Enzimas: Proteínas Catalisadoras

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Enzimas
Introdução
Praticamente todas as reações no corpo são mediadas por enzimas, as quais são proteínas catalisadoras que aumentam a velocidade das reações, sem sofrerem alterações no processo global. Dentre as muitas reações biológicas que são energeticamente possíveis, as enzimas seletivamente canalizam restantes (chamados substratos) para rotas úteis. As enzimas direcionam, assim, todos os eventos metabólicos.
Histórico
· Catalisadores - utilizados por mais de 2.000 anos na produção do vinho, queijo e pão
· A catálise foi reconhecida e descrita em 1.700 através dos estudos da digestão da carne pelas secreções estomacais.
· Em 1.835 Berzelius sugeriu que pequenas quantidades de determinadas substâncias poderiam afetar o curso de reações químicas - força catalítica.
· Pasteur (1.850) descobriu que a fermentação do açúcar produzindo álcool pela levedura era catalisada por fermentos.
· Kühne (1.878) propôs que o termo enzima fosse usado
· Oswald (1.894) - propôs que catalisadores eram substâncias que aceleravam a velocidade de reações químicas sem serem consumidas.
· Fischer (1.894) - determinou a especificidade enzimática, que originou o modelo da chave fechadura.
· Northrop e Stanley (1.930) comprovaram que eram proteínas, estudando a pepsina, tripsina e quimotripsina.
· Início do século XX - haviam 75 enzimas isoladas e cristalizadas, atualmente + de 2.000 são conhecidas.
Aplicações
· preparação do leite de soja (proteases);
· produção do etanol da cana e bebidas (sacarase);
· produção de queijo - coagulação da caseína (lactase);
· produção de sorvete – impede a cristalização da lactose (lactase);
· remoção da lactose do leite (lactase) - permitindo o uso por pessoas com deficiência de lactase intestinal;
· produção de ração de animais - lactase.
Nomenclatura
· Nome Recomendado: 
· sufixo “ase” + substrato da reação ou ação realizada 
· ex: glicosidase e adenilato-ciclase 
· Nome Sistemático: 
· enzimas divididas em 6 classes 
· descrição da reação + ase 
Propriedades das Enzimas
· catalisadores proteicos que aumentam a velocidade de uma reação química 
· não são consumidos durante a reação que catalisam
· Alguns tipos de RNA podem atuar como enzimas, geralmente catalisando a quebra e a síntese de ligações fosfodiéster → ribozimas 
Sítio ativo 
· As moléculas de enzimas contêm uma região específica formando uma fenda ou bolso, que é chamada sítio ativo
· contêm cadeias laterais de aminoácidos → superfície tridimensional complementar ao substrato
· o sítio ativo liga o substrato formando um complexo enzima-substrato (ES) 
· complexo enzima-substrato (ES) → enzima-produto (EP) → enzima e produto 
Especificidade
· As enzimas são altamente específicas, interagindo com um ou alguns poucos substratos e catalisando apenas um tipo de reação química.
· estereoespecificidade: sítio de ligação do substrato de algumas enzimas reconhece os isômeros óticos (d) e (l) de um mesmo composto.
· grau: 
· relativa ou de grupo - vários substratos com estrutura semelhante 
· absoluta - atua sobre um único substrato
Co-fatores
· Algumas enzimas se associam com um co-fator não-protéico, o qual é necessário para a atividade enzimática. 
· íons metálicos: tais como Zn ou Fe
· moléculas orgânicas, conhecidas como coenzimas, que freqüentemente são derivadas de vitaminas
· enzima (apoenzima) + co-fator = holoenzima 
· geralmente a apoenzima não apresenta atividade metabólica 
· grupo prostético: coenzima firmemente ligada a enzima que não se dissociam(biotina -carboxilases) 
Regulação
· as enzimas podem ser ativadas e inibidas de modo que a velocidade de formação do produto responsa às necessidades da célula
Localização
· muitas enzimas estão localizadas em organelas específicas dentro das célula: 
· compartimentalização - serve para isolar o substrato ou o produto da reação de outras reações competitivas 
Classificação
Funcionamento das Enzimas 
· alterações de energia 
· diminui energia de ativação da reação 
· sítio ativo facilita quimicamente a catálise 
Velocidade da reação
· Para as moléculas reagirem, devem conter energia suficiente para superar a barreira de energia do estado de transição.
· a velocidade da reação é determinada pelo número de moléculas energizadas. 
· quanto menor a energia de ativação mais moléculas têm energia suficiente para superar o estado de transição e assim, mais rápida é a reação 
Fatores que afetam velocidade da reação
· concentração do substrato
· temperatura
· pH 
· concentração de co-fatores
· tempo de contato
velocidade = nº de moléculas de substrato/tempo
Concentração do substrato
· a velocidade da reação aumenta conforme a concentração do substrato,até uma velocidade máxima (Vmax)
· o limite deve-se a saturação pelo substrato de todos os sítios de ligação 
· Cinética de Michaelis-Menten: 
· curva de velocidade inicial (Vo) contra a concentração do substrato [S] → hipérbole 
· enzima alostéricas → curva sigmóide 
· enzimas reguladas por ligação não-covalente
· sofrem grandes alterações 
Temperatura
aumento da velocidade com a temperatura:
· a velocidade da reação aumenta com a temperatura até um pico de velocidade ser atingido → temperatura ótima
diminuição da velocidade com a temperatura:
· uma elevação maior da temperatura resulta em redução da velocidade, como resultado da desnaturação da enzima 
pH
ionização do sítio ativo:
· a reação pode requerer que a enzima e o substrato tenham determinados grupos químicos ionizados ou não ionizados. 
· como: -NH3
desnaturação da enzima:
· valores extremos de pH levam a desnaturação de enzimas 
· a estrutura da enzima depende do caráter iônico das cadeias laterais de aminoácidos
pH ótimo:
· o pH no qual a atividade máxima da enzima é atingida difere para cada enzima e normalmente reflete a [H+] na qual a enzima funciona no organismo
· ex: pepsina - estômago - pH 2 
Equação de Michaelis-Menten
modelo da reação
enzima + substrato → enzima-substrato → enzima + produto
k1, k-1 e k2 são as constantes de velocidade 
equação de Michaelis-Menten
· a concentração de substrato [S] é muito maior do que a concentração de enzima [E]
· a velocidade de formação de ES é igual a de degradação → estado de equilíbrio
Considerações:
características de Km
· Km é característico de uma enzima e de um determinado substrato seu e refletem sua afinidade 
· Km é numericamente igual à concentração do substrato [S] na qual a velocidade da reação é igual a Vmax/2 
· Km não varia com a concentração da enzima 
· Km baixo: Km pequeno significa uma ALTA afinidade da enzima pelo substrato (atinge mais rápido) 
· Km alto: Km elevado significa uma BAIXA afinidade da enzima pelo substrato 
relação velocidade e concentração da enzima
· a velocidade da reação é diretamente proporcional à concentração da enzima em qualquer concentração substrato 
 Ordem de reação → 
Gráfico de Lineweaver-Burke
· utilizado para calcular Km e Vmax 
· sinônimo: gráfico dos duplos-recíprocos
· equação obtém uma linha reta: 
Inibição da Atividade Enzimática
· qualquer substância que diminua a velocidade de uma reação catalisada por enzima é chamado de inibidor 
Inibidores reversíveis
· ligam-se a enzimas por ligações não-covalentes
· diluição: recuperação da atividade enzimática 
· base da terapia antiviral e antibiótica 
	Inibidores irreversíveis
· diluição: não recupera a atividade enzimática 
· compostos organofosforados, DFP (diisopropil flúorfosfato), gases dos nervos (tabun, sarin e soman), inseticidas (paration, fention, malation diazinon) - efeitos neurotóxicos;
· íons de metais pesados (Ag+, Hg++)
Inibição Competitiva 
· inibidor liga-se reversivelmente ao mesmo sítio que o substrato ocuparia, então compete com o substrato por esse sítio
efeitos:
· o efeito de um inibidor competitivo é revertido pelo aumento da [S]
· reação pode atingir Vmax com excesso de substrato
· na presença de um inibidor competitivo, mais substrato é necessário para atingir Vmax/2 
· inibidor competitivo aumenta o Km aparente
exemplos: 
· sulfanilamida, antiretrovirais análogos denucleosídios ou nucleotídios (AZT, ddI, ddC anti-HIV) 
· anti-inflamatórios não-esteróides-AINE (aspirina, ibuprofeno).
· drogas anti-hiperlipidêmicas inibem a síntese do colesterol
· hidroximetilglutaril-CoA-redutase (HMG-CoA-redutase) - enzima
· estatinas, tais como a atorvastatina (Liptor) e a sinvastatina (Zocor) - inibidoras 
· Curva de Lineweaver-Burke
· curvas da reação inibida e não-inibida interceptam o eixo do y em 1/Vmax (Vmax não é alterada).
· as reações inibida e não-inibida interceptam o eixo do x em pontos diferentes, indicando que o Km aparente é aumentado na presença do inibidor competitivo
Inibição Não-Competitiva
· acontece quando o inibidor e o substrato ligam-se a sítios diferentes na enzima
· o inibidor pode ligar-se tanto à enzima livre quanto ao complexo ES, impedindo a reação
Exemplos
· chumbo - ligações covalentes - cisteína 
· ferroquelatase 
· inseticidas - acetilcolinesterase - acetilcolina
Efeitos:
· inibidores não competitivos diminuem a Vmax da reação 
· não pode ser revertida pela adição de substrato em excesso 
· enzima não altera o Km 
Regulação da Atividade Enzimática
Algumas enzimas com funções reguladoras
especializadas respondem a: 
· efetores alostéricos 
· modificações covalentes
· possuem a velocidade de sua síntese alterada quando as condições fisiológicas são alteradas.
Sítios alostéricos de ligação 
· As enzimas alostéricas são reguladas por moléculas chamadas efetores (também chamados de modificadores ou moduladores)
· ligam-se de forma não-covalente a outro sítio que não o sítio catalítico
· Efetores negativos: inibem a atividade enzimática
· Efetores positivos: aumentam a atividade enzimática
Efetores homotrópicos
quando o substrato em si atua como efetor 
· normalmente são efetores positivos 
· Nesse caso, a presença de uma molécula de substrato em um sítio da enzima aumenta as propriedades catalíticas de outros sítios de ligação ao substrato → cooperatividade nos sítios
	Efetores heterotrópicos
	produto final da reação ou da via é o efetor 
· inibição por feedback
Modificação Covalente
Adição ou remoção de grupos fosfato de serina, treonina ou tirosina na enzima 
· A fosforilação de proteínas é reconhecida como uma das principais formas pelas quais os processos celulares são regulados
· Fosforilação é catalisada pelas proteínas quinases 
· Desfosforilação é catalisada pelas fosfoproteínas fosfatases 
· forma fosforilada pode ser mais ou menos ativa do que a não-fosforilada. ex: 
· fosforilação da glicogênio-fosforilase (enzima que degrada o glicogênio) aumenta sua atividade
· fosforilação da glicogênio-sintase (enzima que sintetiza o glicogênio) diminui sua atividade
Indução e repressão da síntese de enzimas
· as células também podem regular a quantidade de enzima presente - em geral alterando a velocidade da síntese da enzima
· O aumento (indução) ou a diminuição (repressão) da síntese da enzima leva a uma alteração na população total de sítios ativos.
· alteração lenta 
· As enzimas sujeitas à regulação da síntese em geral são aquelas que são necessárias apenas em um estágio do desenvolvimento ou em condições fisiológicas especiais
· ex: insulina 
Enzimas no Diagnóstico Clínico
alterações dos níveis plasmáticos de enzimas em doenças 
· Muitas doenças que causam lesão tecidual resultam no aumento da liberação das enzimas intracelulares no plasma.
· Doenças: do coração, do fígado, do músculo esquelético e de outros tecidos.
· Determinação do grau de aumento da atividade de uma determinada enzima no plasma é em geral útil para a avaliação do prognóstico do paciente
Enzimas plasmáticas 
· as enzimas alanina aminotransferase, gama-glutamiltransferase (GT/GGT) fosfatase alcalina são abundantes no fígado → lesão do tecido hepático
· a mioglobina é a primeira enzima indicativa de infarto (5 a 12h) → liberada após lesão isquêmica da fibra miocárdica
· alfa amilase indicativo de pancreatite aguda e úlcera perfurada
· aldolase → lesão muscular e lesão hepática
· colinesterase está diminuída em casos de intoxicação por organofosforados e carbamatos
· serpinas são inibidores de serino-proteases 
· obs: troponina T troponina I → liberadas em caso de dano cardíaco 
Isoenzimas
· também chamadas de isozimas 
· formas múltiplas de uma mesma enzima em tecidos diferentes
· São enzimas que catalisam a mesma reação mas diferem em suas propriedades físicas 
· sequência de aminoácidos diferentes
· CK e LDH → infarto do miocárdio
CK - creatina
· creatina-cinase
· ocorre como três isoenzimas:
· CK1 = BB 
· CK2 = MB 
· CK3 = MM 
· músculo miocárdio é o único que contém isoenzima CK2 → diagnóstico praticamente específico para infarto 
· 4 a 8 horas depois da dor 
· considerado p/ diagn. tardio 
	LDH - lactato-desidrogenase
· também aumentado em infarto do miocárdio
· aparece 36 a 40h depois 
· melhor diagnóstico com paciente tardiamente admitidos