açúcar e o grupo fosfato 
são responsáveis pela função estrutural (KOMSKI, 2018). ​O ADN é presente no 
núcleo dos eucariotas e disperso no hialoplasma dos procariotas. Os ácidos 
nucleicos podem ser de dois tipos:DNA e RNA. O RNA significa ácido ribonucleico 
e também está relacionado ao mecanismo de controle celular e transmissão 
hereditária das características (SÓ BIOLOGIA). 
 A partir de pesquisas feitas em laboratório e utilizando resultados de 
complexa técnica de difração de raio X, Watson e Crick concluíram que no DNA, as 
cadeias complementares são helicoidais, sugerindo uma escada retorcida. Nessa 
escada, os corrimãos são formados pelos fosfatos e os açúcares, enquanto os 
degraus são as bases nitrogenadas (SÓ BIOLOGIA). 
 Em cada fita do DNA o corrimão é interligado por moléculas de açúcares e 
radicais fosfatos. As duas cadeias são unidas uma à outra por pontes de 
hidrogênios, que se formam entre duas bases nitrogenadas de cada fita. O 
pareamento das bases acontece de forma exata: uma base púrica (adenina (A), 
guanina (G)) se liga a uma pirimídica (timina (T), citosina (C)) (SÓ BIOLOGIA). ​O 
ADN pode ser observado na figura 1.2. 
 No corrimão, uma zona de ligações entre os açúcares e os fosfatos é uma 
zona hidrofílica, enquanto em contraste com os degraus, é uma zona hidrofóbica, 
onde se encontram as bases nitrogenadas. 
 
 
 
 
Figura ​1.2.​​ Representação da molécula de ADN 
 
A biologia molecular é a área da biotecnologia que surgiu a partir da dedução 
da estrutura tridimensional da molécula de ácido desoxirribonucléico (DNA) e 
envolve diversos princípios e técnicas que permitem analisar o material genético 
dos organismos. O desenvolvimento da biologia molecular permitiu diversas 
aplicações, como o diagnóstico de doenças genéticas e patologias, o 
melhoramento genético animal e vegetal, e a genética forense. Neste capítulo, 
estão descritas as principais técnicas de biologia molecular utilizadas na obtenção, 
manipulação e análise de DNA, bem como os principais tipos de análises 
realizadas no diagnóstico de doenças, na determinação de paternidade e no auxílio 
à elucidação de crimes (NONOHAY E HEPP). 
Existem vários protocolos de extração de DNA e RNA descritos na literatura, 
e a escolha do mais adequado deve levar em consideração a molécula desejada 
(DNA e/ou RNA), o tipo de amostra, o grau de pureza e o rendimento desejado, 
além da disponibilidade de recursos para a sua realização. O conhecimento a 
respeito das características dos organismos envolvidos, como suas especificidades 
e a localização das moléculas de ácidos nucleicos, é importante para o 
planejamento dos procedimentos a serem utilizados, visando às aplicações 
específicas posteriores (NONOHAY E HEPP). 
A lise celular envolve o rompimento das células e deve ser realizada em 
soluções tamponadas, geralmente contendo um detergente e os reagentes 
tris-hidroximetil aminometano (Tris), cloreto de sódio (NaCl) e ácido etileno diamino 
tetra-acético (EDTA). O detergente atua sobre os lipídios, promovendo o 
rompimento das membranas e a liberação do conteúdo celular​. ​O reagente Tris 
mantém o pH da solução tampão de lise estável (próximo a 8,0), evitando que o 
DNA, ao ser liberado, sofra o ataque das enzimas desoxirribonucleases (DNases) 
endógenas que o degradam, as quais atuam em pH ótimo de 7,8. A adição do 
agente quelante EDTA também auxilia na inibição da ação das DNases por se ligar 
aos cofatores Ca​+2 e Mg​+2 da enzima DNase. O NaCl contribui rompendo ligações 
iônicas das cadeias peptídicas, auxiliando na desnaturação das proteínas e 
adicionalmente promove a aglomeração das moléculas de DNA ​(NONOHAY E 
HEPP). 
Em condições de baixa temperatura e elevada concentração salina (devido 
ao NaCl presente no tampão de lise), a adição de etanol absoluto, isopropanol ou 
soluções acetatos de amônio ou sódio resulta na precipitação do DNA, o que forma 
em solução um aglomerado de filamentos esbranquiçados que podem ser 
“pescados” com um bastão de vidro ou concentrados no fundo do tubo por 
centrifugação. Geralmente a lavagem do DNA é realizada com etanol 70% para a 
remoção dos sais, detergentes e de outras impurezas. Após a secagem por 
evaporação, o DNA é solubilizado preferencialmente em solução tampão TE 
(Tris-HCl e EDTA) (NONOHAY E HEPP). 
Já o teste de Molisch é um teste químico sensível para a presença de 
carboidratos. Este teste baseia-se na desidratação do carboidrato pelo ácido 
sulfúrico ou pelo ácido clorídrico, dando origem a um aldeído, que sofre 
condensação com duas moléculas de fenol (normalmente o α-naftol, mas também 
podem ser outros fenóis, como resorcinol ou timol), resultando em compostos com 
cor vermelha ou púrpura. A solução teste é combinada com uma pequena 
quantidade de reagente de Molisch (α-naftol dissolvido em etanol). Depois de 
misturado o reagente, adiciona-se lentamente, pelas paredes do recipiente 
(inclinando o recipiente), uma pequena quantidade de ácido sulfúrico concentrado, 
sem mexer a mistura, de forma a criar uma interface. Uma reação positiva 
corresponde ao aparecimento de um anel de cor púrpura na interface 
(RODRIGUES, 2014). 
Todos os carboidratos – monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos 
– devem levar a testes positivos. ácidos nucleicos e glicoproteínas também podem 
dar resultados positivos, dado possuírem carboidratos, os quais são hidrolisados 
por ácidos minerais fortes. As pentoses são desidratadas a furfural, enquanto que 
as hexoses são hidrolisadas a ​5-hidroximetilfurfural​. Qualquer um destes aldeídos, 
quando presentes na solução teste, condensam-se com duas moléculas de naftol, 
formando um produto com coloração púrpura (RODRIGUES, 2014). 
A quantificação de DNA por espectrofotometria é realizada por medição da 
quantidade de luz absorvida pelo DNA em solução no comprimento de onda de 
260 nm. Quanto maior for a absorção de luz nesse comprimento de onda, maior a 
concentração de DNA na solução. Assim, sabendo que o valor de absorbância (A) 
de 1,0 corresponde a uma concentração de 50 µg de DNA (fita dupla) por mililitro 
(mL), é possível calcular a concentraçãodo DNA obtido das amostras (NONOHAY 
E HEPP). 
 
2. OBJETIVO 
 
Os objetivos da aula prática é a demonstração de uma técnica geral de 
extração do ADN de algum tecido e revisar os componentes estruturais das células 
https://www.fciencias.com/2014/09/25/hidroximetilfurfural-hmf-molecula-da-semana/
e as reações químicas dos componentes dos ácidos nucléicos, assim como a 
determinação da concentração do ADN extraído e a sua pureza. 
 
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
3.1 Materiais 
 
● Tecidos vegetais; 
● Proveta de 500 mL; 
● Detergente neutro; 
● EDTA 10 mM; 
● Sal de cozinha (NaCl, 10 mM); 
● Recipiente para banho de gelo; 
● Erlenmeyer; 
● Algodão; 
● Tubos de ensaio; 
● Pêra de sucção; 
● Pipetas de 2 mL e 5 mL; 
 
● Álcool etílico 95% (gelado: -4 a 8 
°C); 
● Béqueres; 
● Água destilada; 
● Ácido sulfúrico concentrado; 
● Solução de xilose 0,01%; 
● Tampão Tris-HCl 0,01 M pH 8; 
● Reagente de Molish: 
➔ Dissolver 5 g de - naftol em 50 α 
mL de álcool. 
● Espectrofotômetro. 
3.2 Métodos 
 
3.2.1 Extração do ADN 
 
Pesou-se em torno de 100 g de morango e cortou-se em quadrados (5 mm). 
Em uma proveta de 500 mL, colocou-se 100 mL de detergente neutro e 15 g de 
NaCl e completou-se com água destilada. 100 mL dessa solução preparada foi 
colocada em um béquer e adicionou-se o morango cortado, o qual foi 
homogeneizado uniformemente com um bastão de vidro. Essa mistura foi colocada 
em banho-maria a 60 °C durante 20 minutos com agitação e logo após resfriada 
em um banho de gelo, agitando sempre (5 a 10 minutos). Num erlenmeyer, com 
auxílio de um funil e algodão, filtrou-se a amostra, que após foi colocada em 5 
tubos de ensaio, um volume de 3 mL e também adicionou-se lentamente 3 mL de 
álcool etílico 95% gelado, no qual observou-se o que ocorria. 
 
3.2.2 Verificação da presença de DNA 
 
Enrolou-se o DNA dos tubos 1 e 2 em um bastão de vidro e transferiu-se 
ambos para outro tubo de ensaio contendo 2 mL de água destilada para solubilizar 
o DNA Em outro tubo de ensaio adicionou-se 2 mL de solução de açúcar tipo 
pentose. Aos dois tubos, adicionou-se 0,5 mL do reagente de Molish e 
cuidadosamente foi adicionado 2 mL de ácido sulfúrico pela parede do tubo, sem 
agitação. 
 
Figura 1. ​​Foto retirada da prática experimental 
 
3.2.3 Determinação da concentração de DNA 
 
O DNA foi enrolado em um bastão dos tubos 3 e 4 e transferiu-se para 
outros 2 tubos de ensaio, contendo 2 mL de tampão Tris-HCl, 2 mL de EDTA e 2 
mL de NaCl em cada. O material foi deixado em repouso em uma geladeira, após a 
amostra foi centrifugada e determinou-se a absorbância do sobrenadante à 260 e 
280 nm. 
 
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
Para a realização dessa prática utilizou-se amostras de morango e kiwi, no 
qual as absorbâncias obtidas a 260 e 280 nm no espectrofotômetro pode ser 
observada da tabela 4.1. 
 
Tabela 4.1.​​ Absorbâncias obtidas para as amostras em 260 a 280 nm, com o 
branco (0,075) já descontado 
Amostra Morango ​(1) Kiwi ​(1) Morango​ (2) Kiwi ​(2) 
Absorbância 
a 260 nm 
0,133 
0,102 
0,05 
0,0,42 
0,064 
0,056 
0,023 
0,056 
Média 0,118 0,046 0,060 0,040 
Absorbância 
a 280 nm 
0,132 
0,100 
0,059 
0,046 
0,084 
0,070 
0,042 
0,062 
Média 0,116 0,053 0,077 0,052 
 
Ao saber que uma unidade de absorbância a 260 nm (A260 = 1) 
corresponde à 50 ​µg mL​-1 de DNA, foi possível calcular a concentração em cada 
uma das amostras. 
 
Morango ​(1) 
50 ​µg mL​-1​ 1 
x 0,118 
x = 5,9​ ​µg mL​-1 
 
Morango ​(2) 
50 ​µg mL​-1​ 1 
x 0,060 
x = 3 ​µg mL​-1 
Kiwi ​(1) 
50 ​µg mL​-1​ 1 
x 0,046 
x = 2,3 µg mL​-1 
 
Kiwi ​(2) 
50 ​µg mL​-1​ 1 
x 0,040 
x = 2 µg mL​-1 
 
Por fim, para calcular a pureza de cada amostra, calculou-se a razão entre 
as absorbâncias, ou seja, dividiu-se a absorbância obtida em 260 nm pela obtida 
em 280 nm. Obtendo os valores, observados na tabela 4.2. 
 
Tabela 4.2.​​ Razão entre as absorbâncias 
Amostra Morango ​(1) Kiwi ​(1) Morango​ (2) Kiwi ​(2) 
Média 1,02 0,88 0,78 0,77 
 
Uma amostra de DNA, considerada pura apresenta a razão entre 1,8 a 2. 
Caso essa razão for menor, como é o caso, possivelmente há a presença de 
contaminação, como as proteínas. Valores acima de 2, a contaminação se dá 
devido a presença de fenóis ou outros contaminantes que absorvem fortemente em 
280 nm ​(PALMA ​et al. ​2017). ​A amostra com maior pureza, foi a amostra que 
obteve-se uma melhor extração, porém com os resultados é possível observar que 
todas possuem alguma contaminação. 
 
5. CONCLUSÃO 
 
Com o experimento foi possível verificar a eficiência da técnica para a 
extração, verificação e determinação da concentração e pureza das amostras 
utilizadas, como o morango e o kiwi. Sendo o morango, o que teve a melhor 
extração e pureza, mesmo com algumas contaminações. 
 
6. ANEXOS 
 
6.1. QUESTÕES 
 
1. Que tipo de composto presente na parede celular dos vegetais prejudica a 
extração? E qual facilita? Explique e dê exemplos. 
2. Explique o que ocorreu após a adição de álcool etílico durante a extração de 
DNA. 
3. Por que é utilizado o reagente de Molish na verificação da presença de DNA no 
extrato vegetal? 
4. Qual é a função do tampão, EDTA e NaCl na determinação da concentração de 
DNA? 
5. Por que a determinação da pureza é realizada com leituras da amostra nos 
comprimentos de onda de 260 e 280 nm? 
 
6.2. RESPOSTAS 
 
1. A pectina pode prejudicar a extração. Um fator que pode facilitar a extração (no 
caso de amostras de frutas) é prestar atenção na maturação da fruta. É ideal 
que a maturação esteja mediana e que a fruta não esteja nem muito verde e 
nem muito madura, pois estes fatores dificultam a extração. 
 
2. O álcool etílico desidrata o DNA e a molécula não fica mais dissolvida no meio 
aquoso. Como o DNA não é solúvel em álcool, suas moléculas ficam 
agrupadas, e por ter menor densidade que os outros constituintes celulares, ele 
surge na superfície do extrato. 
 
3. O reativo de Molish é importante na etapa de verificação do DNA. As pentoses 
adicionadas formam o furfural, que reagem com o reativo de Molish e formam 
um anel na interface das duas soluções. 
 
4. A função da solução tampão é deixar o pH do sistema estável. O EDTA é um 
agente quelante que tem como função quelar os cátions divalentes, integrando 
a molécula de DNA. O NaCl proporciona um ambiente favorável para a extração 
porque o sal, depois de ser dissolvido em água, se dissocia e contribui com 
íons positivos que neutralizam a carga negativa do grupo fosfato do DNA. Com 
isso, as moléculas de DNA não sofrem mais repulsão de cargas entre si, o que 
favorece a sua aglomeração. 
 
5. Porque o DNA absorve luz no comprimento de onda igual a 260 nm, enquanto 
as proteínas absorvem luz no comprimento de onda igual a 280 nm. Logo, com 
a razão entre as duas absorbâncias obtidas sabe-se a pureza da amostra. Se a 
razão entre as duas absorbâncias for menor que 1,8, há muita contaminação de 
proteína na amostra. 
 
7. REFERÊNCIAS 
 
1. ​A duplicação do DNA. Disponível em: 
<https://www.sobiologia.com.br/conteudos/Citologia2/AcNucleico3.php>. Último 
acesso: 12/10/18 
 
2.KOMSKI, Lisa. ​10 métodos de extração de DNA​​. Disponível em: 
<http://pt.wakolatinamerica.com/blog/post/10-metodos-de-extracao-de-dna/>. 
Último acesso: 14/10/2018. 
 
3. DHALIWAL, Anandika. ​Extração e purificação de DNA. Disponível em: 
<https://www.labome.com/method/DNA-Extraction-and-Purification.html>. Último 
acesso: 12/10/2018. 
 
4. SOUZA, Karina. Caracterização de carboidratos: teste de Molisch. Disponível 
em: <http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_ch/molisch.htm>. 
Último acesso: 14/10/2018. 
 
5.NONAHAY, Juliana Schmitt de e HEPP, Diego. Capítulo 1: Técnicas e análises 
de biologia molecular. ​​Disponível em: 
<http://srvd.grupoa.com.br/uploads/imagensExtra/legado/B/BRUNO_Alessandra_N
ejar/Biotecnologia_II/Lib/Amostra.pdf> 
 
6. PALMA, Bianca Fogazza ​et al. ​​SISTEMÁTICA DE EXTRAÇÃO DE DNA PARA 
ESTUDOS VIA ESPECTROSCOPIA RAMAN.​​ Disponível em: 14/10/18 
<http://www.inicepg.univap.br/cd/INIC_2007/trabalhos/engenharias/inic/INICG0032
6_01O.pdf> 
 
7. RODRIGUES, João. ​Teste de Molisch. ​​Disponível em: 
<https://www.fciencias.com/2014/10/30/teste-de-molisch-laboratorio-online/>